基于纳米抗体的靶向Trop2 CAR-T细胞的制备及其抗非小细胞肺癌的研究

摘要

目的 研究使用基于滋养层细胞表面抗原2（trophoblast cell-surface antigen 2,Trop2）纳米抗体构建的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）T（CAR-T）细胞是否可用于治疗Trop2阳性的非小细胞肺癌。方法 构建Trop2特异性噬菌体展示纳米抗体文库，用于筛选Trop2特异性纳米抗体。利用间接ELISA检测Trop2的3种（8^#、14^#和48^#）纳米抗体结合抗原的能力，并通过表面等离子共振测定纳米抗体的亲和力。基于Trop2特异性纳米抗体构建CAR-T，将其与表达萤光素酶的Trop2阳性细胞系NCI-H292以及Trop2阴性细胞系A549细胞共培养，通过多功能酶标仪读取效靶比分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2的萤光素酶值以测定杀伤效率，利用ELISA方法检测效靶比为4∶1的上清中白细胞介素（interleukin,IL）-2、干扰素γ（interferon γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）细胞因子的水平。本研究还在NCG免疫缺陷小鼠中建立NCI-H292异种移植模型，分为空白组（PBS组）、Mock-T组和Trop2 CAR-T组（n=5），通过尾静脉输注1×10～7个Trop2 CAR-T细胞。实验期间每日观察小鼠生长状态和存活情况，每3 d测量一次肿瘤大小并分析生存期。结果 通过纳米抗体文库成功筛选到Trop2特异性纳米抗体，利用间接ELISA初步测定48#纳米抗体的亲和力最强。随后，通过表面等离子共振测定48^#纳米抗体的亲和力在2.49×10^-8 M数量级，属于高亲和力抗体，并基于该纳米抗体成功制备Trop2 CAR-T细胞。体外实验结果表明，Trop2 CAR-T细胞以剂量依赖性方式杀死Trop2阳性的NCI-H292非小细胞肺癌细胞。通过ELISA检测发现，共培养体系中的细胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF-α）分泌明显增加，进一步验证了其抗肿瘤活性。在NCI-H292异种移植小鼠模型中，与PBS组和Mock-T组相比，Trop2 CAR-T组肿瘤体积缩小（P<0.001），荷瘤小鼠生存期延长（P<0.05）。结论 本研究结果证实基于Trop2纳米抗体构建的CAR-T细胞可有效治疗Trop2阳性的非小细胞肺癌。

关键词

滋养层细胞表面抗原2 / 非小细胞肺癌 / 嵌合抗原受体