基于网络药理学探讨汉黄芩素抗胃癌作用机制

The mechanism of wogonin in anti-gastric cancer base on network pharmacology

摘要

目的 基于网络药理学和细胞实验探究汉黄芩素抗胃癌的潜在作用机制。 方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology， TCMSP）获取汉黄芩素主要作用靶点，利用GeneCards数据库筛选胃癌相关的疾病靶基因，韦恩图获取汉黄芩素与胃癌之间的交集靶点。STRING 12.0数据库及Cytoscape 3.7.0软件构建交集靶点蛋白互作网络图，通过degree度值挖掘核心靶点，利用KOBAS数据库进行靶点KEGG信号转导通路富集分析。实验部分采用CCK-8检测细胞活力并计算汉黄芩素对胃癌细胞的IC₅₀，并通过RT-qPCR验证汉黄芩素对胃癌细胞中部分关键靶点的调控作用。 结果 汉黄芩素提取物口服利用度及类药性高，药物吸收好。汉黄芩素与胃癌共同靶点38个，核心靶点包括AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1， AKT1）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53， TP53）、半胱天冬酶3（caspase 3， CASP3）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）及Jun原癌基因（Jun proto-oncogene， JUN）等。KEGG通路富集分析发现汉黄芩素可能通过PI3K-Akt、 p53等信号通路调节抗肿瘤作用。CCK-8结果显示，汉黄芩素可抑制胃癌细胞生长，呈浓度依赖性（P<0.05）。RT-qPCR结果表明，汉黄芩素作用下AKT1的表达显著下调，TP53表达上调（P<0.01）。 结论 汉黄芩素可能作用于PI3K/Akt、p53信号通路，调控AKT1及TP53等靶点基因表达，发挥抗胃癌作用。

Abstract

Objective To explore the protential mechanism of anti-gastric caner of wogonin by network pharmacology and cell experiments. Methods The main target proteins of wogonin were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）. GeneCards database was used to screen the target genes related to gastric cancer. The intersection target between wogonin and gastric cancer was obtained by Venn diagram. The protein-protein interaction network of targets was constructed by STRING 12.0 database and Cytoscape 3.7.0 software. The core targets were mined by degree value， and the KEGG analysis was performed by KOBAS database. In the part of the experiment， CCK-8 was used to detect cell viability and calculate IC₅₀ of wogonin on gastric cancer cells， and RT-qPCR was used to verify the regulatory effect of wogonin on some key targets in gastric cancer cells. Results Wogonin had high oral bioavailability and drug-like properties， and the drug was well absorbed. There were 38 common targets of wogonin and gastric cancer， the core targets included AKT serine/threonine kinase 1 （AKT1）， tumor protein p53 （TP53）， caspase 3（CASP3）， tumor necrosis factor（TNF） and Jun proto-oncogene（JUN）. KEGG analysis showed that wogonin may regulate the antitumor effect through PI3K-Akt， p53 and other signaling pathways. CCK-8 results showed that wogonin could inhibit the growth of gastric cancer cells in a concentration-dependent manner （P<0.05）. The results of RT-qPCR showed that after wogonin intervention， the expression of AKT1 was significantly down-regulated， and the expression of TP53 was up-regulated （P<0.01）. Conclusion Wogonin may act on the PI3K/Akt and p53 signaling pathways， regulate the expression of target genes such as AKT1 and TP53， and play an anti-gastric cancer role.

Graphical abstract

关键词

汉黄芩素 / 胃癌 / AKT1 / TP53 / 网络药理学

Key words

Wogonin / Gastric cancer / AKT1 / TP53 / Network pharmacology

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，据统计，全球胃癌的发病率和死亡率位列前五，2022年全球新增病例约97万，死亡病例约66万，而我国新增病例及死亡病例占全球病例数近40%，胃癌已成为严重威胁人类的生命健康的重大疾病之一^［1-2］。不断提高胃癌的防治水平已成为当前医学面临的严峻问题，充分发挥中医药在胃癌治疗中的特色作用显得十分必要。尽管治疗胃癌的药物、技术以及疗法等不断更新迭代，但仍面临临床疗效不佳、术后肿瘤复发转移导致患者生存时间短、生活质量差等问题。研究^［3-4］表明，中医药在药物抗肿瘤治疗中具有增效减毒的作用，在胃癌术后肿瘤复发、转移的治疗，缓解胃癌晚期患者并发症等方面具有确切而积极的疗效，越来越受到研究者重视。

汉黄芩素作为黄芩的主要活性成分之一，属于黄酮类化合物，其以安全性高，抑制肿瘤细胞增殖作用明显，具有抗肿瘤谱广，并能提高患者机体免疫力等特点，成为筛选抗肿瘤药物的研究热点^［5］。越来越多的研究表明，汉黄芩素通过调节多种细胞信号通路，对多种肿瘤具有巨大的治疗潜力，如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌等，可通过抑制细胞生长增殖、血管生成、侵袭及转移，以及促进细胞毒性作用，增加细胞凋亡等潜在的作用机制发挥其抗肿瘤作用^［6］。而目前对于汉黄芩素抗胃癌的分子作用机制的研究较少。网络药理学是基于TCMSP平台，通过数据整合与分析，阐明中药有效活性成分、靶点、疾病之间的复杂的交互网络关系，为中药分子药理学研究提供新思路^［7］。本研究基于网络药理学，结合生物信息学，筛选汉黄芩素抗胃癌作用的关键基因以及信号通路，并通过细胞实验对筛选结果进行初步验证，探讨汉黄芩素抗胃癌作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 汉黄芩素理化参数及作用靶点获取

利用TCMSP数据库（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索“黄芩”，选择主要活性成分“汉黄芩素”，获得该化合物的理化参数及特征信息，并获取相应的蛋白靶点，通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），查询相对应的靶基因。

1.2 胃癌疾病靶点获取

以“gastric cancer”“gastric carcinoma”“gastric adenocarcinoma”为胃癌疾病关键词输入Genecards数据库（http：//www.genecards.org/）中，筛选与胃癌密切相关的靶点，以Relevance Score>5为筛选条件。

1.3 汉黄芩素与胃癌交集靶点获取及PPI网络构建

利用R语言Venn图工具包，取得汉黄芩素作用靶点和胃癌相关靶点交集部分，获得其共同靶点，绘制Venn图。将共同靶点导入STRING12.0数据库中（https：//cn.string-db.org/）构建蛋白互作网络，并下载TSV文件，导入Cytoscape3.7.0行可视化分析，根据PPI网络中靶点的度值（degree值：与网络中靶点的关键性呈正相关）筛选核心靶点。

1.4 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）信号通路富集分析

将汉黄芩素和胃癌的共同靶点导入KOBAS数据库（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）进行KEGG通路富集分析，根据P值筛选出靶点富集的相关信号通路（P<0.01），进而通过Cytoscape软件绘图。

1.5 细胞实验

1.5.1 细胞、试剂和仪器

人胃癌细胞（SNU-5）购自江苏凯基生物技术有限公司，IMDM培养基，胎牛血清（美国Gibco公司），TRIzol（美国Invitrogen 15596-026），氯仿、异丙醇（中国 南京化学试剂有限公司），70%乙醇（DEPC处理）、0.1% DEPC Water、PBS（中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGDN6、KGDN4500、KGB500），cDNA第一链合成试剂盒（日本TaKaRa RR036B），TB Green^® Premix Ex Taq™ Ⅱ （Tli RNaseH Plus） （日本TaKaRa RR820A），汉黄芩素（曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%），96孔细胞培养板（美国Corning Incorporated 3599），CCK-8（日本DOJINDO Laborataries CP736），生物倒置显微镜（日本OLYMPUS IX51），酶标仪（美国BioTek ELx800），荧光定量PCR循环仪（美国ABI Step one plus Real time-PCR system）。

1.5.2 细胞培养

SNU-5细胞培养于90% IMDM+10%FBS完全培养基中，于37 ℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中常规培养。

1.5.3 CCK-8法检测细胞活力

将处于对数生长期的SNU-5细胞消化、计数、配制成浓度为2×10⁵个/mL的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，将96孔板置于37 ℃，5%CO₂培养箱中培养24 h；每孔加入100 μL相应的含药培养基（药物浓度分别为10、20、40、80、160、320 μM），同时设立阴性对照组，加药24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，在培养箱继续培养2 h，摇床轻轻混匀10 min，于λ=450 nm处，使用酶标仪测定光密度（OD值），计算抑制率及药物IC₅₀。

1.5.4 RT-qPCR检测细胞中AKT1及P53 mRNA的表达

取对数生长期细胞，按照2×10⁵个/mL的细胞进行铺板，过夜培养后，更换含不同浓度汉黄芩素（0，1/2IC₅₀，IC₅₀ μM），培养24 h，弃去培养上清，PBS清洗2次。用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，在试剂盒说明书操作下，将RNA逆转录生成cDNA，并进行RT-qPCR检测目的基因表达，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃持续15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，扩增40个循环。GAPDH作为内参，采用2^-ΔΔCT法进行分析。引物由江苏凯基生物技术股份有限公司负责合成，引物序列如表1所示。

1.5.5 统计学方法

采用SPSS24.0版本分析数据，实验结果用（\overline{x}±s）表示，组内两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉黄芩素理化参数及作用靶点获取

从TCMSP数据库中获取汉黄芩素药理分子特性，其口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，表明汉黄芩素吸收度好（表2）。利用TCMSP数据库检索共获得汉黄芩素45个靶点，部分基因展示见表3。

2.2 胃癌疾病靶点和汉黄芩素与胃癌交集靶点的获取，以及交集靶点的PPI网络构建

在GeneCards数据库中限定基因与胃癌的相关性评分≥5，共获得胃癌相关靶点2 404个。用R语言的Venn图工具包取汉黄芩素及胃癌靶点交集部分，共筛选出38个共同靶点（图1A）。将38个交集靶点输入STRING数据中，构建PPI网络（图1C）。将STRING数据库中下载的靶点tsv文件导入Cytoscape软件中，根据Degree值（度值），筛选关键靶点，靶点颜色越深代表其度值越高，前10关键基因包括：AKT1、TP53、CASP3、TNF、JUN、IL6、ESR1、CCND1、RELA、MAPK14（图1B、1D）。

2.3 KEGG信号通路富集分析

将38个交集靶点导入KOBAS数据库中，行KEGG信号通路富集分析，共筛选出144条信号转导通路（P<0.001）。根据P值的显著性以及与肿瘤密切相关性，显示汉黄芩素主要通过癌症相关信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、细胞凋亡信号通路以及TNF信号通路等发挥作用，并利用Cytoscape软件展示靶点基因主要富集的信号通路（图2）。

2.4 CCK-8法检测汉黄芩素对SNU-5细胞活性的影响

用汉黄芩素处理SUN-5细胞24 h后，检测结果发现，汉黄芩素能够抑制胃癌细胞的生长增殖，且呈浓度依赖性（P<0.05）。汉黄芩素对胃癌细胞的IC₅₀为91.36 μM（图3）。

2.5 汉黄芩素对SUN-5细胞中AKT1、TP53 mRNA表达的影响

PCR实验结果显示，在SUN-5细胞中，与对照组相比，1/2 IC₅₀和IC₅₀浓度的汉黄芩素干预下能够下调AKT1基因表达，上调TP53基因表达水平（P<0.001，图4）。

3 讨论

胃癌是一种多因素相关疾病^［8］，胃癌的中医药防治是我国特色及优势，具有积极作用^［9-10］。中药抗胃癌有效成分包括以下几类：中药提取物、黄酮类、生物碱、酯类、皂苷、多糖、酚类等成分^［11］。研究表明，西黄浸提液可下调B细胞淋巴瘤/白血病基因2及上调Bcl-2关联X蛋白基因的表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖^［12］。三七总皂苷可通过调控胃癌细胞周期及诱导细胞凋亡，抑制细胞的增殖^［13］。蒲公英提取物通过下调胃癌细胞LIM结构域蛋白激酶1，基质金属蛋白酶9表达，抑制细胞侵袭及迁移能力^［14］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）是一条重要的信号通路，有研究^［15］发现，红景天苷可通过调控PI3K/Akt通路转导，抑制胃癌细胞的迁移与增殖。所以中药有效成分通过不同的靶点及相关信号通路发挥抗胃癌的机理、机制的研究具有重要意义。

黄芩是多年生草本植物，主要活性成分为黄酮及糖苷^［16］，具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用，可通过调控细胞血管生成、凋亡、增殖以及侵袭等发挥抗肿瘤作用^［17］。汉黄芩素作为黄芩的主要活性成分之一，具有广谱的抗肿瘤活性，其可通过调节生长因子、蛋白激酶、转录因子等多个靶点，调控细胞周期、自噬、凋亡及免疫细胞浸润等进程而发挥抗肿瘤作用^［6］。研究^［18］表明，汉黄芩素可通过调控单羧酸转运蛋白4及缺氧诱导因子-1α表达，介导unc-51样自噬激活激酶1及c-Jun氨基末端激酶的磷酸化^［19］，及参与核因子-κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）相关通路^［20］，抑制胃癌细胞增殖，增加肿瘤细胞对药物的敏感性。

本研究基于网络药理学筛选出汉黄芩素相关靶点，经PPI网络筛选出AKT1、TP53、CASP3、TNF、JUN等关键基因是汉黄芩素抗胃癌的主要作用靶点。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种主要功能亚型，是PI3K信号通路的核心分子，可通过下游靶基因，双微体同源基因2（murine double minute 2， MDM2）、mTOR、NF-κB抑制细胞凋亡^［21］。AKT1在多种肿瘤中表达上调，促使肿瘤细胞增殖、迁移、新血管生成，增加肿瘤细胞耐药的发生^［22-24］。汉黄芩素可通过抑制PI3K/Akt信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖^［25］。大部分肿瘤中存在TP53突变^［26］。TP53的突变频繁预示不良的生存^［27］。Caspase-3是一种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，活化的Caspase-3可以降解细胞内结构蛋白和功能蛋白，诱导细胞死亡，被认为是凋亡的关键蛋白^［28］。研究^［30］发现，青蒿素^［29］及黄酮类化合物水飞蓟宾等可通过介导Caspase-3的表达，调控胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭等发生。TNF是肿瘤坏死因子，具有多种生物活性的细胞因子，对肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用。研究发现，TNF-α可介导PTX3的表达，促进胃癌细胞侵袭、转移^［31］。七指蕨乙酸乙酯提取物通过下调TNF-α表达，激活环氧合酶-2/胞质磷脂酶A2/前列腺素E2通路发挥抗胃癌作用^［32］。c-JUN是肿瘤中经典的转录因子，可调节肿瘤细胞的生长、迁移、增殖、分化和凋亡等多种细胞功能^［33-34］。Torben等人^［35］发现，JUN可通过对衰老和炎症相关基因的转录调节，起到抑制及减缓肿瘤的作用。C-Jun可直接调控FOXK1促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移^［36］。

KEGG分析结果显示靶基因主要富集在PI3K-Akt、p53以及癌症相关等信号通路。PI3K/Akt和p53信号通路是细胞中极为重要的两种信号调节通路，信号通路的平衡与肿瘤发生、发展及肿瘤细胞耐药等密切相关^［37-39］。PI3K/Akt信号通路可通过MDM2介导P53降解，负性调控P53表达水平^［30-40］；相反，又可通过10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN）/PI3K/Akt信号通路促进P53稳定表达，起到正性调控作用；两者之间的平衡，在肿瘤发生、发展以及预后中发挥极为重要的作用^［31］。有趣的是，汉黄芩素可促使P53发生乙酰化和磷酸化，阻止MDM2介导的P53泛素化降解，从而提高P53表达水平^［41］。而本研究中，结果显示汉黄芩素可抑制AKT1表达，提高p53的稳定表达，是汉黄芩素抗胃癌作用的关键机制，可能通过PI3K/Akt和p53信号通路发挥作用。

作者通过细胞实验初步验证了网络药理学的筛选结果，汉黄芩素提取物具有抑制胃癌细胞增殖作用，在汉黄芩素干预下，胃癌细胞中TP53表达呈稳定上调，AKT1表达水平下降，与上述研究结果相一致，进一步表明AKT1、TP53是汉黄芩素抗胃癌的潜在作用靶点，可能通过调控PI3K/Akt及P53信号通路发挥其抗肿瘤作用。通过以上分析可得知，汉黄芩素抗胃癌作用机制具有多靶点、多通路的特点，通过汉黄芩素发现抗胃癌的新靶点，促进中药有效成分的开发和研究，为治疗胃癌提供新的途径。本研究仅基于网络药理学及初步的细胞实验研究，验证汉黄芩素抗胃癌的潜在作用靶点及可能的分子机制，存在一定的局限性，需要进一步研究。

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基金资助

广西中医药大学校级课题基金项目(2020QN023)