羽扇豆醇通过SIRT3/mTOR通路调节自噬以改善骨关节炎软骨细胞衰老

摘要

目的 探讨羽扇豆醇（Lupeol）通过去乙酰化酶3(sirtuin 3,SIRT3）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase,mTOR）通路调控自噬在骨关节炎（osteoarthritis,OA）软骨细胞衰老中的作用机制。方法 分离原代小鼠膝关节软骨细胞，分为对照组，Lupeol(2.5、5、10、20、40μmol/L）组，50μmol/L叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,TBHP）组，TBHP+Lupeol组，TBHP+Lupeol+氯喹（chloroquine,CQ；自噬抑制剂，20μmol/L）组，TBHP+Lupeol+si-NC组，TBHP+Lupeol+si-SIRT3组。利用CCK-8、DCFH-DA探针、流式细胞术检测细胞增殖、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平、细胞凋亡；利用β-gal染色评估细胞衰老；利用Western blot检测SIRT3、mTOR、衰老标志蛋白（p21和p16）、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解相关蛋白（aggrecan、collagenⅡ、ADAMTS5、MMP13）以及自噬相关蛋白（LC3BⅠ、LC3BⅡ、P62）的表达；利用RT-qPCR检测衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP；包括IL-6、Cxcl10、MCP1、MMP3）的mRNA水平；利用免疫荧光检测LC3斑点；利用透射电镜观察自噬小体。将30只C57BL/6雄性野生型小鼠分为（n=10):Sham组、OA组、OA+Lupeol[50 mg/(kg·d)，灌胃给药]组，利用番红O-固绿染色评估软骨损伤程度。结果 根据细胞活力测定结果，Lupeol的最佳处理浓度和时间选择为20μmol/L和24 h。与TBHP组相比，TBHP+Lupeol组细胞活力升高（P<0.05);ROS产生、β-gal阳性细胞比例、p21和p16蛋白表达水平以及SASP mRNA水平降低（P<0.05);aggrecan和collagenⅡ蛋白水平升高、ADAMTS5和MMP13蛋白水平降低（P<0.05）；细胞凋亡减少（P<0.05);P62蛋白水平降低、LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值升高、LC3B荧光斑点强度以及自噬小体数量增加（P<0.05);SIRT3表达水平升高、mTOR磷酸化水平降低（P<0.05）。CQ处理有效废除Lupeol对细胞活力和自噬的促进作用，对ROS水平、细胞衰老、ECM降解、细胞凋亡的抑制作用（P<0.05）。沉默SIRT3逆转Lupeol对mTOR磷酸化水平的抑制作用和对自噬的促进作用（P<0.05）。在体内，与OA组相比，OA+Lupeol组软骨变性减少、国际骨关节炎研究协会评分降低（P<0.05);SIRT3表达水平上调、mTOR磷酸化水平降低、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高、MMP13蛋白水平以及SASP mRNA水平降低（P<0.05）。结论 羽扇豆醇通过SIRT3/mTOR通路调节软骨细胞自噬以改善OA软骨细胞衰老。

关键词

羽扇豆醇 / SIRT3/mTOR通路 / 自噬 / 衰老 / 软骨细胞