重组酶聚合酶扩增和CRISPR/Cas12a蛋白一步法检测人乙型流感病毒

摘要

目的 建立基于重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）和CRISPR/Cas12a蛋白的一步检测法，实现对人乙型流感病毒即时灵敏的检测。方法 根据人乙型流感病毒（维多利亚系）保守基因（NS1基因）设计RPA扩增引物，首先以标准质粒为模板建立反应体系，在37℃条件下孵育15 min进行RPA扩增；通过瞬时离心将管盖上的CRISPR/Cas12a体系与管底的RPA扩增产物充分混匀，在37℃进行实时荧光检测。对反应条件进行优化，建立人乙型流感病毒RPA-CRISPR/Cas12a一步检测法；以标准质粒和假病毒为模板，评价方法灵敏度；以其他发热呼吸道症候群病毒为模板，评价方法特异度；通过对真实样本的检测，评价一步检测法与RT-qPCR检测结果的一致性。结果 成功建立基于RPACRIPSR/Cas12a的一步检测法，反应温度为37℃，Cas12a/crRNA浓度比例为1∶1,Cas12a浓度为120 nmol/L，单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)探针浓度为300 nmol/L，引物浓度为480 nmol/L时最佳，25 min可检测低至2.8copies/μL的标准质粒DNA,30 min可检测低至2.77 copies/μL的假病毒；特异性强，与新型冠状病毒、甲型流感病毒H1N1、呼吸道合胞病毒A型无交叉反应；检测真实样本的灵敏度为93.33%，特异性为100%，与RT-qPCR检测结果一致率为97.14%。结论 本研究建立的基于RPA-CRISPR/Cas12a的一步检测法，30 min即可完成人乙型流感病毒真实样本核酸释放、逆转录、等温扩增、CRISPR/Cas12a系统切割并输出荧光信号的完整检测流程，具有较高灵敏度和特异性，并成功应用于临床样本，在实现病毒即时检测方面具有良好的应用前景。

关键词

重组酶聚合酶扩增 / CRISPR-Cas系统 / 人乙型流感病毒 / 荧光测定