肠道微生物群与缺铁性贫血的因果关系：一项两样本孟德尔随机化研究

Causal relationship between gut microbiota and iron deficiency anemia： a Mendelian randomization study of two-samples

摘要

目的 本研究旨在利用孟德尔随机化研究分析肠道微生物与缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）发病风险的因果关系。 方法 利用英国生物库GWAS数据库的公开数据集，以肠道菌群相关单核苷酸多态性位点作为工具变量。采取两样本孟德尔随机化方法，使用逆方差加权法、MR-Egger回归法、加权中位法等5种方法评价其因果关系，并进行质量控制。 结果 发现14个不同水平的肠道菌群可能与IDA的发生有潜在因果关系。经Benjamini-Hochberg（BH）法矫正之后，放线菌目、巴斯德氏菌目和梭菌目肠道微生物与IDA的发病之间的因果关系有统计学意义（P_-BH <0.05）。 结论 本研究发现放线菌目、巴斯德氏菌目和梭菌目肠道微生物与IDA的发病率呈负相关，为IDA治疗提供了新思路。

Abstract

Objective This study was to examine the causal relationship between the gut microbiota and the risk of developing iron deficiency anemia（IDA） through the use of a Mendelian randomization study. Methods The publicly available datasets from the United Kingdom Biobank genome-wide association study database were employed in this investigation. A two-sample Mendelian randomization method was employed， utilizing gut flora-associated single nucleotide polymorphism loci as instrumental variables. Five methods， such as inverse variance weighting method， MR-Egger regression method and weighted median method， were used to evaluate the causal relationship and carry out quality control. Results 14 different levels of intestinal flora that may have a potential causal relationship with the development of iron deficiency anemia were found. The causal relationship between Order. Actinomycetales， Order. Pasteurellales and Order. Clostridiales and the development of iron deficiency anemia was statistically significant after correction by the Benjamini-Hochberg method （P_-BH <0.05）. Conclusion This study found that Order. Actinomycetales， Order. Pasteurellales， Order. Clostridiales were negatively correlated with the incidence of IDA， which provided novel insights for IDA treatment.

Graphical abstract

关键词

缺铁性贫血 / 孟德尔随机化 / 肠道微生物群 / 单核苷酸多态性位点

Key words

Iron deficiency anemia / Mendelian randomization / Gut microbiota / Single nucleotide polymorphism loci

肠道微生物群是人体最大的微生态系统，其中细菌占据着主要的地位，最常见的为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门四大类。有学者提出“肠-器官轴”的概念来概括肠道微生物群稳态与宿主健康之间的关系^［1］。肠道生态失调会驱动宿主全身炎症及各系统慢性疾病的发生发展^［2-4］，已有研究显示肠道生态失调与阿尔茨海默病^［5］、多发性硬化症^［6］、肾脏肿瘤^［7］、COPD^［8］等疾病的发生发展相关。

缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是最常见的贫血类型，由于机体对铁的需求与供给失衡，导致体内贮存铁耗尽，继之缺铁性红细胞生成（iron deficient erythropoiesis，IDE），最终引起IDA。IDA是铁缺乏症（iron deficiency，ID）的最终阶段^［9］。IDA会使人体免疫力下降从而导致各系统疾病的发生，影响婴幼儿及青少年的生长发育，增加妊娠期妇女出现妊娠并发症的风险等^［10］。

Mulayamkuzhiyil等^［11］发现幽门螺杆菌可以引起萎缩性胃炎，增加胃pH值，减少铁吸收，是IDA的诱因。也有研究发现，在治疗IDA的同时根除幽门螺杆菌，可以获得更好的疗效并减少IDA复发^［12］。Soriano-Lerma等^［13］发现IDA的发病与肠道微生态失调有关，铁主要通过十二指肠吸收，其余的铁到达结肠，肠道菌群通过产生铁载体和短链脂肪酸影响铁的价态转变及可用性^［14］。Chen等^［15］发现链球菌和儿茶酚（粪便代谢物）可促进孕妇IDA的发展。由此推断，肠道菌群失调可能与IDA的发生相关。Das等^［16］发现利福昔明可以增加IDA小鼠模型中铁吸收基因的表达。多项研究^［17-18］发现益生菌可以促进肠道对铁的吸收。基于上述研究，运用抗生素和服用益生菌或许可以作为一种对IDA有效的辅助治疗。

既往关于IDA的研究大多是病例对照研究，样本量小，且观察性研究容易受到年龄、环境、饮食模式和生活方式等混杂因素的影响，无法明确暴露与结局之间的因果关系。孟德尔随机化（Mendelian Randomization，MR）是工具变量（instrumental variable，IV）分析的一种，利用遗传变异随机分配的特性模拟对人群的随机分配过程，将遗传变异作为工具变量来量化因果关系^［19］。相比于传统的观察性研究，MR可以获得更大的样本量，也可以避免混杂因素及反向因果的干扰。本研究旨在通过MR分析方法评估肠道微生物与IDA之间的因果关系，为IDA寻找潜在的预防及治疗策略。

1 材料和方法

1.1 研究设计

本研究旨在通过MR分析方法评估肠道微生物与IDA之间的因果关系。即以肠道微生物群作为暴露，缺铁性贫血作为结局，进行MR分析。MR研究需遵循三大核心假设^［19-20］：① 最终纳入研究的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）与暴露因素（肠道微生物群）密切相关；② SNP与已知混杂因素（影响IDA）无关；③ SNP仅通过暴露（肠道微生物群）影响结局（IDA），见图1。

1.2 数据来源和工具变量的筛选

肠道微生物全基因组关联分析（genome-wide association study， GWAS）数据库来自MiBioGen联盟一项最新的全基因组大规模荟萃分析（https：//mibiogen.gcc.rug.nl），纳入18 340个个体（24个队列）的全基因组基因型和粪便微生物组数据，排除了15个没有特定种名的细菌类群，最终纳入196种类群，包含5 747 754个SNP。IDA的遗传数据来自于IEU Open GWAS项目的英国生物库GWAS数据集（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/）。IDA总样本量484 598例，其中2 941例IDA患者，481 657例对照，共有9 587 836个SNP。本研究的数据来源均为公开数据库，因此不需要额外的伦理批准。

关于工具变量的筛选，① 确定与暴露变量强相关的SNPs，设置阈值为P<5×10^-8，从而满足SNP与暴露变量的关联性。② 为确保遗传工具之间的独立性，设置遗传距离为5 000 kb，剔除连锁不平衡参数（r²）>0.001的SNP。③ 以P<5×10^-8为标准剔除与IDA相关的SNP。④ 计算F统计量，F>10表明存在弱工具变量偏倚的可能性较小，剔除F<10的工具变量。

1.3 孟德尔随机化分析和质量控制

以逆方差加权法（inversevariance weighted，IVW）为主要分析方法，MR-Egger回归、加权中位数法（weighted median，WM）、简单模型（Simple mode）和加权模型（Weighted mode）作为辅助分析方法，来评价肠道微生物与IDA发病的因果关系。MR-Egger-intercept检测和MR-PRESSO离群值检测用于测试和校准水平多效性的异常值。使用模型中的Outlier-corrected方法并且剔除工具变量中离群值，矫正水平多效性后再进行效应评估，以确保MR评估的可靠性。使用Cochron's Q来检验工具变量之间的异质性，当P<0.05时即可认为SNP之间存在异质性。使用留一法，即逐个剔除检验对数据的稳定性进行检测，如果剔除某个工具变量后MR 结果和总结果差异很大，说明 MR 结果对该SNP是敏感的，即该SNP对MR结果有较强的影响。

1.4 统计学方法

本研究所有数据分析均在R（4.3.2）软件中进行，均使用TwoSampleMR包和MR-PRESSO包进行分析。

2 结果

2.1 IVW分析结果

根据预设的阈值，从SNP中筛选出2 185个SNP（196种类肠道菌群）。使用R软件，分析筛选出来的SNP与IDA之间的因果关系。我们发现14个不同水平的肠道菌群（包括158个SNP）可能与IDA相关，其中包括（1个门，3个目，6个属，2个科，2个纲）。上述14个结果经过BH法矫正之后，放线菌目（Order. Actinomycetales）（OR=0.997，95%CI：0.996~0.999）、巴斯德氏菌目（Order. Pasteurellales）（OR=0.999，95%CI：0.997~1.000）、梭菌目（Order. Clostridiales）（OR=0.997，95%CI：0.996~0.999）三种细菌与IDA的发病之间的因果关系有统计学意义（P_-BH <0.05），均与IDA的发病呈负相关，提示以上三种细菌是IDA的保护因素。11个微生物群可能与IDA存在潜在因果关系，其中，Genus.Hungatella（OR=1.001，95%CI：1.000~1.003），Genus.Parasutterella（OR=1.001，95%CI：1.000~1.002），Genus..Ruminococcusgnavusgroup（OR=1.001，95%CI：0.995~1.008），Class.Mollicutes（OR=1.00，95%CI：1.000~1.003），Phylum.Tenericutes（OR=1.00，95%CI：1.000~1.003）与IDA呈现正相关；Genus.Prevotella9（OR=0.999，95%CI：0.998~1.000），Genus.ErysipelotrichaceaeUCG003（OR=0.998，95%CI：0.997~1.000），Genus.Oscillospira（OR=0.998，95%CI：0.997~1.000），Family.Actinomycetaceae（OR=0.997，95%CI：0.996~0.999），Family.Pasteurellaceae （OR=0.999，95%CI：0.997~1.000），Class.Clostridia（OR=0.997，95%CI：0.995~0.999）与IDA呈现负相关。以上孟德尔随机化分析结果见表1，孟德尔随机化分析五种方法的散点图见图2。

2.2 质量控制

Q检验结果显示，所选工具变量之间均无明显异质性；MR-PRESSO检测结果显示，Genus.ErysipelotrichaceaeUCG003、Genus.Oscillospira表现出微弱的水平多效性，但去除离群值后不改变MR结果，提示不需要考虑基因多效性对结果造成的影响；MR-Egger分析结果显示，所选工具变量均无明显水平多效性，见表1。留一法如图所示，逐个剔除SNP后，大部分结果与总效应值接近，提示分析结果具有稳定性，见图3。

3 讨论

本研究利用MR分析方法探索肠道微生物群与IDA的因果关系，结果得出14种肠道菌群与IDA相关，经过BH法矫正之后，最终显示放线菌目、巴斯德氏菌目和梭菌目与IDA呈负相关，可能是IDA的保护因素。

肠道菌群及其代谢物可能通过多种机制对IDA产生影响。Das等^［16］发现肠道微生物代谢物1，3二氨基丙烷（DAP）、罗伊氏菌素（reuterin）通过抑制肠道缺氧诱导因子（HIF）-2α活性和上调铁蛋白（FTN）表达来调节宿主全身铁稳态。有研究发现，宿主肠道生态失调，尤其是革兰氏阴性菌的数量增加，会导致氧化三甲胺（TMAO）过量产生，TMAO的促炎作用促使白介素-6（IL-6）分泌，IL-6可导致肝脏释放过量铁调素（hepcidin），hepcidin通过结合铁输入蛋白（DMT-1）、铁转运蛋白（FPN）等途径减少肠细胞铁吸收及铁进入循环，从而使宿主体内铁浓度降低^［21-24］。Kortman等^［25］发现铁浓度增加也会导致人体有益菌丰度减少。这表明肠道铁与微生物群之间互相影响，二者保持动态平衡，维持宿主肠道稳态^［26］。探究肠道菌群与IDA之间的关系，提示未来可以将改变肠道菌群分布、增加肠道有益菌等途径作为IDA的辅助治疗，改善IDA患者预后及生活质量，为IDA的预防和治疗提供新思路。

Seo等^［27］发现IDA患者肠道的梭菌目与正常受试者相比从45.6%下降到33.8%。梭菌目是一类革兰阳性厌氧菌，属于厚壁菌门梭菌纲。梭菌目中的丁酸梭菌是肠道中产生丁酸盐的主要菌群之一。丁酸盐是一种短链脂肪酸，是肠道微生物群和上皮代谢之间正反馈回路的关键调节剂，通过β-氧化使结肠细胞消耗大量的氧气，促进了专性厌氧菌的生长，在维持肠道稳态中起着关键作用^［28］。另外有研究^［29-30］发现补充丁酸盐可恢复多种贫血模型的铁代谢，这可能是丁酸盐通过上调巨噬细胞中FPN的表达，促使吞噬细胞吞噬衰老和受损的红细胞以回收铁的结果。McClorry等^［31］发现缺铁婴儿肠道中产生丁酸盐的细菌丰度下降。以上研究均支持本研究结果，表明肠道梭菌目丰度下降可能是IDA发生的潜在机制。

但Ana Soriano-Lerma等^［32］发现IDA患者的结肠微生物群落中梭状芽孢杆菌种类占优势，这与本研究结果相反。梭状芽孢杆菌属是肠道产生短链脂肪酸的主要菌种，IDA患者肠道屏障受损，肠道微生物通过产生短链脂肪酸代偿，这可能是上述研究与本研究结果不一致的主要原因。本研究为肠道微生物与IDA发病之间存在因果关系提供了更充足、高级的证据。使用丁酸梭菌作为益生菌或许可以作为预防及治疗IDA的新思路。

放线菌目属于放线菌门放线菌纲，是一组革兰阳性菌。放线菌作为益生菌，在维持宿主肠道稳态^［33］、改善肠道功能及促进营养物质消化吸收中起着关键的作用。既往有研究发现在儿童中，IDA患儿相比于健康儿童肠道放线菌门丰度下降^［34］，这与本研究结论一致。放线菌丰度减低可能使肠道屏障受损，使宿主肠道稳态被破坏，导致铁吸收障碍，从而导致IDA发生。

巴斯德氏菌目属于变形菌门γ-变形菌纲，是一组革兰阴性菌。巴斯德氏菌是常见的促炎菌^［35］，可以导致人畜的多种疾病，而本研究认为巴斯德氏菌是IDA的保护因素。既往无巴斯德氏菌与IDA相关的研究，因此需要更深入的研究证明其因果关系。

孟德尔随机化研究基于等位基因随机分配给子代的原理，可以避免混杂因素、选择偏倚及回忆偏倚等的干扰。本研究相对于观察性研究的优势在于：① 使用SNP作为工具变量，SNP为生物先天决定，很少受到后天影响，可以在一定程度上排除混杂因素的影响；② 本研究的数据来源于公共数据库，样本量较大；③ 本研究可以排除反向因果的干扰。但本研究也存在一定的局限性：① 本研究的相关数据均来自欧洲人群，因此无法避免人种差异带来的影响；② 本研究所用数据集均来自公共数据库，无法进一步进行亚组分析，比如患病人群的年龄、性别、疾病分型等；③ 虽然结果经过严格的质量控制，但仍可能存在一些潜在未知的混杂因素。综上所述，本研究从遗传角度评估了肠道微生物在IDA发病中的潜在因果关系。了解肠道菌群在IDA发病中的作用，有助于未来对预防、诊断、治疗IDA提供新的靶点。由于本研究与观察性研究之间存在差异，因此未来的研究者可以进行大规模前瞻性研究，验证肠道菌群分布差异是否会导致IDA的发病。

综上所述，本研究评估了肠道微生物群与缺铁性贫血的潜在因果关系，发现放线菌目、巴斯德氏菌目和梭菌目丰度的减低会导致IDA的患病风险增加，为缺铁性贫血的发病机制及治疗方案提供了新思路。

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