异长叶烯通过减少肠上皮细胞凋亡改善小鼠克罗恩病样结肠炎

摘要

目的 探究异长叶烯（isolongifolene, ISO）对肠上皮细胞凋亡和2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠克罗恩病（Crohn's disease, CD）样结肠炎的作用及分子机制。方法 动物实验：将小鼠随机分为Wild type(WT)组、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS）组和TNBS+ISO组，每组8只。TNBS组及TNBS+ISO组小鼠经直肠灌注TNBS构建结肠炎模型，TNBS+ISO组小鼠在造模后予ISO灌胃（10 mg/kg）干预，其余两组予等量生理盐水灌胃，第7天处死小鼠。检测小鼠体质量变化、疾病活动评分（disease activity index, DAI）、结肠长度，进行结肠组织跨上皮电阻（TEER）检测，根据HE染色计算结肠炎症程度评分，RT-PCR和ELISA法检测肠黏膜炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素（IL）-1β和IL-6]水平，TUNEL染色检测小鼠结肠组织细胞凋亡，Western blot和免疫荧光检测其凋亡蛋白（cleaved caspase-3/caspase-3和Bax）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）和紧密连接蛋白（ZO-1和claudin-1）表达。细胞实验：TNF-α诱导肠上皮细胞Caco-2凋亡模型，进行ISO治疗，再加入AMPK抑制剂Compound C干预。TUNEL染色、Western blot和免疫荧光检测同前。基因功能注释（Gene Ontology, GO）富集预测ISO的生物学功能。然后用小鼠和Caco-2细胞进行机制验证：Western blot检测各组小鼠结肠组织及Caco-2细胞中p-AMPK/AMPK和p-PGC1α表达水平，TUNEL染色检测细胞凋亡。结果 动物实验结果显示，ISO能缓解实验性结肠炎和肠屏障功能障碍，表现为小鼠体质量降低（P<0.05）、结肠长度缩短（P<0.05）,DAI评分（P<0.05）、炎症程度评分（P<0.05）、TEER值（P<0.05）改善，结肠组织中促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6）(P<0.05)、紧密连接蛋白[ZO-1(P<0.05)和claudin-1(P<0.05)]的表达改善。细胞实验中，在TNF-α诱导的肠上皮细胞模型中也发现ISO能保护肠屏障受损。ISO减少肠上皮细胞的凋亡率（P<0.05）、cleaved caspase-3/caspase-3(P<0.05)和Bax(P<0.05)的表达，且上调Bcl-2(P<0.05)的水平。GO富集预测分析显示，ISO改善CD样肠炎可能与负向调控细胞凋亡有关。机制验证发现，p-AMPK和p-PGC1α在ISO治疗后的小鼠结肠组织和Caco-2细胞表达明显上调（P<0.05），而Compound C则升高了ISO治疗的Caco-2细胞的凋亡率（P<0.05）以及降低ZO-1、claudin-1的相对表达量（P<0.05）。结论 ISO至少部分通过激活AMPK/PGC1α信号通路减少肠上皮细胞凋亡，从而缓解TNBS诱导的小鼠肠屏障功能障碍和CD样结肠炎。

关键词

克罗恩病 / 异长叶烯 / 肠上皮细胞凋亡 / 肠屏障 / AMPK/PGC1α

基金资助

安徽省高校优秀科研创新团队项目（No.2023AH010067）;; 蚌埠医学院重大科技项目孵育计划（No.2020byfy003）资助