脆性X智力障碍蛋白靶向DDX5调控Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞上皮-间质转化发生

摘要

目的 探讨脆性X智力障碍蛋白（fragile X mental retardation protein, FMRP）促进乳腺癌细胞迁移、上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）发生及其可能的作用机制。方法 采用RT-PCR、Western blot方法，分析FMRP在正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）和4种乳腺癌细胞系（MCF-7、BT474、MDA-MB-231、HCC1937）中mRNA和蛋白表达，免疫组化染色检测FMRP在乳腺癌组织中的表达；GEO数据库分析FMRP基因在乳腺癌中的表达及与临床预后的关系；采用慢病毒感染和siRNA干扰技术分别构建FMRP过表达及干扰载体，转染人乳腺癌细胞系MCF-7，设置对照组（Control）、干扰空载体组（NC）、敲低载体组（si FMRP）以及过表达空载体组（Lv-NC）、过表达载体组（Lv-FMRP）；划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，Western blot检测各组细胞中EMT标志物[上皮标志物E-cadherin，间质标志物N-cadherin、vimentin、ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)、Slug(snail family zinc finger 2)]表达；免疫共沉淀联合质谱分析（IP-MS）验证FMRP与DEAD box RNA解旋酶-5(DEAD-box helicase5, DDX5)蛋白的互作关系，利用蛋白合成抑制剂放线菌酮（cycloheximide, CHX）、蛋白酶体抑制剂MG132检测FMRP对DDX5蛋白表达的调控作用；同时转染si DDX5载体，观察DDX5是否可以逆转FMRP过表达对细胞迁移、EMT的影响；采用免疫荧光染色检测β-catenin的定位及表达，Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路核心标志物蛋白表达。结果 FMRP在乳腺癌组织及细胞中呈高表达（P<0.05）,FMRP高表达组总生存和无进展生存低于FMRP低表达组（P<0.05）；敲低FMRP后MCF-7细胞迁移能力减弱，过表达FMRP促进细胞迁移（P<0.05）；敲低FMRP后E-cadherin表达升高，N-cadherin、vimentin、ZEB1、Slug表达降低，抑制EMT发生，而过表达FMRP则促进EMT进程（P<0.05）;FMRP与DDX5蛋白互作，且通过阻断泛素-蛋白酶体途径促进DDX5蛋白稳定性；敲低DDX5逆转FMRP过表达对细胞迁移及EMT的促进作用（P<0.05），且有效抑制β-catenin核转位，降低β-catenin核分布；进一步发现DDX5下调后p-β-catenin、GSK3β、Axin2蛋白表达升高，C-myc蛋白表达降低（P<0.05），而联合FMRP过表达逆转上述蛋白的表达（P<0.05）。结论 FMRP靶向DDX5通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞迁移和EMT进程。

关键词

脆性X智力障碍蛋白 / DEAD box RNA解旋酶-5 / 上皮-间质转化 / Wnt/β-catenin信号通路