间质性膀胱炎中性粒细胞胞外陷阱相关基因的鉴定及免疫相关策略

Identification of genes associated with extracellular traps in neutrophils in interstitial cystitis and immune-related strategies

摘要

目的 利用生物信息学分析方法筛选出中性粒细胞胞外陷阱相关基因（neutrophil extracellular trap-related genes，NRG）与间质性膀胱炎（interstitial cystitis，IC）的核心差异表达基因。 方法 从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus， GEO）中获取了IC患者的基因表达数据，并结合已发表文献中的NRG（differentially expressed NET-related genes， DE-NRG），筛选出12个差异表达的NRG。随后，采用最小绝对值收缩与选择算子（least absolute shrinkage and selection operator， LASSO）回归和随机森林（random forest， RF）两种机器学习方法，进一步确定核心DE-NRG。为了深入解析DE-NRG的功能，进行基因本体论（Gene Ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析，并通过STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction network， PPI）网络。此外，利用CIBERSORT算法对免疫细胞浸润情况进行分析。并绘制受试者工作曲线（receiver operating characteristic， ROC）、曲线下面积（the area under the curve，AUC）。免疫组化和Western blot法检测IC患者活检样本中DE-NRG的表达，免疫双荧光染色检测样本中NET的存在。 结果 筛选出12个DE-NRG。补体C3（complement C3，C3）、组织蛋白酶 G（cathepsin G，CTSG）和选择蛋白P（selectin P，SELP）与中性粒细胞外陷阱形成信号通路有关；PPI网络分析结果显示，基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）和CC族趋化因子配体5（CC chemokine ligand 5，CCL5）与其他蛋白互作关系最多；确定核心DE-NRG为C3和CTSG；免疫细胞在休眠期肥大细胞在IC发展过程中发挥着重要作用。外部数据集分析、免疫组化和Western blot实验发现CTSG在IC中高表达，C3在IC中低表达。免疫双荧光实验结果表示，NET的形成与IC的病理学过程密切相关。 结论 12个DE-NRG在IC发生发展中起重要作用，C3和CTSG作为IC中性粒细胞胞外陷阱相关的核心基因可能为IC的潜在生物标志物和治疗靶点。

Abstract

Objective Bioinformatics analysis methods were used to screen out the core differentially expressed genes between neutrophil extracellular trap-related genes （NRG） and interstitial cystitis （IC）， and explore their associated immune strategies. Methods The gene expression data of IC patients from the gene expression omnibus （GEO） database were obtained and identified 12 differentially expressed NET-related genes （DE-NRG） by integrating NRG from published literature. Subsequently， we applied 2 machine learning methods， least absolute shrinkage and selection operator （LASSO） regression and random forest （RF）， to further determine the core DE-NRG. To gain deeper insights into the functions of the DE-NRG， we performed Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyzes， and constructed a protein-protein interaction （PPI） network using the STRING database. Additionally， immune cell infiltration was analyzed using the CIBERSORT algorithm. To evaluate the diagnostic value of these gene signatures， we plotted receiver operating characteristic （ROC） curves and calculated the area under the curve （AUC）. Finally， core DE-NRG were verified through analysis of external datasets and experimental validation via immunohistochemical and Western blotting assays in IC patient biopsy samples. Additionally， double immunofluorescence staining was employed to confirm the presence of NET in IC patient specimens. Results A total of 12 DE-NRG were identified。Among these， complement C3（C3）， cathepsin G（CTSG）， and selectin P（SELP） were associated with signaling pathways related to neutrophil extracellular trap （NET） formation. PPI network analysis revealed that MMP9 and CCL5 exhibited the most interactions with other proteins. Core DE-NRG， C3 and CTSG， were further determined. Immune cell infiltration analysis demonstrated that resting mast cells play a significant role in the progression of IC. Through analysis of external datasets， immunohistochemical analysis， and Western blotting assays， CTSG was found to be upregulated， whereas C3 expression was downregulated in IC patients. Double immunofluorescence staining results indicated that NET formation is closely associated with the pathological processes of IC. Conclusion The 12 DE-NRG played an important role in the occurrence and development of IC. Furthermore， C3 and CTSG， as the core genes associated with extracellular traps in IC neutrophils， may be potential biomarkers and therapeutic targets for IC.

Graphical abstract

关键词

间质性膀胱炎 / 中性粒细胞胞外陷阱相关基因 / 生物信息学分析 / 免疫细胞浸润 / 机器学习算法 / 生物标志物

Key words

Interstitial cystitis / Neutrophil extracellular trap network-related genes / Bioinformatics analysis / Immune cell infiltration / Machine learning algorithms / Biomarker

间质性膀胱炎（interstitial cystitis，IC）是一种慢性（持续时间>6周）膀胱非细菌性感染的疼痛综合征，该疾病的特征是慢性炎症和下尿路症状^［1］；临床上表现为膀胱壁的纤维化，可能与上皮组织缺陷、自身免疫反应或感染有关^［2］。原因尚不明确，临床上仍为排除性诊断，因此IC经常被晚期发现或误诊^［3］。中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NET）是指由受到各种刺激下活化的中性粒细胞死亡后释放胞内物质而形成的纤维网络^［4］。其网状结构的骨架组蛋白和高度脱缩的染色质纤维组成^［5］。颗粒状成分是直径为25 nm的球状蛋白，位于NET的DNA骨架结构上，具有抗菌活性^［6］。NET除了捕获和杀死微生物外，它们还会自行或通过增加促炎反应对周围组织造成损伤^［7］。与NET相关的基因对IC患者的预后具有临床价值，并且与NET有着密切的关系^［8］。然而，对IC中NET全面深入的研究仍有不足。

本研究基于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的数据集GSE28242和GSE238208筛选出关于IC中539个差异表达基因（differently expressed genes，DEG），其中包括207个上调DEG和332个下调DEG。联合中性粒细胞胞外陷阱相关基因（neutrophil extracellular trap-related genes，NRG）取交集，得到12个DE-NRG。对DE-NRG进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书分析（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）富集分析、蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络分析和免疫细胞浸润分析。使用机器学习最小绝对值收缩与选择算子LASSO回归和随机森林（random forest，RF）的机器学习方法与中性粒细胞外陷阱形成信号通路有关基因取交集，进一步筛选出核心DE-NRG：补体C3和组织蛋白酶G（cathepsin G， CTSG）。最后，通过外部数据集GSE11783分析，Western blot和免疫组化分析方法进行验证，表明C3和CTSG可能成为IC的潜在生物标志物和治疗靶点。此外，免疫双荧光实验结果表明NET的形成与IC密切相关。

1 材料与方法

1.1 数据收集

从GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO）中下载与IC相关数据集GSE238208中的25例IC患者的冷杯活检样本的RNA-seq，其中25例来自Hunner病变区域，另外25例来自没有Hunner病变的背景黏膜区域（n=50）^［9］。数据集GSE28242中尿沉渣5例对照样本；5例无病变样本；3例有病变样本（n=13）。数据集GSE11783中16例5名IC患者和6名对照患者，6例无病变样本；10例有病变样本，用作验证数据集（n=16）。

1.2 IC患者DE-NRG的鉴定

为了比较间质性膀胱炎组样本之间的差异表达情况，本试验采用“limma”R包鉴别IC患者冷杯活检样本和尿沉渣样本的DEG，以|log₂FC|=0.5，P<0.05作为筛选标准，将DEG与NET相关基因联系取交集，最终获得12个DE-NRG ^［10］。

1.3 DE-NRG的功能富集分析

利用R的“clusterProfiler”和“enrichmentplot”软件包，对DE-NRG的GO和KEGG进行分析^［11-12］。

1.4 DE-NRG蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

为了分析DE-NRG之间的相互作用，使用PPI网络通过STRING（https：//string-db.org）在线数据库构建蛋白之间的相互作用^［13］。选择12个DE-NRG（中位数置信度>0.9）构建PPI网络，并通过Cytoscape软件（https：//cytoscape.org/v3.9.0）进行可视化^［14］。

1.5 核心DE-NRG的鉴定

采用机器学习10倍交叉验证法执行LASSO和基于RF算法对12个DE-NRG进行筛选，并与KEGG中与中性粒细胞外陷阱形成信号通路（neutrophil extracellular trap formation）有关基因取交集，得到核心DE-NRG：C3和CTSG。LASSO方法涉及对系数的绝对值施加惩罚，以调节其大小，从而改善对过拟合的控制，并提高模型的可解释性^［15］。用于回归的RF算法是一种机器学习技术，它使用数据和特征的随机子集构建决策树，提高了整体性能^［16］。使用外部验证数据集GSE11783验证研究中鉴定的基因特征的表达和诊断价值。通过受试者工作曲线（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价基因特征的诊断价值^［17］。其中，ROC曲线与坐标轴围成的面积被称为AUC（area under curve）， AUC>0.7说明该模型的准确度较高，具有一定的临床应用价值。

1.6 免疫细胞浸润分析

利用R包“IOBR”中的 CIBERSORT算法分析基因表达数据，研究DE-NRG表达与22种不同类型免疫细胞浸润之间的关系，使用R包“ggplot2”计算DE-NRG与免疫细胞的得分并进行可视化^［18］。利用R包“ggpubr”计算C3和CTSG和浸润免疫细胞的相关性，并使用R包“corrplot”可视化^［19］。

1.7 IC冷杯活检样本收集

对于6名被诊断患有IC的患者，进行膀胱镜检查与在水扩张之前获得配对的冷杯活检样本，一份来自炎症病变区域，一份来自非炎症病变区域。活检样本送至病理科立即在液氮中冷冻并储存在-80 ℃。

1.8 蛋白质印迹（Western blot，WB）

将活检样本匀浆后提取组织总蛋白，测定蛋白浓度。将适量样本进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，使用PVDF膜通过湿转法进行转膜。转膜完成后，将膜放入封闭液中，室温下震荡封闭1 h。随后加入一抗（Anti-Complement C3抗体，Abcam，ab200999，1∶1 000；Anti-Cathepsin G抗体，Abcam，ab282105，1∶1 000，Anti-alpha Tubulin抗体，Abcam，ab7291，1∶1 000），4 ℃孵育过夜。洗涤，加入二抗［山羊抗兔IgG （HRP），Abcam，ab6721，1∶5 000］，室温下振荡孵育1 h。显影成像。以Tubulin作为内参蛋白，使用Image J软件分析目标蛋白与内参蛋白的灰度值，计算相对表达量。

1.9 免疫组化分析

将活检样本固定在4% PFA中24 h后洗涤，梯度酒精脱水，透明、浸蜡和包埋，经切片机进行切片。热修复封闭。孵育一抗（Anti-Complement C3 抗体，Abcam，ab200999，1：2000；Anti-Cathepsin G抗体，Abcam，ab282105，1：5000）过夜，加入二抗［山羊抗兔IgG （HRP），Abcam，ab6721，1：5000］孵育30 min，使用DAB显色后复染和脱水，封片后用光学显微镜下观察、拍照。

1.10 免疫荧光分析

操作同1.19将5 μm切片封闭后孵育一抗（重组Anti-Myeloperoxidase抗体，Abcam，ab208670，1∶100；Anti-Citrullinated Histone H3 抗体，ABclonal，A18298，1：100）和荧光二抗（抗兔IgG-HRP H&L Alexa Fluor^® 488，Abcam，ab150077，1∶1 000）。进行DAPI染色后封片，拍照并于ImageView图像分析系统上以CitH3/MPO双阳性细胞在每个视野上的数量作为NET的相对含量分析。

1.11 统计学方法

本研究使用R软件（Version 4.1.2）对所有表达矩阵数据进行分析。实验组和对照组的结果采用t检验（Student′s t test），计量数据以（\overline{x}±s）表示（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1，ns表示P>0.05）。

2 结果

2.1 DE-NRG的筛选

对基因表达谱数据集GSE28242和GSE238208以|log₂FC|=0.5，P<0.05作为筛选标准进行差异表达分析。结果显示，从GSE28242中有病变和无病变样本中筛选出315个DEG，上调DEG有231个，下调DEG有84个（图1A）；GSE238208数据集中的病变样本和正常样本筛选出539个DEG，其中包括207个上调DEG和332个下调DEG（图1B）。

将两个数据集的DEG与NET相关基因集取交集，获得12个DE-NRG（图1C）。分别是C3、CC族趋化因子配体5（CC chemokine ligand 5，CCL5）、CTSG、凝血因子Ⅱ凝血酶受体样2（coagulation factor Ⅱ thrombin receptor like 2，F2RL2）、缺氧诱导因子1亚基α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）、白细胞介素33（interleukin 33，IL-33）、干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、选择蛋白P（selectin P，SELP）、细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）、分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）和组织金属蛋白酶抑制因子1（tissue inhibiter of metalloproteinase 1，TIMP1）（图1D）。

2.2 DE-NRG功能富集分析

GO富集分析结果显示，DE-NRG在生物过程（biological process，BP）中主要参与炎症反应的调节、细胞外基质拆解和趋化因子介导的信号通路的调节；在细胞组分（cellular component，CC）主要富集于分泌颗粒腔、细胞质囊泡管和囊泡腔中；在分子功能（molecular function，MF）中主要对细胞因子、活性酶抑制剂、活性受体配体活性起作用（图2A）。KEGG富集分析显示，DE-NRG主要富集在TNF信号通路、甲型流感和中性粒细胞外陷阱形成等信号通路（图2B）。与TNF信号通路有关的基因为CCL5、MMP9和SOCS3；与甲型流感信号通路有关的基因为CCL5、IL-33和SOCS3；C3、CTSG和SELP与中性粒细胞外陷阱形成信号通路有关（图2C）。中性粒细胞外陷阱形成信号通路与血脂及动脉粥样硬化、恰加斯病、金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路具有较强的相关性（图2D）。

2.3 PPI网络分析

基于STRING数据库对12个DE-NRG构建PPI网络，并通过Cytoscape软件对PPI网络可视化，结果显示MMP9及CCL5与其他蛋白互作关系最多，与除了F2RL2蛋白之外其他蛋白都存在互作关系。C3与CTSG、SPP1、CCL5、MMP9及SELP存在互作关系；CTSG与C3、CCL5、IL-33、SELP、F2RL2及MMP9存在互作关系（图3）。

2.4 核心DE-NRG的筛选

对12个DE-NRG进行LASSO回归分析，结果显示，在左边虚线偏差最小时的λ取值下，变量数是8，模型拟合效果最高（图4A，4B）。筛选出来的基因为：C3、CTSG、F2RL2、HIF1A、IL-33、IRF1、MMP9和TIMP1。使用RF算法根据基尼重要性度量（mean decrease Gini）对12个DE-NRG进行排序，基尼系数的重要性较高的基因为HIF1A、F2RL2、TIMP1、SELP和C3（图4C）。将两种机器学习算法结果和KEGG中与中性粒细胞外陷阱形成信号通路相关基因取交集，鉴定出2个核心DE-NRG：C3和CTSG（图4D）。

2.5 免疫细胞浸润分析

采用CIBERSORT算法分析DE-NRG与免疫细胞浸润的关系，结果显示，与非病变样本相比，病变样本的休眠期肥大细胞浸润相对较高；M0和M2巨噬细胞浸润相对较低（图5A）。整体而言所有样本中B细胞含量最多（图5B）。C3与CD4⁺幼稚T细胞、中性粒细胞及活化期树突状细胞有较强的正相关性；与浆细胞、休眠期肥大细胞、活化期肥大细胞、幼稚B细胞及记忆B细胞有较强的负相关性（图5C）。CTSG与浆细胞、休眠期肥大细胞、幼稚B细胞有较强的正相关性；与T细胞滤泡助手、幼稚B细胞、嗜酸性粒细胞及活化期树突状细胞有较强的负相关性（图5C）。DE-NRG免疫细胞之间相关性分析显示，CD4⁺ T细胞亚群与幼稚B细胞有较强的负相关性；NK细胞亚群与CD8⁺T细胞、活化期CD4⁺记忆性T细胞、休眠期CD4⁺记忆性T细胞及γ-δT细胞有较强的正相关性；与浆细胞及调节性T细胞有较强的负相关性（图5D）。

2.6 核心DE-NRG的验证

进一步通过ROC曲线评估了CTSG和C3在数据集GSE238208中的诊断价值，发现CTSG和C3的AUC值分别为0.711和0.779，均大于0.7，这表明CTSG和C3具有较高的诊断价值（图6A）。为验证候选生物标志物的诊断价值，在外部验证数据集GSE11783中分析了CTSG及C3的表达水平，发现CTSG及C3在GSE11783中的表达趋势与GSE238208中的表达趋势一致，即C3在IC中为下调基因，CTSG为上调基因（图6B）。并且CTSG及C3在数据集GSE11783中对IC样本分类也具有较高的诊断准确性（AUC>0.7），其中CTSG及C3的AUC值分别为0.767和0.817（图6C）。

随后，采用WB和免疫组化实验验证了CTSG和C3在IC活检组织中的表达水平。WB实验结果显示，与对照组相比，CTSG在IC样本中的表达水平显著升高，而C3在IC样本中的表达水平明显降低（图7A、B）。免疫组化结果显示，在组织学水平上，IC组相较于对照组，CTSG的阳性信号呈现显著的上调趋势，而C3的表达则呈现区域性减弱（图7C）。

2.7 NET检测分析

为评估IC样本中NET的形成情况，采用免疫双荧光染色实验方法对样本中的NET进行定位和定量分析。实验结果显示，与正常样本相比，IC样本中存在显著的中性粒细胞浸润（MPO阳性信号明显增强）。此外，这些浸润的中性粒细胞表现出活跃的NET形成，表现为CITH3阳性信号的显著增加（图8A、B）。这些结果表明，IC样本中中性粒细胞不仅大量浸润，还积极参与NET的释放。

3 讨论

根据膀胱镜检查是否观察到出血点和Hunner病变，或活检是否观察到炎症和纤维化病变，IC患者可分为Hunner型（hunner-type interstitial cystitis，HIC）和非Hunner型IC（non-hunner type interstitial cystitis，NHIC）两种^［20］。Hunner病变是一种红色的黏膜病变，缺乏与血管汇聚相关的正常毛细血管结构，覆盖纤维蛋白凝块或附近的疤痕^［21］。HIC表现为特定的Hunner病变，特征是上皮变性，包括血管增多、明显水肿和散在出血，其临床特征是慢性盆腔和膀胱疼痛，同时伴有尿频和尿急等下尿路症状。B细胞群的异常可能与HIC的发病机制有关；HIC中的肥大细胞能够快速增殖和活化并释放介质。HIC和NHIC的病理生理学也有所不同，涉及多种因素的相互作用，如炎症、自身免疫、感染、外源性物质、尿路上皮功能障碍、神经多动和膀胱外疾病。IC的治疗进展缓慢，并且由于缺乏NET相关预测性生物标志物和对病理生理学的了解有限而受到阻碍。

中性粒细胞形成NET而死亡的方式有别于细胞凋亡和坏死，被称为中性粒细胞的炎性细胞死亡方式（NETosis）。NETosis分为细胞溶解性和自发性（囊泡释放）两种形式。其中细胞溶解性的方式进程发生迟缓，形成过程主要表现为：在适当刺激下，中性粒细胞的细胞核变形，核膜与颗粒膜发生分离后，NET由于细胞膜裂解而从细胞内释放到胞外^［22］。此外，有研究^［23］认为除细胞裂解方式外NET也可以自发性产生，该过程独特、快速并且不依赖还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化物。

本文通过IC差异基因与NET相关基因联合分析，对IC中的NET的发生机制提出了新的观点，对IC后续的治疗和预后预测具有重要意义。KEGG分析表明，IC中的C3与中性粒细胞外陷阱形成通路、金黄色葡萄球菌感染通路、南美锥虫病通路、系统性红斑狼疮通路和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路都有关。C3是补体系统的中心效应分子，在补体系统的激活中起着核心作用。细胞外、组织、细胞衍生和细胞内的C3激活片段及其受体会触发复杂的下游效应网络^［24］。C3在许多疾病中失调的免疫反应中起关键作用，使其成为一个有吸引力的治疗靶点。C3是中性粒细胞募集到膀胱和确保NET形成所必需的成分之一，C3在IC的病理生理学过程中起重要作用，因此，靶向C3可能是改善IC中局部损伤和远程器官功能障碍的潜在策略。

PPI蛋白网络结果表明，IC中的CTSG与C3、CCL5、IL-33、SELP、F2RL2及MMP9蛋白存在互作关系。MMP9为CTSG的潜在下游效应子；CTSG是中性粒细胞丝氨酸蛋白酶，参与形成NET。CTSG可降解细胞外基质成分，并在炎症性疾病中具有调节功能，参与被吞噬的病原体的杀灭和消化，以及炎症部位的结缔组织重建^［25］。发现CTSG在IC中的高表达，可能作为IC诊断和治疗的新潜在靶点。

免疫浸润分析表明，C3及CTSG与多种免疫浸润细胞有密切相关性。与正常样本相比，IC样本中休眠期肥大细胞表达相对较高。C3与休眠期肥大细胞有较强的负相关性；CTSG与休眠期肥大细胞有较强的正相关性。这提示在IC中肥大细胞发挥重要作用。肥大细胞是人体主要免疫细胞之一，最主要的结构特征为其胞内含有大量嗜碱性颗粒，有研究^［26］表明肥大细胞影响嗜中性粒细胞的募集。休眠期肥大细胞能诱导幼稚和活化B细胞的增殖和诱导其分化为抗体^［27］。C3与CTSG可能通过调控休眠期肥大细胞进而影响IC的进展。

通过外部数据集分析、免疫组化和WB实验方法验证得出，与正常样本相比，在IC活检样本中C3表达下调而CTSG表达上调，这进一步支持了CTSG和C3可能作为IC诊断和治疗的新潜在靶点。此外，通过免疫双荧光技术检测发现IC样本中存在大量的NET形成。与正常样本相比，IC样本中的中性粒细胞明显增多，并且这些中性粒细胞产生了大量的NET。这一结果不仅证实了NET在IC发病过程中的存在，还提示NET可能与IC的病理生理学机制密切相关。NET作为一种新型的免疫防御机制，在IC等慢性炎症性疾病中的过度形成可能导致组织损伤和炎症反应的持续存在^［28］。推测在IC中，NET可能通过促进炎症细胞的浸润、激活补体系统、诱导细胞凋亡等多种途径参与病理生理学过程。未来的研究将进一步探讨NET在IC中的具体作用机制，为IC的诊断和治疗提供有力的支持。

总之，本研究利用生物信息学的分析方法，通过联合分析IC的差异表达基因和NET相关基因，筛选出DE-NRG；为了解IC中的NET机制提供新的研究思路，为研究IC的诊断和治疗提供新的研究方向；同时从生物信息学角度确定了核心DE-NRG：C3和CTSG，预测其可能成为IC的潜在生物标志物和治疗靶点。

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基金资助

安康市科学技术研究发展计划项目(AK2020-SF-02)