基于ENCORI数据库分析LINC00963在结肠腺癌中的表达及作用

Analysis of the expression of LINC00963 in colon adenocarcinoma based on ENCORI database

摘要

目的 探究长基因间非编码RNA 00963（long intergenic non coding RNA 00963，LINC00963）在结肠腺癌中的表达水平及其作用机制。 方法 使用ENCORI数据库的不同功能模块，分析LINC00963在不同类型消化系统肿瘤中的表达水平，并筛选出结肠腺癌中可能的下游靶基因，利用GO功能富集分析和KEGG通路富集探讨LINC00963的可能作用机制；同时分析了富丝氨酸和精氨酸的剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1，SRSF1）在结肠腺癌中的表达水平及预后，并分析了LINC00963与SRSF1的相关性。 结果 LINC00963在结肠腺癌中高表达，其作用机制主要集中于mRNA剪切体的形成过程，与mRNA监视等相关通路有关，可促进肿瘤的发生，与患者的不良预后呈正相关。SRSF1在结肠腺癌中呈高表达，其高表达者有良好的预后。 结论 LINC00963在结肠腺癌中呈高表达，拮抗了SRSF1的抑癌作用，促进肿瘤的发生发展。

Abstract

Objective To explore the expression level and mechanism of action of long intergenic non-coding RNA 00963 （LINC00963） in colon adenocarcinoma. Methods Different functional modules of the ENCORI database were used to analyze the expression level of LINC00963 in various types of digestive system tumors， and potential downstream target genes were screened in colon adenocarcinoma. GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were conducted to explore the possible mechanism of action of LINC00963. Meanwhile， the expression level and prognosis of serine and arginine rich splicing factor 1 （SRSF1） in colon adenocarcinoma were investigated， and the correlation between LINC00963 and SRSF1 was analyzed. Results LINC00963 was highly expressed in colon adenocarcinoma， and its mechanism of action mainly focused on the formation process of the mRNA splicing body， related to mRNA surveillance and other pathways， promoting tumor occurrence and being positively correlated with poor prognosis. SRSF1 was highly expressed in colon adenocarcinoma， and high expressive patients had a favorable prognosis. Conclusion LINC00963 was highly expressed in colon adenocarcinoma， antagonizing the tumor suppressor effect of SRSF1 and promoting tumor occurrence and development.

Graphical abstract

关键词

结肠腺癌 / LINC00963 / SRSF1 / ENCORI数据库

Key words

Colon adenocarcinoma / LINC00963 / SRSF1 / ENCORI database

消化系统肿瘤是影响人类健康的一类重要疾病，其发病部位涵盖胃、肠道、肝脏、胆囊和胰腺等多个组织器官^［1］。结肠腺癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率在我国呈逐年上升趋势，成为重大公共卫生问题之一^［2］。结肠腺癌早期诊断及预后研究的核心是探索有效的生物标志物，以便临床准确诊断和治疗康复，及预后评估^［3］。

根据结构和功能的不同，RNA可以分为编码RNA和非编码RNA两类^［4-5］。非编码RNA又可以分为非编码大RNA和非编码小RNA两类，前者包括核糖体RNA和长链非编码RNA（long non coding RNA，lncRNA），后者包括转移RNA、核酶、小分子RNA等^［6-7］。lncRNA是长度大于200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子，主要通过参与染色体重塑和基因表达调控来影响细胞的增殖、分裂和凋亡^［8］。lncRNA可以在转录激活、转录抑制、基因印迹、染色质修饰等过程中发挥重要作用，从而影响肿瘤的发生和发展^［9］。现在普遍认为，lncRNA作为细胞状态的特异标记分子和细胞活化程序的特定信息，可以用来识别包括肿瘤细胞在内的多种类型细胞的生理病理特征，因而具有临床诊断治疗和预后预测价值^［10-11］。

长基因间非编码RNA 00963（long intergenic non coding RNA 00963，LINC00963）也称为Meta Lnc9，位于人类染色体9q34.11上，长度约为2.1 kb^［12］。异常表达的LINC00963通过调节多种细胞过程（如增殖、迁移、侵袭、EMT和凋亡）发挥致癌作用^［13］。本文通过ENCORI数据库分析LINC00963在结肠腺癌中的表达及可能的下游调控机制，旨在为其治疗及预后预测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 LINC00963在不同消化道肿瘤中的表达

在ENCORI（Encyclopedia of RNA Interactomes）数据库（https：//rnasysu.com/ encori） Pan-Cancer分析模块中选择“Gene Differential Expression”，以“LINC00963”为关键词检索，得到LINC00963在食管癌、胰腺癌、胆管型肝癌、胃腺癌、肝细胞癌和结肠腺癌中的表达数据，在Pan-Cancer分析模块中选择 “Gene Survival Analysis”检索LINC00963表达差异最显著的结肠腺癌的治疗预后。

1.2 LINC00963相关机制分子筛选

在ENCORI数据库RNA-RNA分析模块中选择“lncRNA-RNA”，在QueryGene栏以“LINC00963”关键词进行检索，得到LINC00963可能直接结合的下游RNA靶点；在RBP-Target分析模块中选择“RBP-lncRNA”，以“LINC00963”为关键词在Target Gene栏检索，得到LINC00963可能结合的上游调控基因。

1.3 LINC00963相关靶基因生物学功能及通路分析

将两种方法得到的相关靶基因去重复，删除无对应名称的基因片段，得到LINC00963相关基因。利用信息注释数据库DAVID （https：//david.ncifcrf.gov）对所有基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，筛选可能的作用机制。

1.4 LINC00963及其下游靶基因SRSF1的相关性分析

通过GO功能富集分析发现LINC00963与SRSF1（serine and arginine rich splicing factor 1，富丝氨酸和精氨酸的剪接因子）相互作用较密切。利用ENCORI数据库Pan-Cancer分析模块中“RNA-RNA CoExpression”分析LINC00963和SRSF1基因在不同消化系统肿瘤中的相互关系。

1.5 SRSF1基因在消化系统肿瘤中的表达及预后分析

通过ENCORI数据库Pan-Cancer分析模块中选择“Gene Differential Expression”分析SRSF1在不同消化系统肿瘤中的表达，同时利用Pan-Cancer分析模块中“Gene Survival Analysis”分析SRSF1在不同消化系统肿瘤中的预后。

1.6 差异基因计算方法

在ENCORI数据库Pan-Cancer分析模块中，通过TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov）获得各种肿瘤的表达数据，每个基因的表达值由RNAseq数据通过log₂（FPKM+0.01）获得。

2 结果

2.1 LINC00963在结肠腺癌中的表达与预后

ENCORI数据库“Gene Differential Expression”分析结果显示，与正常对照组相比较，LINC00963在食管癌（Fold change=1.10，P>0.05）、胰腺癌（Fold change=0.88，P>0.05）和胆管型肝癌（Fold change=1.32，P>0.05）中的表达水平无显著变化（图1A-C），在胃腺癌（Fold change=1.20，P<0.05）表达水平略有升高（图1D），而在肝细胞癌（Fold change=1.46，P<0.001）和结肠腺癌（Fold change=1.96，P<0.001）中均显著高表达（图1E、F）。Gene Survival Analysis ”分析结果显示，LINC00963在结肠腺癌中的表达水平与患者的不良预后相关，高表达组的预后结果较差，而低表达组的预后结果显著高于高表达组（P<0.05），且LINC00963的Hazard Ratio值为1.49，表明LINC00963表达促进了结肠腺癌的发生发展，是一种肿瘤发生的危险因子（图1G）。

2.2 LINC00963相关靶基因功能富集分析

通过“LncRNA-RNA”和“RBP-lncRNA”两种分析，得到LINC00963相关基因共438个，GO功能富集分析发现这些基因主要集中在mRNA加工、剪切和运输等生物学过程（图2A），KEGG信号通路富集分析发现这些基因主要涉及剪切体形成、核质运输及mRNA监视等相关信号通路（图2B），表明LINC00963主要参与基因转录和转录前的调控过程。

KEGG信号通路富集结果显示，参与调控“Spliceosome”形成过程通路的基因比例最高且差异显著，我们发现其中SRSF1基因在GO功能富集分析的多条功能中富集，提示其参与多项生物学过程，因此我们对SRSF1基因展开了进一步分析。

2.3 SRSF1在结肠腺癌中的表达与预后

“Gene Differential Expression”分析结果显示，SRSF1在结肠腺癌中的表达水平显著高于正常样本（Fold change=1.46，P<0.001，图3A）。“Gene Survival Analysis”分析表明，SRSF1高水平表达具有较好的预后（P<0.01，图3B），且其Hazard Ratio为0.56，小于1，显示SRSF1高水平表达的结肠腺癌患者死亡的风险要远远低于SRSF1低水平表达的患者，暗示SRSF1可以抑制结肠腺癌的发生发展，有望作为诊断和治疗的潜在标志物。

2.4 LINC00963与SRSF1在结肠腺癌中的相关性

“RNA-RNA CoExpression”分析显示，在结肠腺癌中LINC00963和SRSF1两个基因的表达显著负相关（r=-0.195，P<0.001，图4），而在食管癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管型肝癌和胃腺癌等其他消化系统肿瘤中未见明显相关性。结合它们在结肠腺癌患者的预后差异，认为LINC00963和SRSF1在结直肠癌的发生发展过程中的作用恰恰相反，提示二者的生物学功能具有一定的拮抗关系，且这种拮抗具有肿瘤类型的特异性，并不适用所有的类型，其详细生物学过程和信号转导通路仍需进一步深入探讨。

3 讨论

结肠腺癌是影响我国人民生命健康的恶性肿瘤之一，提升早期诊断率和准确预后预测是当前结肠腺癌研究和治疗的重要方向。lncRNA的表达或功能异常表现为lncRNA序列和空间结构上的变化，表达水平的改变及其与结合蛋白相互作用的异常，这些变化与人类疾病的发生密切相关，对人类健康构成严重威胁^［14］。

LINC00963可以促进多种实体瘤^［15-18］和血液肿瘤^［19］的发生发展，主要定位于细胞质^［20-21］发挥功能。本文通过ENCORI数据库分析了LINC00963在消化道肿瘤中的表达水平，发现LINC00963在结肠腺癌和肝细胞癌中均为高水平表达，在胃腺癌中表达水平略有升高，但不显著，而在食管癌、肝胆管型肝癌和胰腺癌中的表达没有明显差异。LINC00963参与的调控通路主要集中在mRNA相关生物过程，如mRNA的加工、剪切和运输等。其中LINC00963和SRSF1在多条通路中都有相互作用。

SRSF1是一种RNA结合蛋白，在多数组织中都有丰富表达^［22］。它是serine/arginine-rich家族RNA结合蛋白的典型成员，这个家族成员共享包含一个RNA识别基序和一个富含Ser-Arg二肽重复的C末端域的结构模块^［23］。SRSF1是一种必需基因，敲除后将导致小鼠胚胎致死^［24］。SRSF1最初被认为是一个剪接因子^［25-26］，参与了构成性和选择性前mRNA的剪接，SRSF1还在RNA代谢中发挥作用，如剪接调节、mRNA转录、稳定性、核输出、翻译、无意义介导的mRNA降解、sumoylation和miRNA处理。SRSF1通过结合RNA特定序列，直接影响剪接位点的活性，在免疫细胞活化和自身免疫疾病中扮演重要角色^［27］。SRSF1还与染色体相关联，以细胞周期特异性的方式富集在活跃基因位点，可能通过其招募到活跃染色质位点的功能参与转录调控。可以说SRSF1是一个在基因表达和免疫调节中扮演“主开关”角色的关键因子。

通过ENCORI数据库的相关数据分析发现，在结肠腺癌中LINC00963与SRSF1之间存在功能负相关（r=-0.195），作用显著（P<0.001），表明两者可能在某些生物学过程中存在一定程度的拮抗作用。提示LINC00963可能抑制了SRSF1在结肠腺癌中免疫调节的开关作用，降低后者对肿瘤发生的阻滞作用而促进结肠腺癌的发生。

综上所述，LINC00963在结肠腺癌中高表达，抑制了相关肿瘤保护因子的抑瘤作用而促进了癌症的发生，这种表达模式表明LINC00963有望成为一种潜在的肿瘤标志物，利于结肠腺癌的临床诊断和患者预后评估。

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基金资助

博士科研启动基金(YDBK2018-57)

延安大学产学研项目(YAU202408266)