工程化细菌膜仿生纳米药物递送系统的建立及在脑胶质瘤治疗中的作用研究

摘要

目的 制备工程化细菌膜仿生纳米粒Angiopep-2 E. coli membrane (ANG-2 EM)@PDA-PEI-CpG（简称ANG-2 EM@PPC），实现药物高效地靶向输送，治疗脑胶质瘤。方法 利用实验室构建inaX-N-angiopep-2工程菌表达，溶菌酶处理超滤离心获得ANG-2 EM；采用超声法包覆细菌膜制备ANG-2 EM@PPC;Western blot、琼脂糖凝胶电泳、透射电子显微镜（TEM）验证制备情况；检测粒径和Zeta电位以考察ANG-2 EM@PPC的稳定性。细胞水平研究：CCK-8法考察ANG-2 EM@PPC的对中性粒细胞存活率的影响。设计并构建流动腔模型，流式细胞术测定中性粒细胞的摄取效率，以考察在炎症环境下ANG-2 EM@PPC搭中性粒细胞便车的效率。荧光显微镜表征中性粒细胞死亡方式，Western blot和流式细胞术考察中性粒细胞凋亡小体的产生。动物水平研究：颅内注射小鼠胶质瘤-荧光素酶标记（GL261-Luc）细胞，建立原位脑胶质瘤小鼠模型，并验证小鼠肿瘤组织炎性环境。将肿瘤模型小鼠分为3组（均n=3），分别尾静脉注射DiR、ANG-2EM@PDA-PEI-CpG、EM@PDA-PEI-CpG（均10 mg/kg），荧光图像检测3种制剂在体内和脑内的分布情况；肿瘤模型小鼠分为6组（均n=4），分别尾静脉注射PBS、PDA、PC、PPC、EM@PPC、ANG-2 EM@PPC（均10 mg/kg），活体成像观察肿瘤消退状况并检测小鼠生存率、体质量以评价体内药效学，TUNEL染色（脑组织）、HE染色（脑、心、肝、脾、肺、肾组织）评价治疗效果。结果 TEM结果显示成功制备工程化细菌膜仿生纳米粒，PPC具有明显的壳核结构，壳厚约8.2 nm。由于ANG-2EM的包覆，ANG-2 EM@PPC的壳厚度增加到约9.6 nm且其表面有1层边界明显的细菌膜覆盖。放置1周内，稳定性良好。细胞实验中，CCK-8法示，ANG-2 EM@PPC对中性粒细胞的活力没有明显的影响。流式细胞术检测示，ANG-2EM@PPC在激活中性粒细胞中的摄取增强，在静止状态下搭中性粒细胞便车的效率比流动条件下高；与EM@PPC组相比，ANG-2 EM@PPC组搭中性粒细胞便车的效率增高（摄取效率24.9%vs. 31.1%）。荧光显微镜示，ANG-2 EM@PPC改变中性粒细胞死亡途径，从中性粒细胞胞外捕获网相关死亡（neutrophil extracellular traps-osis, NETosis）向凋亡转变；Western blot证实中性粒细胞凋亡小体的产生，流式细胞术结果显示其产生比例高达77.7%。动物实验中，DiR组、EM@PPC组、ANG-2 EM@PPC组制剂在脏器（心、肝、脾、肺、肾）中分布没有明显差别（P>0.05），但在脑组织中，EM@PPC组、ANG-2EM@PPC组高于DiR组（P<0.05）,ANG-2 EM@PPC可以穿过血脑屏障到达脑实质，对脑部肿瘤处的中性粒细胞有很高的亲和力，并可以被其内化。与PBS、PDA、PC、PPC组相比，EM@PPC组生存率和小鼠体质量改善，肿瘤荧光强度减弱，凋亡细胞增加，ANG-2 EM@PPC组上述趋势更明显；各组HE染色均未见异常。结论 成功制备了具有炎症响应特性的ANG-2 EM@PPC纳米递送系统，该系统能跨越血脑屏障靶向聚集于肿瘤炎症微环境，提高抗胶质瘤疗效。该研究为胶质瘤治疗提供新的给药策略，也为其他中枢神经系统疾病的非侵入性炎症微环境靶向药物递送提供新的思路。

关键词

中性粒细胞 / 脑胶质瘤 / 炎症 / 血脑屏障 / 工程化细菌膜

基金资助

中原学者工作站项目（No.234400510005）资助