壳寡糖的免疫佐剂效果及作为减毒活菌载体疫苗佐剂的可行性探索

摘要

目的 探究壳寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）的免疫佐剂效果，包括免疫激活作用和引发溶酶体逃逸作用，并探索其是否可以作为减毒活菌载体疫苗佐剂。方法 (1)以0（对照组）、0.1～4 mg/mL COS培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞24 h，利用CCK8实验检测细胞活力的影响；以0（对照组）、1、2、4 mg/mL COS干预小鼠RAW264.7细胞24 h，通过RT-qPCR实验检测细胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β、TLR-4的mRNA表达水平。(2)RAW264.7细胞加入1 mL含有不同组分[钙黄绿素（Calcein）50μg/mL,COS 2 mg/mL，阻断剂bafilomycin A1 1μmol/mL]的PBS培养，分组为Calcein组、Calcein+COS组、Calcein+COS+Bafilomycin A1组。通过激光共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞在有或无COS干预下对荧光染料Calcein的吞噬和胞内荧光分布情况，判断COS是否能够引发溶酶体逃逸。(3)用0.5、1、2、4、8 mg/mL COS包被减毒李斯特菌载体宫颈癌治疗性疫苗候选株LM?E6E7和LI?E6E7，测定Zeta电位变化，选择COS成功包被细菌的质量浓度。检测2 mg/mL COS包被LM?E6E7和LI?E6E7前后，RAW264.7细胞对疫苗菌株的吞噬率。结果 (1)CCK8结果显示，与对照组相比，不同质量浓度COS干预RAW264.7细胞24 h后，对细胞无毒性，并能够促进细胞增殖，差异有统计学意义（P<0.05）;RT-qPCR结果表明，与对照组相比，COS干预能够上调RAW264.7细胞TLR-4和IFN-γ的mRNA水平，同时抑制TGF-β和IL-10的mRNA表达水平，以4 mg/mL COS组最为明显（P<0.05）。(2)激光共聚焦显微镜发现在COS干预下，Calcein+COS组比Calcein组有更多的荧光染料从溶酶体内释放进入胞内，而这个过程可以被bafilomycin A1阻断。(3)Zeta电位结果表明COS质量浓度达到2 mg/mL时，能成功包被到细菌表面。疫苗株被COS包被前、后，RAW264.7细胞对LM?E6E7的吞噬率分别为5.70%和22.00%，差异有统计学意义（P<0.05）;RAW264.7细胞对LI?E6E7的吞噬率分别为1.55%和6.12%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 COS具有激活巨噬细胞免疫应答和引发溶酶体内物质逃逸溶酶体的作用，包被减毒活菌载体疫苗候选菌株可促进巨噬细胞对细菌的吞噬，可望进一步开发作为细菌载体类疫苗佐剂。

关键词

壳寡糖 / 巨噬细胞 / 李斯特菌 / 逃逸溶酶体

基金资助

国家自然科学基金面上项目（No.31570924）;; 成都市科技局重点研发支撑计划技术创新研发项目（No.2018-YF05-00292-SN）资助