基于网络药理学和生物信息分析法研究二甲双胍对血管性痴呆的神经保护作用

Study on the neuroprotective effects of metformin on vascular dementia based on network pharmacology and bioinformatics analysis

摘要

目的 基于网络药理学和生物信息分析方法，探究二甲双胍（metformin，Met）对血管性痴呆（vascular dementia，VaD）患者的潜在神经保护作用的机制。 方法 从数据库获取Met作用靶点基因与VaD数据集GSE122063，筛选对照组与疾病组的差异基因，与Met靶点基因取交集后进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Analysis，KEGG）分析，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）筛选关键基因，进行关键基因与免疫细胞相关性分析，评估关键基因的临床诊断价值，并预测与关键基因作用的转录因子。采用SH-SY5Y细胞设5组实验，检测细胞活力、凋亡、相关基因表达及炎性因子含量。 结果 VaD差异基因与Met靶基因获16个交集基因，筛选出8个关键基因，分别是编码胸苷酸合酶（thymidylate synthase，TYMS）、胰岛素受体（insulin receptor，INSR）、二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）、3-磷酸甘油脱氢酶 1（glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1，GPD1）、腺苷酸活化蛋白激酶非催化性 β1 亚基（protein kinase amp-activated non -catalytic subunit β 1，PRKAB1）、尿苷磷酸化酶1（uridine phosphorylase 1，UPP1）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）和嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，PNP）的基因。其中，关键基因DHFR、FGFR1、INSR、PNP和UPP1在疾病组高表达。Met能有效地减少细胞凋亡，100 μM效果较为显著。 结论 Met可能通过DHFR、FGFR1、INSR、PNP和UPP1基因发挥作用，且能有效地抑制SH-SY5Y细胞凋亡，可能对VaD患者具有神经保护作用。

Abstract

Objective Based on network pharmacology and bioinformatics analysis methods， explore the mechanism by which metformin （Met） exerts potential neuroprotective effects on vascular dementia （VaD） patients. Methods The target genes of Met were retrieved from the database， and the VaD dataset GSE122063 was utilized. Differentially expressed genes between the control group and the disease group were screened. After intersecting them with the target genes of Met， Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyses were conducted. A Protein-Protein Interaction Network （PPI） was constructed to screen key genes. Immune infiltration analysis and analysis of the correlation between key genes and immune cells were conducted， and the clinical diagnostic value of key genes， and predict the transcription factors that act on key genes were evaluated. Five experimental groups were set up using SH-SY5Y cells to detect cell viability， apoptosis， the expression of related genes， and the content of inflammatory factors. Results Sixteen intersection genes were obtained from VaD and Met target genes， and eight key genes were screened， namely thymidylate synthase （TYMS）， insulin receptor （INSR）， dihydrofolate reductase （DHFR）， glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 （GPD1）， protein kinase amp-activated non-catalytic subunit β 1 （PRKAB1）， uridine phosphorylase 1 （UPP1）， fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1）， and purine nucleoside phosphorylase （PNP）. Among them， the key genes DHFR， FGFR1， INSR， PNP， and UPP1 were highly expressed in the disease group. Met could effectively reduce cell apoptosis， with the 100 μM concentration showing a more remarkable effect. Conclusion Met may exert its function through the DHFR， FGFR1， INSR， PNP， and UPP1 genes， effectively inhibit the apoptosis of SH-SY5Y cells， and potentially have a neuroprotective effect on VaD patients.

Graphical abstract

关键词

血管性痴呆 / 生物信息学 / 二甲双胍

Key words

Vascular dementia / Bioinformatics / Metformin

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是脑血管病变引起的脑损害所致的痴呆，临床表现主要为记忆、语言和注意力等多方面能力的渐进性和波动性下降^［1］。随着我国老龄化程度加剧，VaD患者数量倍增，加重了家庭、社会和患者的负担。二甲双胍（metformin，Met）是一种经典的双胍类降糖药，为2型糖尿病的一线首选药物。流行病学研究^［2］表明，长期用二甲双胍治疗的糖尿病患者，脑血管事件发生风险及严重程度显著下降且与降糖作用无关。并且，另有研究^［3-4］结果显示Met在改善认知功能方面具有一定的作用，但在治疗VaD方面的效果尚未得到充分的文献支持。本研究通过整合GEO等数据集进行网络药理学、生信分析和细胞实验，探讨Met治疗VaD的可能作用靶点和神经保护作用，为其临床应用提供佐证。

1 材料与方法

1.1 Met及VaD相关靶点收集与交集分析

使用Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获得Met结构，导入Drugbank（https：//go.drugbank.com/）、Swiss Target Pradiction（http：//swisstargetprediction.ch/）和TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）数据库获取Met的主要作用靶点基因。从GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库获取VaD疾病组和的转录组数据集GSE122063，该数据集包括8名VaD患者的36个组织样本和来自11名健康人的44个组织样本，这些组织取自海马和额叶。使用“limma”包标准化数据集，根据p.adj<0.05，|Log₂FC|>0筛选出差异基因。利用仙桃学术（https：//www.xiantaozi.com/）网站中的韦恩图功能将获取的Met靶点与数据集差异基因取交集，并绘制火山图和交集基因热图。

1.2 功能富集分析

使用仙桃学术网站中的GO和KEGG富集功能对16个交集基因进行GO和KEGG富集分析并将结果可视化，筛选符合FDR（q值）<0.05，P.adj<0.05的通路。

1.3 PPI网络绘制及Hub基因筛选

将交集基因导入String（https：//cn.string-db.org/）数据库，构建PPI网络，置信评分≥0.15。使用Cytoscape（3.9.1版）将PPI结果可视化。使用CytoHubb插件（Between、BottleNeck、Closeness、Radiality和Stress算法）筛选出排名前10的基因，再对这5种算法结果取交集以确定关键基因。

1.4 免疫细胞浸润分析及其与关键基因的相关性分析

使用CIBERSORT算法的22种免疫细胞亚型的参考集（LM22）计算疾病组和对照组免疫细胞的浸润差异。设置筛选阈值为P<0.05，使用“ggplot2”包可视化分析结果，“corrplot”包绘制关键基因和免疫细胞浸润相关性热图。

1.5 关键基因诊断价值评估

使用“qROC”包建立ROC曲线评估关键基因在VaD疾病中的诊断价值，并计算曲线下面积（AUC）和95% CI量化其诊断效能。

1.6 关键基因转录因子预测

用Network Analyst 3.0（https：//www.networkanalyst.ca/）^［5］分析常见基因与转录因子（TF）之间的相互作用及其影响。数据源自JASPAR数据库。构建转录调控网络后使用Cytoscape软件将结果可视化。

1.7 试剂和材料

SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞，CC2101，购自广州赛库生物技术有限公司（广州，中国）；二甲双胍（Met），M2049，购自奥默生物技术（上海）有限公司（上海，中国）；白细胞介素1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒A0101，白细胞介素6（IL-6）ELISA检测试剂盒A0107，肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒A0119，购自南京建成生物工程研究所有限公司（南京，中国）；CCK8试剂盒PH20072，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit试剂盒PH20031，购自南京普皓生物技术有限公司（南京，中国）。

1.8 SH-SY5Y细胞培养

SH-SY5Y细胞于37 ℃，5%CO₂培养箱培养3~4 d。待细胞贴壁70%~80%时，用0.25%含EDTA胰酶消化传代，制成约5×10⁴个/mL的细胞悬液，按100 μL/孔接种96孔板，再培养1~2 d至细胞密度达80%-90%，用于后续实验。

1.9 SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）体外VaD模型的建立及实验分组

参考涂钰均等^［6］方法制备SHSY5Y氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）体外VaD模型，设对照组、OGD/R组和Met组。OGD/R组采用DMEM无糖培养基在特定三气培养箱中处理24 h，再复氧复糖24 h构建模型；Met组在OGD/R模型基础上，分别加入1 μM、10 μM和100 μM的Met于DMEM高糖培养基中培养。

1.10 CCK-8检测细胞活力

取生长期SH-SY5Y细胞配成5×10⁴个/mL细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板，37 ℃、5%CO₂培养24 h。对照组使用DMEM（高糖）培养基；OGD/R组构建氧糖剥夺模型，需用DMEM（无糖）培养基。在对照组细胞与OGD/R细胞转换间需用PBS洗涤3次，以确保后续无糖培养环境。OGD/R模型加药后，置于三气箱无糖缺氧24 h，每孔加100 μL含药DMEM高糖培养基，分别于24、48和72 h检测细胞活力，每孔加入10 μL CCK-8试剂，于37 ℃培养箱避光孵育培养2 h，然后在摇床上振荡10 min混匀，最后使用酶标仪在λ=450 nm处测定OD值。细胞活力计算公式为：细胞活力=OD（实验组）/OD（对照组）。

1.11 Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

将SH-SY5Y细胞接种于6孔板按组培养，PBS洗涤细胞2次（2 000 rpm、离心5 min），收集5×10⁵个细胞，加500 μL Binding Buffer悬浮，依次加入5 μL AnnexinV-FITC、5 μL PI混匀，室温避光培养10 min，用流式细胞仪（Ex=488 nm、Em=530 nm）检测并分析细胞凋亡情况。

1.12 qRT-PCR

使用碧云天Trizol 试剂提取总RNA，BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒DNA Removaland cDNA Synthesis Super Mix 进行反转录，BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix （2×）进行qRT-PCR。以GAPDH为对照基因，qPCR程序为：95 ℃，30 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 10 s，45个循环，2^-ΔΔCt方法计算Bax、Bcl-2、caspase-3的mRNA表达量，引物序列：Bax正向引物为5'-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3'，反向引物为5'-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3'；Bcl-2正向引物为5'-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3'，反向引物为5'-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3'；caspase-3正向引物为5'-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3'，反向引物为5'-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3'；GAPDH正向引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.13 ELISA

在酶标板中加100 μL预稀释的标准品或样品，用ELISA试剂盒测IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α含量，标准孔与样品孔加100 μL HRP标记抗体，封板膜密封后37 ℃温育1 h，洗涤重复5次，加显色试剂A、B（含HRP－链霉亲和素）各50 μL，37 ℃避光温育15 min后加100 μL终止液，依次在450 nm的波长下读取吸光值，拟合标准曲线算样品细胞因子浓度。

1.14 统计学方法

实验数据用SPSS23软件进行统计学分析。计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，进行组间比较时，两组独立样本间比较采用t检验；多组独立样本且需比较多个样本均值时，运用单因素方差分析。经检验，如P<0.05，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 交集基因筛选

对GSE122063数据标准化的结果，如图1A所示；疾病组与对照组有8 065个差异基因与二甲双胍的44个靶点基因，取交集得到16个交集基因，如图1B所示；交集基因的表达情况，如图1C和1D所示，其中有7个上调的基因，9个下调的基因。

2.2 功能富集分析及PPI结果

对16个交集基因采取GO和KEGG富集分析，CC通路未富集到，识别BP、MF和KEGG通路，其与细胞增殖、凋亡和信号转导有关，图2A所示。交集基因的PPI结果如图2B所示，使用CytoHubb插件计算得到的关键基因取交集得8个关键基因，图2C所示，这8个关键基因分别是TYMS、INSR、DHFR、GPD1、PRKAB1、UPP1、FGFR1和PNP。

2.3 VaD组免疫细胞浸润分析及关键基因相关性分析

与对照组相比，VaD组中M2型巨噬细胞和中性粒细胞比例升高，而幼稚B细胞和M0巨噬细胞的比例则显著降低。相关性分析结果如图3A和3B所示，PNP、UPP1与M2巨噬细胞、中性粒细胞比例呈正相关，PNP、INSR与M0巨噬细胞比例呈负相关，PRKAB1与幼稚B细胞比例呈正相关。

2.4 关键基因诊断价值及其表达差异情况

ROC曲线分析结果显示，DHFR、FGFR1、INSR、PNP和UPP1的AUC值大于0.70，具有良好的诊断价值，如图3C所示，且这5个关键基因在疾病组均呈高表达，如图3D所示。转录因子预测结果表明，如图3E所示，INSR受10个转录因子调控，UPP1受13个转录因子调控，FGFR1受12个转录因子的调控，PNP和DHFR分别受5个转录因子的调控。

2.5 CCK8法检测结果

与对照组比，OGD/R组细胞活力显著降低，Met处理组细胞活力较OGD/R组显著升高，其中100 μM Met处理组细胞活力提升最为明显，如图4A所示。

2.6 Annexin-V-FITC/PI双染法检测结果

与对照组相较，OGD/R组细胞凋亡显著增加，Met组细胞凋亡较OGD/R组明显降低，100 μM Met组细胞凋亡显著降低，表明Met可缓解神经细胞受损，如图4B和4C所示。

2.7 qPCR法检测结果

与对照组相比，OGD/R组Bax、caspase-3的mRNA和蛋白水平显著升高，Bcl-2的mRNA表达和蛋白水平显著降低。Met处理后，与OGD/R组相比，Met组Bax和caspase-3的mRNA表达和蛋白水平显著降低，Bcl-2的mRNA表达和蛋白水平显著升高，100 μM Met组最为显著，如图5A所示。

2.8 ELISA法检测结果

与对照组相比，OGD/R组的IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著增高，IL-10水平显著降低，炎症及细胞损伤加剧；与OGD/R组比，Met组IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显增高，100 μM Met组最为显著，如图5B所示。

3 讨论

血管性痴呆是全球范围内继阿尔茨海默病之后第二常见的痴呆类型，主要特征为记忆和认知功能的损害^［7］。VaD与慢性脑低灌注、白质病变、中风和海马体萎缩有关^［8］。尽管众多改善认知的药物已开展临床试验评估，但目前尚未有药物对其展现出特效治疗作用^［9］。为了研究Met对VaD的潜在治疗作用，我们使用GEO数据库中VaD疾病的数据集筛选出疾病组和对照组的差异基因，选取了Met的作用靶点和VaD数据集的差异基因取交集基因，总共得到了16个交集基因。随后对交集基因进行了GO和KEGG富集分析，结果显示与BP、MF及KEGG通路强相关，与MAPK活性通路，PI3K、核苷酸代谢等通路相关，这些通路与细胞的增殖凋亡有关。交集基因之间的相互作用使用Cytoscape软件进行可视化，经CytoHubb插件计算得排名前10的基因，这些基因取交集得到8个关键基因。

对疾病组和对照组进行了CIBERSORT算法的免疫浸润分析，免疫细胞浸润分析显示，VaD组M2型巨噬细胞和中性粒细胞比例升高，已有研究^［10］表明M2巨噬细胞具有神经保护作用，在阿尔茨海默病的病理学表现中，也存在免疫抑制增强现象，如小胶质细胞/巨噬细胞向抗炎M2表型转变以及调节性T细胞（Treg）数量增加^［11］。同时，疾病组M0巨噬细胞的浸润率显著升高，M0巨噬细胞作为未分化的巨噬细胞，可以向促炎M1巨噬细胞或抗炎M2巨噬细胞分化。因此，阐明巨噬细胞表型转换的分子机制有望成为认知障碍研究的潜在靶点。此外，中性粒细胞和淋巴细胞的比值是外周炎症的标志物，在阿尔茨海默病和轻度认知障碍患者中比值升高，且重度认知障碍的患者的中性粒细胞和淋巴细胞的比值更高^［12］。与对照组相比，VaD组幼稚B细胞和M0巨噬细胞的比例显著降低。幼稚B细胞作为未受抗原刺激的B细胞，在外周血和淋巴系统中循环，可进入二级淋巴器官周围的T细胞区^［13］。同源抗原和T细胞可激活幼稚B细胞成为成熟B细胞并启动生发中心反应诱导表型转化，研究发现肝中幼稚B细胞的密度与患者良好的预后相关^［14］。综上所述，这些免疫细胞可能参与VaD发病机制，后续研究需进一步明确其在VaD中的具体作用。

ROC曲线显示DHFR、FGFR1、INSR、PNP和UPP1这5个基因具有良好的诊断价值，且在VaD疾病组中呈高表达。DHFR（二氢叶酸还原酶）是调节叶酸代谢的关键酶，无论体外还是体内，叶酸促进少突胶质细胞成熟时，其特异性DHFR表达上调^［15］。FGFR（成纤维细胞生长因子受体）在神经系统发育中，对多种细胞进程起关键调节作用，激活后可促进体外原代神经元分化与存活^［16］。INSR（胰岛素受体）广泛分布于外周组织及大脑，是胰岛素和胰岛素样生长因子的主要受体^［17-18］。血浆中INSR水平与2型糖尿病严重程度正相关，而2型糖尿病患者因胰岛素抵抗，易出现认知功能障碍^［19］。嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）催化嘌呤代谢物肌苷转化为次黄嘌呤，次黄嘌呤后续经黄嘌呤氧化酶代谢过程产生ROS，损伤线粒体功能，引发氧化应激相关细胞损伤^［20］。且PNP抑制可有效治疗化学性出血性膀胱炎^［21］。尿苷磷酸化酶1（UPP1）在肺组织及脓毒症血液样本中表达上调^［22］。但目前，关于DHFR、FGFR1、INSR、PNP和UPP1在VaD中的作用，尚未见相关研究报道。体外实验通过qPCR和ELISA检测发现，Met显著抑制VaD组的神经元凋亡，且抑制效果与剂量呈正相关。

综上，本研究利用网络药理学筛选出Met与VaD的交集靶点，揭示相关信号通路机制，通过PPI网络、免疫浸润分析及ROC诊断分析确定关键基因，为Met治疗VaD的机制提供初步理论依据，体外实验也证实Met能有效抑制细胞凋亡。后续研究将通过动物实验验证Met对VaD的治疗作用，深入探究关键基因在Met治疗VaD中的作用，以进一步明晰其治疗机制与应用潜力。

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基金资助

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