Fibulin-3调控组织金属蛋白酶抑制因子-3影响椎间盘髓核细胞衰老的机制研究

摘要

目的 探讨fibulin-3通过调控组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3, TIMP-3)表达而影响椎间盘髓核细胞衰老的分子机制。方法 (1)收集37例椎间盘术后患者的髓核组织及影像学资料，按照Pfirrmann分级评估椎间盘的退变程度，衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）染色法确定髓核细胞的衰老程度，Western blot和ELISA检测fibulin-3蛋白水平，探讨fibulin-3与椎间盘退变和髓核细胞衰老之间的关系；(2)体外培养人椎间盘髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs），观察连续传代过程中NPCs的增殖（CCK8法）和衰老（SA-β-gal染色法）情况，检测fibulin-3的表达水平以及促炎症因子和基质蛋白酶的表达情况。通过添加外源性fibulin-3验证其对NPCs增殖和衰老的影响；(3)通过基因过表达技术验证fibulin-3对NPCs凋亡和增殖的作用，结合凋亡抑制剂进行双向验证；(4)利用生物信息学分析fibulin-3与TIMP家族的关系，通过过表达fibulin-3并沉默TIMP-3基因的实验，验证其在NPCs衰老中的作用。结果 (1)在37例患者的椎间盘退变样本中，按Pfirrmann分级，退变等级越高，fibulin-3的表达越低。Spearman相关性分析显示椎间盘分级与NPCs的衰老等级负相关（r=-0.87, P<0.001），与fibulin-3的表达量负相关（r=-0.79, P<0.001）；(2)随着NPCs传代次数增加，fibulin-3的表达逐渐降低，细胞增殖能力减弱，促炎症因子和基质蛋白酶的表达增高。添加外源性fibulin-3后，细胞形态和生长状态得到保持，细胞衰老显著抑制，促炎症因子和基质蛋白酶的表达明显降低；(3)基因过表达实验显示，fibulin-3减少了NPCs的凋亡，促进了细胞增殖，从而抑制了NPCs的衰老；(4)生物信息学分析显示fibulin-3与TIMP家族的TIMP-3存在显著关联。进一步实验验证发现，过表达fibulin-3能够增强TIMP-3的表达，而沉默TIMP-3基因后，fibulin-3对NPCs衰老的抑制作用显著减弱。这表明fibulin-3通过调控TIMP-3来抑制基质金属蛋白酶活性，影响细胞外基质的合成和降解，最终抑制髓核细胞的衰老。结论 本研究表明，fibulin-3通过调控TIMP-3在椎间盘髓核细胞衰老过程中发挥重要作用。具体机制包括：fibulin-3上调TIMP-3的表达，抑制基质金属蛋白酶活性，减少细胞外基质的降解，从而促进细胞外基质的合成；此外，fibulin-3通过减少细胞凋亡和促进细胞增殖，进一步抑制髓核细胞的衰老。因此，fibulin-3和TIMP-3在维持椎间盘健康和延缓退变过程中具有潜在的治疗意义。

关键词

Fibulin-3 / 髓核细胞 / 椎间盘退变 / 组织金属蛋白酶抑制因子-3

基金资助

河南省中医药科学研究专项课题（No.2019ZY1032）;; 2023洛阳市社会发展类公益专项（No.2302020A）资助