新型铁死亡抑制剂的合成及其对脊髓损伤的治疗作用

Synthesis of a novel ferroptosis inhibitor and its therapeutic effect on spinal cord injury

摘要

目的 探讨新型铁死亡抑制剂B3对爱拉斯汀（Erastin）诱导的PC12细胞铁死亡及其对SD大鼠脊髓损伤的影响。 方法 通过有机化学方法合成一种新型铁死亡抑制剂B3，使用¹H、¹³C NMR和高分辨质谱等方法表征其结构。采用CCK8法检测B3对Erastin诱导的PC12细胞铁死亡的抑制作用；采用GSH、MDA、Fe²⁺试剂盒分别检测PC12细胞与SD大鼠脊髓组织内GSH、MDA以及Fe²⁺含量；采用双氯荧光素（dichlorofluorescein， DCFH-DA）、BODIPY-c11分别检测PC12细胞胞内总ROS以及细胞内膜ROS水平；通过DPPH法检测B3抗氧化活性，Fe²⁺螯合法检测B3铁螯合性，细胞特异性实验评估B3是否单一抑制Erastin诱导的PC12细胞铁死亡。使用BBB评分评价SD大鼠运动功能恢复，HE染色评价SD大鼠组织病理学变化。 结果 B3能显著抑制Erastin诱导的PC12细胞的铁死亡，EC₅₀值为（2.43±0.27）nM，是铁死亡抑制剂铁抑素-1（Fer-1）的16倍（EC₅₀=39.92±0.98 nM）。B3具有抗氧化性（P<0.000 1），不具备Fe²⁺螯合性。Erastin诱导PC12细胞铁死亡后，GSH水平降低（P<0.001），Fe²⁺水平升高（P<0.001）、MDA水平升高（P<0.01）、ROS水平升高（P<0.000 1）。B3以浓度依赖性方式显著升高GSH水平（P<0.01或P<0.05），降低Fe²⁺水平（P<0.001），降低MDA水平P<0.01，降低ROS水平（P<0.000 1或P<0.001）。在SD大鼠脊髓损伤模型中，B3处理组大鼠的运动能力显著增强（P<0.01），脊髓组织损伤明显恢复。此外，脊髓损伤后，脊髓组织中GSH水平降低（P<0.000 1），Fe²⁺和MDA水平升高（P<0.000 1）。B3显著升高GSH水平（P<0.000 1），降低Fe²⁺和MDA水平（P<0.000 1）。 结论 化合物B3是一种高效的铁死亡抑制剂，有望进一步开发为脊髓损伤治疗候选药物。

Abstract

Objective To investigate the effect of novel ferroptosis inhibitor B3 on erastin-induced PC12 cells and its effect on spinal cord injury in SD rats. Methods A new ferroptosis inhibitor B3 was synthesized by an organic method， and its structure was characterized by ¹H， ¹³C NMR and high-resolution mass spectrometry. The CCK8 method was used to detect the inhibitory effect of B3 on erastin-induced ferroptosis in PC12 cells. GSH， MDA， and Fe²⁺ content in PC12 cells and SD rat spinal cord tissues were analyzed using GSH， MDA， and Fe²⁺ kits. Dichlorofluorescein （DCFH-DA） and BODIPY-c11 were used to detect the levels of total intracellular ROS and intracellular ROS in PC12 cells， respectively； the antioxidant activity of B3 was detected by the DPPH method， the iron chelation property of B3 was detected by Fe²⁺ chelation method， and the cell-specific experiment was used to evaluate whether B3 could inhibit elastin-induced ferroptosis of PC12 cells alone. The BBB score was used to evaluate the recovery of motor function in SD rats， and HE staining was used to evaluate the histopathological changes in SD rats.Results B3 could significantly inhibit erastin-induced ferroptosis of PC12 cells with an EC₅₀ value of 2.43±0.27 nM， which was 16 times that of the ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 （Fer-1） （EC₅₀=39.92±0.98 nM）. B3 has antioxidant activity （P<0.000 1） and does not have Fe²⁺ chelating activity. In addition， after erastin-induced ferroptosis in PC12 cells， the GSH level decreased （P<0.001）， the Fe²⁺ level increased （P<0.001）， the MDA level increased （P<0.01）， and the ROS level increased （P<0.000 1）. B3 significantly increased GSH level （P<0.01 or P<0.05）， decreased Fe²⁺ level （P<0.001）， decreased MDA level （P<0.01）， and decreased ROS level （P<0.000 1 or P<0.001） in a concentration-dependent manner. In the spinal cord injury model of SD rats， the motor ability of rats in the B3 treatment group was significantly enhanced （p<0.01）， and the spinal cord tissue injury was significantly restored. In addition， after spinal cord injury， the GSH level in the spinal cord tissue decreased （P<0.000 1）， and the Fe²⁺ and MDA levels increased （P<0.000 1）. B3 significantly increased the level of GSH （P<0.000 1） and decreased the levels of Fe²⁺ and MDA （P<0.000 1）.Conclusion B3 is a highly effective ferroptosis inhibitor and is expected to be further developed as a candidate drug for the treatment of spinal cord injury.

Graphical abstract

关键词

铁死亡抑制剂 / 吩噻嗪衍生物 / 脊髓损伤 / 神经保护

Key words

Ferroptosis inhibitors / Phenothiazine derivatives / Spinal cord injury / Neuroprotection

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的创伤性疾病，常见的原因有车祸或高空跌落等。脊髓损伤与患者高致残率及死亡率密切相关，给患者带来了严重的健康和经济负担。脊髓损伤的治疗主要包括手术治疗和抗炎为主的药物治疗，然而这些治疗方法的临床效果并不理想^［1］。因此，进一步研究脊髓损伤的病理生理学过程、探索新的治疗方法对脊髓损伤治疗具有重要的意义。

研究^［2］表明，在细胞和分子水平上调控脊髓损伤后细胞致死过程可能会产生更好的治疗效果。近年来，铁死亡与中枢神经系统疾病的研究成为热点^［3］。研究^［4］表明，脊髓损伤后，铁过载激活ROS生成、谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4（GSH/GPX4）代谢失调、脂质过氧化物积累导致脂膜恶化和铁死亡是脊髓损伤后继发性损伤的重要原因。因此，抑制脊髓细胞铁死亡，有效阻断和逆转继发性损伤过程是抑制SCI的有效治疗策略。目前，已开发出大量的小分子铁死亡抑制剂，它们大致分为两大类，即减少铁超载的铁螯合剂和防止脂质ROS积累的自由基捕获抗氧化剂。铁螯合剂常因毒性作用而限制其临床应用。近年来，抗氧化剂的开发引起广泛关注^［5］。据文献^［6］综述，吩噻嗪及其衍生物是可以抑制脂质过氧化的抗氧化剂。此外，研究^［7］报道吩噻嗪衍生物作为一类新型铁死亡抑制剂在中枢神经系统疾病方面效果显著。尽管目前已经开发出多种吩噻嗪类铁死亡抑制剂，但其中许多抑制剂活性差或存在潜在副作用，限制了进一步的临床应用。其次，吩噻嗪类衍生物在脊髓损伤治疗方面研究甚少，因此，开发新的吩噻嗪类铁死亡抑制剂用于脊髓损伤的治疗具有重要的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

2-乙酰吩噻嗪、4-甲基苯磺酰肼、3-二甲氨基-1-丙胺、Erastin和Fer-1（MCE和Sigma-Aldrich）（上海亭新化学试剂厂），薄层色板（青岛邦凯高新技术材料有限公司）。PC12神经细胞系、DMEM培养基和胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司）。脂质氧化MDA试剂盒、GSH试剂盒、Fe²⁺试剂盒、苏木精-伊红染色试剂盒（碧云天生物技术公司）。DCFH-DA活性氧检测试剂盒、BODIPY 581/591 C11活性氧检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）。其他试剂若无特别说明，均购自塞维尔科技生物公司。集热式恒温加热磁力搅拌器（型号：DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司），核磁共振谱仪（型号：AVANCE600，瑞士布鲁克），酶标仪（型号：SPECTRA MAX，美谷生物科技有限公司），荧光显微镜（型号：JY2015，上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 B3的合成

化合物1、化合物3b和化合物B3的合成路线如下：① 2-乙酰吩噻嗪和4-甲基苯磺酰肼反应生成中间体1；② 5-溴-2-氯嘧啶与3-二甲氨基-1-丙胺反应得到3b；③ 中间体1与3b偶联生成新型吩噻嗪衍生物B3。具体的合成过程如下（图1）：

① 化合物1的合成 使用250 mL圆底烧瓶，将甲苯磺酰肼（5 g， 26.8 mmol， 1 eq）加入到含有2-乙酰吩噻嗪（6.48 g， 26.8 mmol， 1 eq）的甲醇（150 mL）溶液中， 65 ℃下搅拌反应4~5 h，使用薄层色谱法监测反应进程。待反应完全后通过减压除去多余的溶剂。

② 化合物3b的合成 使用100 mL圆底烧瓶，将5-溴-2-氯嘧啶（5 g， 31 mmol， 1 eq）溶于乙醇中，然后加入3-二甲氨基-1-丙胺（3.9 mL，31 mmol， 1 eq），再将三乙胺（8.6 mL， 85 mmol， 2 eq）溶于反应混合物中，加热至90 ℃反应2 h。反应结束后，使用乙酸乙酯和饱和盐水萃取旋转蒸发浓缩反应混合物。

③ 化合物B3的合成 将化合物1（1.6 g， 3.89 mmol， 1 eq），化合物3b（1 g， 3.87 mmol， 1.2 eq），叔丁醇锂（1 g， 12.4 mmol， 2.2 eq），X-Phos（500 mg， 0.54 mmol， 0.1 eq）和三-二钯（500 mg， 1.04 mmol， 0.2 eq）共同溶解于30 mL的二氧六环中，N₂保护，100 ℃反应12 h。冷却至室温后，使用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取三次获得有机相。将有机相经浓缩后所得的混合物经（乙酸乙酯∶石油醚=1∶1）柱层析纯化。

所有反应均采用薄层色谱法监测。通过乙醇-石油醚溶液挥发法培养化合物3b的小分子晶体。四甲基硅烷作为内标，并在INOVA400液体超导核磁共振谱仪上以400 MHz和101 MHz分别记录¹H 和¹³C NMR光谱。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养与分组

将PC12细胞培养在含有10%胎牛血清、50 µg/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的DMEM培养基中，培养物在37 ℃含有5% CO₂的培养箱中生长。Ferrostatin-1 （Fer-1）是一种有效的、选择性的铁死亡抑制剂^［5］，化合物51是杨等人在先前的研究中开发出的具有吩噻嗪支架的高效铁死亡抑制剂^［7］。细胞实验分组：对照组、Erastin（5μM）组、Erastin （5 μM）+DMSO（1μM）组、Erastin （5 μM）+Fer-1（阳性对照组）（1 μM）组、Erastin （5 μM）+51（1 μM）组、Erastin （5μM）+B3（1 μM）组。

1.3.2 CCK-8法测定细胞活力

消化离心后收集培养的PC12细胞，分别以每孔3 000个细胞的浓度接种于96孔板中。37 ℃，5% CO₂孵育12 h，直至细胞贴壁。贴壁后，细胞使用梯度浓度（0.1 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM）Erastin、DMSO和分组中所示不同浓度梯度的Fer-1或B3联合处理细胞24 h。然后在每孔中加入10 μL CCK-8溶液（溶解在完全培养基中），继续孵育40 min后使用多功能酶标仪测定在OD_{450 nm}处的吸光度。所有数据均采用GraphPad Prism软件计算，并以对照的百分比表示相对细胞活力。

1.3.3 Erastin诱导PC12细胞铁死亡模型制备

PC12细胞以每孔3×10³个细胞接种于96孔板中。将培养物放置于37 ℃、5% CO₂培养箱孵育直到细胞贴壁。随后，用上述梯度浓度的Erastin处理细胞。经Erastin处理24 h后，采用CCK-8法测定细胞活力。

1.3.4 H₂O₂诱导PC12细胞凋亡模型和尼日利亚菌素诱导PC12细胞焦亡模型的制备

为验证B3针对Erastin诱导铁死亡的特异性，本研究利用H₂O₂诱导PC12细胞构建细胞凋亡模型，利用尼日利亚菌素（Nigercin）诱导PC12细胞构建细胞焦亡模型。PC12细胞以每孔3×10³个细胞接种于96孔培养板中。细胞贴壁后，使用H₂O₂ （10 μM）处理1 h诱导细胞凋亡，Nigercin（10 μM）处理1 h诱导细胞焦亡。

1.3.5 DPPH法检测抗氧化性

将稳定自由基1，1-二苯基-2-picrylhydrazyl（DPPH）（25 mg）溶解于甲醇（1.5 mL）中，配制成浓度为0.05 mM的DPPH溶液。将B3（12.8 mg）溶解于DMSO（0.5 mL）中配制成浓度为10 mM的B3溶液。在96孔板中每孔分别加入200 μL DPPH溶液与1 μL B3溶液，充分混合后，室温孵育10 min，酶标仪检测OD_{517 nm}处的吸光度值。实验重复三次，计算结果均值。

1.3.6 Fe²⁺螯合检测

菲咯嗪与亚铁形成有色络合物，在562 nm处出现吸收峰。将菲咯嗪（5.2 mg）溶解在（1 mL）超纯水中，最终浓度为5 mM。将FeCl₂（3.4 mg）溶解在DMSO（1 mL）中，使其最终浓度为1 mM。将B3（2.2 mg）溶解在（0.5 mL）DMSO，最终浓度为10 mM。在96孔培养板中加入5 mM菲咯嗪溶液4 μL、1 mM FeCl₂溶液4 μL和10 mM的B3溶液2 μL，用超纯水调节总体积至100 μL。以DFO与EDTA为阳性对照，超纯水为阴性对照。将溶液混合均匀后室温孵育5 min，562 nm处酶标仪测定OD值。

1.3.7 细胞丙二醛（MDA）测定

使用脂质过氧化MDA测定试剂盒测量脂质过氧化水平。根据试剂盒说明书，制备细胞样本，最后测定各样本在532 nm和600 nm处的吸光度，根据试剂盒公式计算MDA浓度。

1.3.8 细胞谷胱甘肽（GSH）水平的评估

使用总谷胱甘肽试剂盒检测谷胱甘肽水平。细胞消化离心后的沉淀中加入其3倍体积的蛋白质去除剂S溶液后破碎细胞。样品在液氮和37 ℃水浴中快速反复冻融三次。之后4 ℃下静置5 min，4 ℃ 10 000 rpm离心10 min，取上清200 μL，加入试剂盒工作液10 μL，在412 nm处测OD值。

1.3.9 细胞Fe²⁺水平测定

使用亚铁含量检测试剂盒检测亚铁含量。细胞分组处理后消化离心收集约5×10⁶个细胞，加入1 mL提取液，超声破碎细胞（冰浴，200 W功率，超声波3 s，间隔10 s，重复30次）；4 ℃，12 000 rpm离心10 min，取上清液加入试剂盒工作液，测定样品在562 nm处的OD值。

1.3.10 细胞内ROS测定

使用荧光探针2'，7'-二氯二氢荧光素（DCFH-DA）检测细胞内ROS水平。PC12细胞分别用指定浓度的B3和Fer-1处理后，与DCFH-DA（10 mM）在37 ℃、5% CO₂中孵育30 min，PBS洗涤3次。在荧光显微镜下监测细胞荧光。ROS的数量被量化为视觉区域内每个细胞DCF的相对荧光强度。

1.3.11 细胞脂质过氧化测定

使用BODIPY 581/591 C11探针检测细胞脂质过氧化水平。PC12细胞分别用指定浓度的B3和Fer-1处理后收集，根据试剂商提供的步骤加入探针在线检测。用CytExpert软件分析脂质过氧化产物含量，并输出结果。

1.4 动物实验

实验动物选取8周龄、体重（180±20）g的SPF级雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购自空军军医大学。所有实验方案均经延安大学实验动物伦理委员会批准（伦理委员会批件号：YAU-G20240120号）。将大鼠饲养在12 h昼夜交替温度20 ℃~24 ℃的环境中，人工提供充足的饲料和水。

1.4.1 脊髓损伤模型建立及药物治疗

① 模型建立 适应喂养一周后，将24只SD大鼠随机分为4组（n=6），分别为：假手术（Sham）组、模型（SCI）组、阳性对照组（Fer-1）和实验组（B3）。采用Allen’s法制备SCI模型^［8］：10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔内注射麻醉建立大鼠脊髓损伤模型，仰卧位，以T10为中心纵切口，显露T9-T11脊柱。用HI-0400（PSI）脊髓打击装置，将大鼠俯卧位置于装置桌面，打击力设置为200 kdyn/cm²，打击点以T10为中心，建立大鼠急性脊髓损伤模型。大鼠出现痉挛性摇尾、下肢痉挛性震颤和脊髓充血，认为模型制备成功^［8］。Sham组仅切除棘突和椎板。造模成功后，缝合切口，肌内注射青霉素（20万u/mL）0.5 mL，预防感染。并通过手动挤压膀胱促进大鼠排泄。Fer-1、B3溶解于含2.5%Tween-80的生理盐水，浓度均为1.5 mg/mL。Fer-1组、B3组大鼠于术后12 h尾静脉注射Fer-1、B3 5 mg/kg，1次/24 h，连续治疗28 d。其中，治疗3 d后，各组取出3只SD大鼠制备脊髓组织样本进行MDA、Fe²⁺、GSH的检测。

1.4.2 运动功能评估

运动功能评估采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分，总分为21分，根据大鼠后肢的神经运动功能判断^［9］：将大鼠放置于90 cm场地内自由行走5 min，密切观察后肢运动及协调性。评分范围为0~21分，后肢瘫痪无运动功能为0分，功能和运动完全正常为21分，运动功能与评分呈正相关，得分越高代表脊髓损伤后神经功能恢复越好。为有效减少主观偏差，采取单盲实验（评估人员不了解大鼠实验情况），分别于伤前、伤后第1 d、7 d、14 d、21 d、28 d进行上述评价。重复评估3次并立即记录。

1.4.3 组织学

① 组织标本的制备：术后第28天，10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后打开胸腔，行主动脉插管，止血钳固定。切断右心耳，观察有静脉血流出，立即用灌注针向主动脉注射生理盐水，待流出液清亮后，将灌注液换为4%多聚甲醛。多聚甲醛灌注速度由快到慢，先快速灌注50 mL后，减慢速度并缓慢维持，连续灌注至四肢及全身肌肉连续抽搐。取损伤点上下2 cm处的脊髓，用4%多聚甲醛固定48 h，梯度脱水后石蜡包埋，切片厚度7 μm。② HE染色：将切片用100%二甲苯脱蜡，在梯度浓度（100%、95%、80%、70%）的酒精中水合。使用苏木精-伊红染色试剂盒按说明进行染色，然后梯度酒精（100%、95%、80%）脱水，用100%二甲苯透明，最后用中性黏合剂封口。使用显微镜（×100）观察染色图像。

1.4.4 组织丙二醛（MDA）测定

根据试剂盒说明制备脊髓组织样本，检测方法同1.3.7。

1.4.5 组织谷胱甘肽（GSH）测定

50 mg脊髓组织在液氮中快速冷冻后，每10 mg组织加入30 mL蛋白质去除剂S溶液后研磨。在4 ℃下静置10 min，4 ℃、10 000 rpm离心10 min。取上清液加入工作液，412 nm处测定样品OD值。

1.4.6 组织Fe²⁺水平测定

根据试剂盒说明制备脊髓组织样本，检测方法同1.3.9。

1.5 统计学方法

使用GraphPad Prism 8.3进行统计分析。所有数据均以（\overline{x}±s）表示。采用t检验和单因素方差分析进行统计学分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 B3合成

本研究对吩噻嗪骨架上引入3-二甲氨基-1-丙胺对吩噻嗪衍生物进行结构优化，在5-溴-2-氯嘧啶与3-二甲氨基-1-丙胺反应中得到两个中间体2b和3b，进一步与甲苯磺酰肼得到终产A3和B3合成过程见图2。

2.2 化合物1、3b、B3表征

① 10.4 g黄色固体（1），收率95%。¹H和¹³C NMR数据见已发表文献^［10］。

② 11.2 g白色固体（3b），收率90%。1H NMR （400 MHz， DMSO-d₆） δ 8.36 （d，J=22.4 Hz）， 7.48 （s），3.36 （s），3.25 （s），3.06 （s），1.80 （s）.

③ X-ray晶体结构（3b）：如图2所示，3b的CIF文件可从剑桥结晶数据中心获得（CCDC：2417174）。

④ 2.12 g黄色固体（B3），产率为70%。¹H NMR （400 MHz， DMSO-d₆ ） δ 9.34 （s）， 9.12-8.99 （m）， 8.95-8.85 （m）， 7.64 （t， J=7.7 Hz）， 7.57 （d， J=7.9 Hz）， 7.41 （t， J=7.8 Hz）， 7.32 （d， J=7.1 Hz）， 6.01 （s）， 5.98 （s）， 4.31 （t， J=7.1 Hz）， 3.97 （dt， J=16.5， 8.2 Hz）， 3.74 （s）， 2.55-2.42 （m）. ¹³C NMR （101 MHz） δ 162.28， 160.18， 158.22， 143.81， 142.59， 142.31， 139.91， 128.12， 126.76， 122.79， 122.36， 122.13， 121.46， 117.01， 116.56， 115.02， 114.03， 105.25， 47.17， 40.22， 40.01， 39.80， 35.70.

2.3 B3对Erastin诱导的PC12细胞铁死亡具有抑制作用

Erastin诱导了PC12细胞铁死亡模型（IC₅₀=5.01 μM）（图3A），阳性药Fer-1（EC₅₀=2.43±0.27 nM）和化合物B3（EC₅₀=39.92±0.98 nM）抑制细胞铁死亡（图3B和3C）。结果显示，化合物B3可显著抑制Erastin诱导的PC12细胞铁死亡，且优于阳性对照Fer-1。

2.4 B3抗氧化性、Fe²⁺螯合性、对Erastin诱导的PC12细胞铁死亡的特异性

Fer-1、51和B3均表现出显著的抗氧化能力，且B3的抗氧化能力强于Fer-1和51（图4A）。Fe²⁺螯合实验结果表明，EDTA和DFS能螯合Fe²⁺，而Fer-1、51和B3不螯合Fe²⁺（图4B）。此外，为了探讨B3是否特异性抑制Erastin诱导的细胞铁死亡，进一步研究了B3对细胞凋亡和细胞焦亡的影响，结果显示，B3均不能挽救H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡和尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡（图4C）。

2.5 B3对Erastin诱导的PC12细胞ROS的影响

图5A中的荧光数据显示，Erastin处理的PC12细胞中DCF荧光强度增加。但与Fer-1或化合物B3共孵育后，与Erastin组相比，PC12细胞中DCF荧光强度显著降低，这表明化合物B3与Fer-1类似，具有减轻Erastin诱导的PC12细胞ROS水平升高的能力。Erastin明显诱导脂质ROS的积累，Fer-1和化合物B3处理后，细胞内脂质ROS水平显著降低（图5C）。

2.6 B3对Erastin诱导的PC12细胞GSH，MDA和Fe²⁺的影响

研究评估了B3对Erastin诱导的PC12细胞内Fe²⁺、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）等脂质过氧化相关指标的水平。Erastin处理显著降低了PC12细胞中的GSH水平，提高了Fe²⁺和MDA水平，化合物B3共孵育使得GSH水平显著增加，且呈剂量依赖性（图6A）。此外，化合物B3有效地减轻了Erastin诱导的Fe²⁺和MDA水平的升高（图6B和6C）。

2.7 B3对脊髓损伤后大鼠运动功能的影响

图7为Sham、SCI、SCI+Fer-1、SCI+B3四组SD大鼠建模手术前后的BBB评分。造模前Sham、SCI、SCI+Fer-1、SCI+B3组大鼠的BBB评分无差异；造模手术后即刻评分，Sham组大鼠的BBB评分为20分，SCI、SCI+Fer-1、SCI+B3三组大鼠的BBB评分均下降至0分，提示造模成功。治疗后随时间推移，SCI、SCI+Fer-1、SCI+B3三组大鼠BBB评分均有不同程度的恢复，其中SCI+B3组BBB评分显著高于SCI组，且高于SCI+Fer-1组。

2.8 B3对脊髓损伤后大鼠的组织损伤的影响

使用HE染色法观察大鼠脊髓损伤后的组织病理学变化，结果显示与SCI组相比，B3处理后脊髓细胞空泡变性、组织损伤情况明显恢复（图8）。

2.9 B3对脊髓损伤大鼠GSH、MDA、Fe²⁺水平的影响

鉴于B3显著的铁死亡抑制活性和促进脊髓损伤后大鼠的运动功能恢复能力。研究进一步检测了B3处理的SD大鼠脊髓损伤模型中的铁死亡相关标志物Fe²⁺、MDA和GSH（图9），结果显示，SCI后3 d，SD大鼠脊髓组织Fe²⁺、MDA含量升高、GSH含量降低，而B3处理组明显优于Fer-1处理组。

3 讨论

在临床实践中，脊髓损伤的治疗通常包括甲基泼尼松龙药物治疗、手术减压和物理康复^［11］。尽管有大量关于SCI的基础研究，但病理生理学变化的复杂性使得控制级联反应的发展具有挑战性，导致了不良的治疗结果。铁死亡是一种新型程序性细胞死亡，已被证明与脊髓损伤有关。铁死亡抑制剂具有治疗脊髓损伤的潜力，例如，David等人^［12］报道铁死亡抑制剂可改善脊髓损伤早期和延迟治疗后的预后。此外，铁死亡抑制还可保护血管内皮细胞并在脊髓损伤后维持血脊髓屏障的完整性。而在目前大量的已合成的铁死亡抑制剂中，具有自由基捕获抗氧化剂兼具抑制铁死亡能力强且体内毒性小。例如在RSL-3诱导的少突胶质细胞铁死亡模型中，抗氧化剂Fer-1通过抑制线粒体脂质过氧化，降低ROS和MDA浓度，恢复GSH、GPX4和铁死亡抑制蛋白1的表达来抑制少突胶质细胞的铁死亡^［13］。文献^［14］报道，吩噻嗪及其衍生物是可以抑制脂质过氧化的抗氧化剂。同时有研究表明吩噻嗪衍生物在中枢神经系统疾病中展示出了较好的铁死亡抑制效果^［14-15］，但是大多数活性不高，且吩噻嗪类铁死亡抑制剂与脊髓损伤的研究较少见。

本研究鉴于铁死亡与脊髓损伤之间的密切联系，设计合成了一种高效抗氧化的吩噻嗪类铁死亡抑制剂，为进一步提高此类化合物的铁死亡抑制活性，本研究拟通过在吩噻嗪骨架上引入了3-二甲氨基-1-丙胺进行结构优化。然而意外的是，在5-溴-2-氯嘧啶与3-二甲氨基-1-丙胺反应中得到两个中间体2b和3b，进一步与甲苯磺酰肼反应得到终产物A3和B3。研究发现，B3在Erastin诱导的PC12细胞铁死亡模型中显示出较强的铁死亡抑制活性（EC₅₀=2.43±0.27 nM），可有效地减少细胞ROS产生，降低脂质过氧化水平，此外，在SD大鼠脊髓损伤模型中也表现出良好的治疗效果。

上述研究结果表明化合物B3作为一种新型细胞铁死亡抑制剂有望用于脊髓损伤的治疗，但有待通过更多的实验来验证。此外，本项研究缺乏电镜下对脊髓组织以及发生铁死亡的PC12细胞中线粒体动态变化的观察分析，也缺乏药代动力学的相关指标，尚需今后进一步研究。

参考文献

[1] BARONCINI A， MAFFULLI N， ESCHWEILER J，et al. Pharmacological management of secondary spinal cord injury［J］. Expert Opinion on Pharmacotherapy，2021，22（13）‍：1793-1800．

[2] DE ALMEIDA F M， MARQUES S A， DOS SANTOS A C R，et al. Molecular approaches for spinal cord injury treatment［J］. Neural Regeneration Research，2023，18（1）：23-30．

[3] RATAN R R. The chemical biology of ferroptosis in the central nervous system［J］. Cell Chemical Biology，2020，27（5）：479-498．

[4] ZHOU X， HE X J， REN Y. Function of microglia and macrophages in secondary damage after spinal cord injury［J］. Neural Regeneration Research，2014，9（20）：1787-1795．

[5] VIKTORINOVA A. Future perspectives of oxytosis/ferroptosis research in neurodegeneration diseases［J］. Cellular and Molecular Neurobiology，2023，43（6）：2761-2768．

[6] FARMER L A， WU Z J， POON J F，et al. Intrinsic and extrinsic limitations to the design and optimization of inhibitors of lipid peroxidation and associated cell death［J］. Journal of the American Chemical Society，2022，144（32）：14706-14721．

[7] YANG W， LIU X L， SONG C L，et al. Structure-activity relationship studies of phenothiazine derivatives as a new class of ferroptosis inhibitors together with the therapeutic effect in an ischemic stroke model［J］. European Journal of Medicinal Chemistry，2021，209：112842．

[8] ABDULLAHI D， AHMAD ANNUAR A， MOHAMAD M，et al. Experimental spinal cord trauma：A review of mechanically induced spinal cord injury in rat models［J］. Reviews in the Neurosciences，，28（1）：15-20．

[9] SCHEFF S W， SAUCIER D A， CAIN M E. A statistical method for analyzing rating scale data：The BBB locomotor score［J］. Journal of Neurotrauma，2002，19（10）：1251-1260．

[10] BAI X Y， YANG Y L， LUO Y L，et al. Design and synthesis of sulfonamide phenothiazine derivatives as novel ferroptosis inhibitors and their therapeutic effects in spinal cord injury［J］. Bioorganic Chemistry，2024，148：107458．

[11] RIDLER C. Spinal cord injury：Insights into life expectancy after spinal cord injury［J］. Nature Reviews. Neurology，2017，13（5）：258．

[12] RYAN F， BLEX C， NGO T D，et al. Ferroptosis inhibitor improves outcome after early and delayed treatment in mild spinal cord injury［J］. Acta Neuropathologica，2024，147（1）：106．

[13] GUEST J， DATTA N， JIMSHELEISHVILI G，et al. Pathophysiology，classification and comorbidities after traumatic spinal cord injury［J］. Journal of Personalized Medicine，2022，12（7）：1126．

[14] KEYNES R G， KARCHEVSKAYA A， RIDDALL D，et al. N¹⁰-carbonyl-substituted phenothiazines inhibiting lipid peroxidation and associated nitric oxide consumption powerfully protect brain tissue against oxidative stress［J］. Chemical Biology & Drug Design，2019，94（3）：1680-1693．

[15] FAIZAN M， KUMAR R， MAZUMDER A，et al. The medicinal chemistry of piperazines：A review［J］. Chemical Biology & Drug Design，2024，103（6）：e14537．

基金资助

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