AKT1/AMPK通路在白内障患者晶状体上皮细胞氧化应激中的调控作用_

摘要

目的 明确丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase, AKT）1在年龄相关性白内障（agerelatedcataract, ARC）患者晶状体上皮中的调控作用及相关分子机制。方法 （1）通过生物信息学分析筛选ARC差异基因（Genecard和GEO数据库GSE213546），结合功能富集分析（KEGG、GO）鉴定关键基因。（2）以200μmol/L H2O2处理HLEB3细胞24 h，构建H₂O₂诱导的晶状体上皮细胞氧化应激模型，RT-qPCR以及Western blot检测AKT1的基因和蛋白表达变化。（3）取模型细胞，随机分为si-NC组、si-AKT1组（3个平行组），分别加入si-NC质粒、3种si-AKT1质粒；再设control+siNC组，以si-NC空质粒转染未经H2O2处理的HLE-B3细胞。RT-qPCR、Western blot检测si-NC组、si-AKT1组AKT1的基因和蛋白表达水平，筛选表达变化最明显的两个si-AKT1平行组，再进行后续实验。Western blot检测si-NC组、两个si-AKT1平行组、control+si-NC组AMPK、AMPK磷酸化的蛋白表达水平，挑选p-AMPK/AMPK值变化明显的一个si-AKT1平行组加入AMPK激动剂Acadesine（AICAR），验证AMPK通路的作用。Western blot检测si-NC组、control+si-NC组、si-AKT1组加入AICAR前后的Bcl-2、Bax蛋白表达水平，流式细胞术检测细胞凋亡水平和活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，ELISA试剂盒检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、还原性谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平。结果 （1）生物信息学筛选出78个差异基因，AKT1在ARC样本中显著高表达，差异有统计学意义（P<0.05），且富集于AMPK通路。（2）与未经H₂O₂处理的细胞相比，氧化应激模型细胞AKT1的mRNA及蛋白表达上调。（3）si-NC组p-AMPK/AMPK值高于control+si-NC组，而敲低AKT1能够抑制AMPK通路活性，各si-AKT1组较si-NC组的pAMPK/AMPK值下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与control+si-NC组相比，si-NC组ROS和MDA水平、细胞凋亡率升高，SOD和GSH水平降低，Bcl-2表达水平下调，同时Bax水平上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；与si-NC组相比，si-AKT1组上述指标均有改善，差异均有统计学意义（P<0.05）；在si-AKT1组，与加入AICAR前相比，加入AICAR后上述指标被拮抗，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 氧化应激相关基因AKT1可能是白内障的关键致病基因，且AKT1通过影响AMPK通路活性诱导晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡。

关键词

年龄相关性白内障 / 氧化应激 / 丝氨酸/苏氨酸激酶1 / 蛋白激酶