Caspase-8和SAA在稽留流产孕妇绒毛组织中的表达及意义

Expression and significance of Caspase-8 and SAA in villi of pregnant women with missed abortion

摘要

目的 探讨天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8（cysteinyl aspartate-specific proteinase-8，Caspase-8）和血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）在稽留流产与正常早孕患者绒毛组织中的表达差异。 方法 通过免疫组化法（immuno- histochemistry， IHC）检测33例对照组（正常早孕要求终止妇女）及54例试验组（稽留流产患者）绒毛组织中Caspase-8和SAA的表达情况，并比较其表达差异。 结果 Caspase-8和SAA在绒毛及蜕膜组织中均有表达，稽留流产组Caspase-8（χ² =19.837，P<0.001）和SAA （χ² =12.249，P<0.001）的表达明显高于对照组，且两者的表达差异均有统计学意义。 结论 稽留流产患者绒毛组织中Caspase-8和SAA的高表达，提示其可能参与稽留流产的发生。

Abstract

Objective To investigate the differences in the expression of cysteinyl aspartate-specific proteinase-8 （Caspase-8） and serum amyloid A （SAA） in the villi of patients with induced abortion and normal early pregnancy. Methods The expression of Caspase-8 and SAA in the chorionic tissue of 33 women with normal early pregnancies requiring termination and 54 patients with induced abortion was detected by immuno-histochemistry （IHC）， and the positive expression was calculated. Results Caspase-8 and SAA were expressed in both villi and decidua.The expression of Caspase-8 （χ² =19.837， P<0.001） and SAA （χ² =12.249， P<0.001） in the group with induced abortion was significantly higher than that in the control group， and the difference in the expression of both was statistically significant. Conclusion The high expression of Caspase-8 and SAA in the chorionic tissue of patients with induced abortion suggests that it may be one of the possible reasons for the occurrence of induced abortion.

Graphical abstract

关键词

稽留流产 / 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8 / 血清淀粉样蛋白A

Key words

Retention and abortion / Cysteine aspartate proteolytic enzyme-8 / Serum amyloid

稽留流产（missed abortion，MA）又称为过期流产，指宫内的胚胎或胎儿已死亡，但滞留在宫腔内未能及时自然排出者^［1］。它是一种特殊形式的自然流产，也是临床常见妊娠并发症^［2］，严重威胁女性生育力和身心健康。MA的病因极其复杂，通常认为与遗传学因素、环境因素、免疫因素及子宫畸形等子宫结构异常等有关，但仍有部分患者流产原因不明。目前，MA发病机制的相关研究较少，有研究^［3］表明其可能与细胞的增殖失衡及细胞的过度凋亡有关。另一项相关的研究^［4］发现，凋亡抑制基因在发生流产的组织中会呈现出低表达状态，而凋亡基因会呈现出高表达状态，妊娠组织发生过度凋亡后可能会导致绒毛的生长受阻，蜕膜的变性坏死，进而会引起胎盘的正常功能无法发挥，阻碍孕卵的发育，导致流产的发生。在复杂的生理妊娠过程中，为了确保妊娠能够正常进行，母胎界面发挥了很大的作用^［5］，在母胎界面上，胚胎来源的妊娠滋养细胞容易受到多种因素的影响来调控其增殖、分化、侵袭等。基于此，探究不明原因流产的发病机制，开发新的治疗手段是目前生殖健康领域亟待解决的重大问题。

血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）是一种主要在肝脏合成的蛋白，其肝外来源包括白细胞、脂肪细胞、滑膜细胞、肿瘤细胞和孕早期滋养层细胞（胎盘的绒毛和绒毛外滋养细胞、羊膜上皮细胞和成纤维细胞、胎膜的绒毛膜滋养细胞、蜕膜细胞和子宫肌层细胞）^［6］ 。在正常妊娠过程中SAA可激活Toll样受体，使母胎界面之间的抗炎因子与促炎因子处于一种平衡状态，从而使妊娠滋养细胞能够正常侵入子宫蜕膜。此外，有研究^［7］发现SAA可以刺激肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血清IL-6及IL-8等炎症因子的表达，这些因子在维持胎儿和母体免疫系统之间的稳态方面又起着重要作用。如果这种精细的平衡被打破，免疫调节机制可能难以维持体内的稳态，这就可能导致妊娠失败而引起MA的发生。Caspase（cysteinyl aspartate-specific proteases）家族是一类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶^［8］，可利用自身的半胱氨酸残基来特异性地切割目标蛋白的天冬氨酸残基，在细胞凋亡、调控炎症反应等方面起重要作用，而Caspase-8作为一种凋亡因子，可调控滋养细胞等多种细胞的凋亡，有研究^［9］显示，Bcl-2和Bax在组织中的表达失衡，会激活以酶原形成存在的Caspase-8，被激活后的Caspase-8启动级联反应激活下游的Caspase，诱导Bax介导的细胞凋亡的发生，从而可能导致不育或自然流产。

有研究^［10-11］表明，Caspase-8及SAA对滋养细胞的侵袭有重要作用。本研究拟采用免疫组化的方法分析MA组和正常早孕组孕妇流产组织中Caspase-8和SAA的表达差异及其相关性，为挖掘MA新的致病机制，开发新的治疗手段提供临床数据支撑。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

选择2022年7月至2023年12月就诊于延安大学附属医院产科的54例MA及33例正常早孕要求终止孕妇样本，两组孕妇年龄均在18~45岁之间，妊娠天数均在42~84 d。纳入标准：患者有停经史，停经周数与子宫的大小不符合，实验室检查显示血HCG及孕酮值偏低，B超检查提示妊娠囊内无胚芽，妊娠囊内有胎芽但无原始心管搏动或开始有心管搏动再次就诊时搏动消失。排除标准：生殖系统发育异常；阴道感染；口服过保胎药；肿瘤病史；妊娠并发症，如糖尿病、高血压等。

本研究经延安大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

① 试验组和对照组均在清宫术后收集绒毛及蜕膜组织，经过清洗、固定、脱水和浸蜡，最后完成石蜡包埋。② 将石蜡包埋组织标本切片后依次经过烤片、脱蜡、脱水、PBS冲洗（每次3 min，共3次）和抗原修复。③ 滴加由艾比玛特医药科技公司购买的一抗（鼠/兔抗人Caspase-8抗体及鼠/兔抗人SAA抗体）：用1%高碘酸灭活内源性酶，滴加适当稀释的一抗（Caspase-8、SAA），4 ℃过夜。④ 滴加二抗：再滴加50~100 μL抗兔IgG抗体-HRP 多聚体37℃孵育30 min，再滴加DAB显色液显色，经过苏木精复染、脱水、透明和封片等处理。⑤ 显微镜下观察Caspase-8、SAA的染色情况。

1.3 结果判断（半定量计算方法）

由3名高级职称的专家共同评估，光学显微镜下观察切片的胞浆中出现黄色、棕黄色或者棕褐色颗粒沉着。每张切片选取4个角及中间5个高倍镜下视野（400倍），根据细胞的着色程度及着色百分率进行计分，并计算出5个视野下的每张切片的平均着色程度及着色百分率，最后将两者的平均分相乘得到最终得分：强阳性（4~6分），阳性（2~3分），阴性（≤1分）。着色程度计分：按细胞内着色强度，棕褐色、棕黄色、黄色、无色，分别记为3分、2分、1分、0分。着色细胞百分率计分：按光学显微镜下视野内着色细胞占总细胞数的百分比来计分，≥51％记为3分，26％~50％记为2分，6％~25％记为1分，≤5％记为0分^［12］。

1.4 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计学数据分析，计量资料均进行正态性检验及方差齐性检验，满足正态分布和方差齐性的计量资料，采用（\overline{x}\pms）来表示，同时采用两独立样本t检验来进行组间比较。计数资料采用（%）表示，用Pearson卡方检验进行组间比较。α=0.05作为检验水准，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 研究结果

2.1 Caspase-8在绒毛及蜕膜组织中的表达

通过综合评分，比较试验组（MA组）与对照组（正常早孕要求终止组）Caspase-8的表达水平，结果显示，试验组Caspase-8的阳性表达率显著高于对照组，且差异有统计学意义（P<0.01），因此认为Caspase-8是MA的相关影响因素（表1、图1）。

2.2 SAA在绒毛及蜕膜组织中的表达

试验组SAA表达水平（MA组）与对照组（正常早孕要求终止组）相比较，试验组中SAA的阳性表达（28例）明显多于对照组（4例）（图2，P<0.01），也可认为SAA是MA的相关影响因素（表2）。

3 讨论

MA是自然流产的一种特殊形式，其发病机制复杂，且临床诊断困难，甚至会因为延误治疗而引起严重的并发症，因此迫切需要寻找新的生物学标志物来诊断或预测其发生。Caspase-8和SAA在MA的预测方面表现出较好的潜力。

SAA作为一种免疫性调节蛋白，主要参与急性期反应^［4］。SAA在早孕期的人胎盘组织中表达量很低，高峰期会出现在妊娠第10~12周，但是在孕晚期的时候SAA的表达量又会降低至早孕期的水平，并且在妊娠的不同孕周之间无差异^［13］。有研究表明，低浓度的SAA可通过调节胎盘微环境中滋养细胞的侵袭和基质金属蛋白酶的活性，并在胎盘形成和胎盘稳态中发挥重要作用，高水平的SAA作用正好相反^［7］。Caspase-8是死亡受体通路启动的关键因素，是死亡受体通路的“门控”，通过与死亡诱导信号复合物结合，自身被降解而激活，激活的Caspase-8可激活Caspase的级联反应诱导细胞凋亡^［14］。此外，Caspase-8不仅在细胞凋亡中发挥作用，其在T淋巴细胞活化，胚胎的发育中也起关键调控作用。在生理条件下，Caspase-8可以抑制RIPK3的活化来阻止坏死的发生，进而保护胚胎正常发育^［15］，一项关于小鼠的研究^［16］发现，Caspase-8缺陷的小鼠会出现胚胎死亡，而敲除RIPK3则可逆转这种致死性的胚胎死亡。也有研究^［17］证明，因不正常的程序性坏死以及因细胞凋亡而引起的胚胎死亡还可以通过Caspase-8切割RIPK1来阻止，从而保护胚胎的良好发育。这表明，为保证胚胎的顺利生长，确保小鼠的胚胎不因为过度的凋亡和坏死可以通过Caspase-8的酶活性特异性切割RIPK1来实现。有研究^［11］利用免疫组织化学染色和原位杂交发现，孕早期绒毛滋养细胞可以表达SAA，低浓度的SAA可调节基质金属蛋白酶的活性及滋养层细胞的迁徙，对胎盘的形成及内稳态的维持有着重要意义；而SAA水平升高则可显著干扰其生理功能，包括滋养层细胞侵入子宫蜕膜的过程异常，从而可能导致不育或自然流产。

本研究收集了延安大学附属医院87例正常早孕要求终止及MA患者清宫后的流产物组织，通过免疫组化法检测MA组和对照组绒毛及蜕膜组织中Caspase-8、SAA表达，结果显示其主要表达于胞浆中，染色呈黄色、棕黄色或者棕褐色，细胞核偶有着色。相对于正常早孕组，MA患者绒毛及蜕膜组织中Caspase-8及SAA的表达明显升高。由此推测，MA组Caspase-8及SAA的高表达可能破坏了绒毛及蜕膜组织的稳态调节，导致胎盘在植入过程中发生异常，甚至发生了细胞的凋亡，母胎之间的界面平衡被打破，胚胎生长发育得不到绒毛及蜕膜组织的支持，最终可能导致MA的发生。

本研究虽发现MA患者中二者均呈高表达，但研究仍存在一定的局限性：仅进行临床方面研究，对MA的机制探究不够深入，后续将扩大临床样本量并设计体内体外实验，从不同层面继续深入研究SAA、Caspase-8对MA的具体调控机制，以期为MA的早预防、早诊断和早治疗提供新的线索。

参考文献

[1] 谢幸，孔北华，段涛. 妇产科学［M］. 9版. 北京：人民卫生出版社，2018：70-73．

[2] 郑峥，顾向应，刘欣燕，等. 早期妊娠稽留流产治疗专家共识［J］. 中国实用妇科与产科杂志，2020，36（1）：70-73.

[3] MINAS V， JESCHKE U， KALANTARIDOU S N，et al. Abortion is associated with increased expression of FasL in decidual leukocytes and apoptosis of extravillous trophoblasts：A role for CRH and urocortin［J］. Molecular Human Reproduction，2007，13（9）：663-673.

[4] SANDRI S， URBAN BORBELY A， FERNANDES I，et al. Serum amyloid A in the placenta and its role in trophoblast invasion［J］. PLoS One，2014，9（3）：e90881.

[5] 许汴菊. HIF-1α和VEGF在稽留流产患者血清和绒毛中的表达及二者的相关性分析［D］. 延安：延安大学，2013.

[6] 槐以啟，年士艳，冯磊. 血清淀粉样蛋白A的临床运用新进展［J］. 分子诊断与治疗杂志，2022，14（6）：903-906.

[7] 曹英，刘春华，杨亚莉. 孕妇血清淀粉样蛋白A水平检测与早期原发性不明原因复发性流产的临床相关性研究［J］. 现代检验医学杂志，2017，32（6）：43-45.

[8] 邬皓晨，陈勇军，徐易尘，等. Caspase-1在炎症及程序性细胞死亡过程中的作用［J］. 中国细胞生物学学报，2011，33（2）：182-189.

[9] PANDEY M K， RANI R， AGRAWAL S. An update in recurrent spontaneous abortion［J］. Archives of Gynecology and Obstetrics，2005，272（2）：95-108.

[10] 徐佳，刘朵朵，马向东，等. 子痫前期患者胎盘组织p-p38与caspase-3、8的表达及临床意义［J］. 中国妇幼健康研究，2017，28（8）：961-964.

[11] IBRAHIM M I， RAMY A R， ABDELHAMID A S，et al. Maternal serum amyloid A level as a novel marker of primary unexplained recurrent early pregnancy loss［J］. International Journal of Gynecology & Obstetrics，2017，136（3）：298-303.

[12] 邢传平，刘斌，董亮. 免疫组织化学标记结果的判断方法［J］. 中华病理学杂志，2001，30（4）：318.

[13] ROSSMANN C， HAMMER A， KOYANI C N，et al. Expression of serum amyloid A4 in human trophoblast-like choriocarcinoma cell lines and human first trimester/term trophoblast cells［J］. Placenta，2014，35（8）：661-664.

[14] 卢美松，李萌，汤小晗，等. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在子宫内膜息肉中的表达及相关性研究［J］. 中国计划生育和妇产科，2018，10（1）：19-22.

[15] HÖCKENDORF U， YABAL M， HEROLD T，et al. RIPK3 restricts myeloid leukemogenesis by promoting cell death and differentiation of leukemia initiating cells［J］. Cancer Cell，2016，30（1）：75-91.

[16] TUMMERS B， GREEN D R. Caspase-8：Regulating life and death［J］. Immunological Reviews，2017，277（1）：76-89.

[17] LIN J， KUMARI S， KIM C，et al. RIPK1 counteracts ZBP1-mediated necroptosis to inhibit inflammation［J］. Nature，2016，540（7631）：124-128.

基金资助

陕西省教育厅专项科研计划项目(21JK0976)

陕西省延安市科技局项目(2022SLSFGG-021)

2023年延安市医学遗传与咨询服务科技创新团队

2020年延安市生殖医学重点实验室