谷氨酰胺合成酶上调促发模拟失重小鼠骨骼肌萎缩的分子机制

Upregulation of glutamate-ammonia ligase promotes skeletal muscle atrophy in mice simulating weightlessness

摘要

目的 探讨尾吊模拟失重条件下肌肉萎缩的分子机制。 方法 利用3月龄的雄性C57BL/6J小鼠，分为正常单笼饲养组和模拟失重组（2 w的持续尾吊后肢去负荷干预，24 h/d），对腓肠肌进行HE和Masson染色，对比目鱼肌进行蛋白质组学检测，筛选肌肉萎缩相关分子，并进行PCR实验验证。同时利用旋转细胞培养系统（RCCS）建立模拟失重C2C12细胞模型，分为正常对照组和模拟失重组（旋转培养24 h），并对筛选的肌肉萎缩相关分子进行PCR实验验证。 结果 尾吊组小鼠的腓肠肌和比目鱼肌质量明显减低，HE染色见肌肉纤维排列紊乱、间隙增大，Maason染色见肌肉纤维化程度增加。尾吊组小鼠肌肉萎缩分子标志物含有RING和B盒结构域的E3泛素连接酶（a RING and B-box-containing E3 ubiquitin ligase 63， trim63）、F-框蛋白32（recombinant F-Box protein 32， fbxo32）表达显著上调，蛋白质组学分析显示关键蛋白谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase， Glul）表达增加5.974倍，基因表达分析结果显示Glul mRNA表达显著上调。模拟失重C2C12细胞的trim63、fbxo32和Glul表达亦均显著上调。 结论 Glul表达上调可能是促发尾吊模拟失重条件下骨骼肌萎缩的机制之一。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanism of muscle atrophy under suspended tail simulated weightlessness condition. Methods Using 3-month-old male C57BL/6J mice， divided into normal single-cage rearing group and simulated weightlessness group （2 w of continuous tail-suspension hindlimb de-loading intervention， 24 h/d）， HE and Masson staining were performed on gastrocnemius muscle， and proteomic detection was carried out on soleus muscle， to screen for molecules related to muscle atrophy and validate them by PCR experiments. At the same time， the RCCS system was used to establish a simulated weightlessness C2C12 cell model， they were divided into a normal control group and a simulated weightlessness group （cultured for 24 h） ， and the screened muscle-related atrophy molecules were verified by PCR experiments. Results Gastrocnemius and soleus muscle mass of mice in the hanging tail group were significantly reduced， and HE staining showed disorganized arrangement of muscle fibers and increased interstitial space， and Maason staining showed increased degree of muscle fibrosis. The expression of molecular markers of muscle atrophy， a RING and B-box-containing E3 ubiquitin ligase 63 （trim63） and recombinant F-Box protein 32 （fbxo32）， was significantly up-regulated in mice in the hanging tail group， and proteomic analysis showed a 5.974-fold increase in the expression of the key protein， glutamate-ammonia ligase （Glul）， and the mRNA results showed a significant up-regulation of the expression level of Glul. Simulated weightless C2C12 cells showed significant up-regulation of the expressions of trim63， fbxo32 and Glul. Conclusion Up-regulation of Glul expression may be one of the mechanisms promoting skeletal muscle atrophy under weightlessness conditions simulated by hanging tails.

Graphical abstract

关键词

失重 / 骨骼肌 / 骨骼肌萎缩 / 谷氨酰胺合成酶

Key words

Weightlessness / Skeletal muscle / Skeletal muscle atrophy / Glul

在太空飞行期间，航天员暴露于失重环境中，因受到宇宙辐射、禁闭、睡眠剥夺、营养改变、航天器上高浓度的CO₂等因素的影响^［1］，会导致其发生肌肉萎缩、心血管失调、骨质流失、中枢神经系统受损、癌症风险增高^［2-3］。因此，空间站相关的长期太空飞行给航天员的身体、心理带来极大的挑战。其中，骨骼肌肌肉萎缩发生最早且最明显。人类骨骼肌约占总体重的40%，含有50%~75%的身体蛋白质，是人体最大的蛋白质储存库。作为机体能量代谢的核心场所，骨骼肌不仅是葡萄糖代谢的主要调节器官，在饥饿状态下还会通过分解代谢产生氨基酸和乳酸，用于肝脏和肾脏的糖异生^［4］。近年大量研究发现，骨骼肌具有分泌活性物质的功能，其收缩可刺激肌浆网合成和释放分泌类激素因子，通过这些因子与脂肪组织、肝脏、心血管等诸多组织器官发生相互作用，进而影响其新陈代谢^［5］。长期太空飞行以及地面模拟失重会导致严重的肌肉萎缩和无力，特别是下肢肌肉会快速消耗和功能丧失^［6］。在当前的航天飞行中物理锻炼作为主要防护策略以对抗微重力带来的影响，而未来人类进一步的深空探索任务，例如前往月球或火星，对太空失重条件下肌肉萎缩的防护提出了更高的要求。本研究采用小鼠尾吊模型模拟太空失重状态，旨在运用蛋白组学分析深入探究其肌肉萎缩的机制，为制定有效的防护措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

C57BL/6J雄性小鼠（SPF级），购自北京维通利华实验动物技术有限公司。本研究选用3月龄C57BL/6J雄性小鼠20只，模拟失重小鼠（HU 2 w，n=10）给予2 w持续尾吊后肢去负荷（24 h/d）进行干预；对照组小鼠（Con，n=10）进行正常单笼饲养。动物可以自由获取食物和水，饲养于12 h光照/12 h黑暗、22~24 ℃环境下。所有实验程序均按照空军军医大学实验动物中心福利与伦理委员会进行，动物伦理批准号（No.20230029）。

1.1.2 细胞

用小鼠成肌细胞（C2C12，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号SCSP-505）构建模拟失重细胞模型。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养细胞，使用RCCS旋转细胞培养系统（Synthecon）旋转培养24 h，对照组细胞孵育于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中。胎牛血清购自武汉普诺赛公司。

1.2 方法

1.2.1 病理学染色

将造模成功的小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉。待小鼠进入深度麻醉，仰卧位固定于手术台，解剖取材小鼠双侧腓肠肌、双侧比目鱼肌。将组织浸没在4%多聚甲醛中，4 ℃固定24 h，经梯度酒精脱水，二甲苯处理后，石蜡包埋、切片，切片厚度为5 μm。进行HE染色观察肌肉形态变化及Masson染色观察肌肉纤维化程度，采用光学显微镜进行拍照观察。

1.2.2 蛋白质组学及其生物信息学分析

小鼠比目鱼肌从-80 ℃取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。对蛋白溶液先以1∶50的质量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，37 ℃酶解过夜，再以1∶100的质量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，继续酶解4 h，酶解后的肽段先经由超高效液相系统分离后进timsTOF Pro质谱进行液相色谱-质谱联用分析。

对蛋白组学获得的结果进行生物信息学分析。其中GO注释使用InterProScan（v.5.14-53.0，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）软件，KEGG注释使用KAAS（v.2.0，http：//www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main）软件和KEGG Mappe（V2.5，http：//www.kegg.jp/kegg/mapper.html）软件，富集分析使用Perl module（v.1.31，https：//metacpan.org/pod/Text：：NSP：：Measures：：2D：：Fisher）软件。

1.2.3 qRT-PCR

根据Trizol试剂说明书提取腓肠肌和C2C12细胞的总RNA，用分光光度计在260 nm和280 nm处测定RNA浓度和纯度。然后用试剂盒逆转录总RNA。对小鼠腓肠肌和C2C12细胞进行qPCR测定trim63、fbxo32和Glul的转录水平。使用相对标准曲线法计算基因表达量，并用Gapdh作归一化。

1.3 统计学方法

数据处理采用GraphPad Prism 10.1.2软件，计量资料以（\overline{x}±s）表示，对于各组数据进行正态分布和方差齐性检验。符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验比较差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 模拟失重条件下骨骼肌发生萎缩

尾吊组（HU 2 w）小鼠的腓肠肌质量和比目鱼肌质量相较于Con组均显著减低（P<0.001）（图1A和图1B）。小鼠腓肠肌HE染色结果显示，持续尾吊2周（HU 2 w）后骨骼肌纤维较正常组（Con）排列紊乱，间隙增大（图1C），肌纤维横截面积显著减低（P<0.001，n=3）（图1D）。小鼠腓肠肌Masson染色结果显示，HU 2 w组骨骼肌纤维化程度较Con组明显增加（图1E）。以上结果表明，尾吊2 w后的模拟失重小鼠骨骼肌呈现明显萎缩。

2.2 模拟失重骨骼肌蛋白质组学分析结果

为筛选与模拟失重条件下骨骼肌萎缩相关的关键分子，对HU 2 w组的小鼠和Con组小鼠的比目鱼肌进行蛋白组学分析，结果显示有162个显著差异蛋白表达上调，有94个显著差异蛋白表达下调（图2A）。为进一步理解差异表达蛋白的生物学功能，利用KEGG数据库对差异表达蛋白进行了通路富集分析，图中展现了差异蛋白显著富集的功能分类或通路，纵轴为功能分类或通路，横轴数值表示差异显著性检验P值经过-Log₁₀对数转换后的值（图2B）。通过火山图可视化差异蛋白，筛选出显著上调（P<0.05，>1.5倍）和显著下调（P<0.05，<1/1.5倍）的蛋白。图中红色点表示显著差异表达上调蛋白，蓝色点表示显著差异表达下调蛋白（图2C）。KEGG通路富集分析显示，谷胱甘肽代谢通路在HU 2 w组中显著富集，谷氨酰胺合成酶（Glutamate-ammonia ligase， Glul）在此通路中起重要调控作用，且在火山图中Glul表现出显著上调（P<0.001，2.578 6倍）。综合KEGG通路富集和火山图结果，选择Glul作为候选分子。

2.3 mRNA水平检测

作为太空飞行的地面模拟模型，小鼠骨骼肌在尾吊2 w后形态变化明显，为验证其在分子层面发生的变化，用小鼠的腓肠肌提取mRNA，构建肌肉萎缩分子标志物fbxo32和trim63的引物序列，经过qRT-PCR实验后，发现fbxo32和trim63 mRNA表达均显著上调（图3A，3B），进一步验证了骨骼肌萎缩的发生。对经蛋白组学及KEGG分析筛选到的关键分子Glul进行mRNA水平检测，发现其表达在HU 2 w组的小鼠腓肠肌较Con组显著上调（图3C）。对上述分子在模拟失重C2C12细胞模型上进行mRNA水平表达检测后，发现fbxo32和trim63 mRNA表达均显著上调（图3D，3E），关键分子Glul表达在Clino 24 h组的C2C12细胞较Con组显著上调（图3F）。

3 讨论

骨骼肌是人体重要的器官，其在体温调节、全身代谢、运动和内脏保护中有至关重要的作用^［7-8］。骨骼肌萎缩是一种常见疾病，通常会导致肌肉量和功能的丧失，其特征是肌纤维大小和质量减少、肌纤维类型转换以及肌肉中蛋白质合成和降解之间的平衡失调^［9］。骨骼肌萎缩与各种病理状况有关，例如肌肉不活动、去神经支配、慢性炎症性疾病、糖尿病、慢性肾病、慢性心力衰竭和慢性阻塞性肺病、肌肉减少症、遗传性神经肌肉疾病和癌症恶病质等有关^［10-13］。本研究发现地面模拟失重尾吊2 w后的小鼠相较于正常组，其腓肠肌、比目鱼肌质量比下降，HE染色后骨骼肌纤维排列紊乱，Masson染色后小鼠骨骼肌纤维化程度加深，且肌肉萎缩分子标志物fbxo32和trim63表达显著增加，同时使用RCCS系统建立模拟失重C2C12细胞模型，检测后发现Clino 24 h的C2C12细胞相较于正常组，肌肉萎缩分子标志物fbxo32和trim63表达显著增加。提示在太空飞行的失重条件下，骨骼肌会发生明显萎缩，而这些将影响到航天员身体机能的正常运行。

为进一步探讨模拟失重小鼠骨骼肌萎缩的分子机制，对其比目鱼肌进行蛋白组学分析，并对显著差异蛋白进行KEGG通路富集分析，最终筛选到谷胱甘肽代谢通路的重要分子Glul显著上调可能参与失重条件下骨骼肌萎缩过程，并用qRT-PCR实验在小鼠腓肠肌和模拟失重C2C12细胞模型上验证了组学分析筛选的结果。Glul可催化谷氨酸和氨向谷氨酰胺的ATP依赖性转化^［14］，在氨和谷氨酸解毒、酸碱稳态、细胞信号转导和细胞增殖过程中发挥重要作用。

在肌肉萎缩过程中，机体的能量代谢发生改变，肌肉细胞能量供应不足^［15］，导致蛋白质分解加速，Glul上调可通过过度消耗氨合成谷氨酰胺来提供能量，但Glul的过度上调会导致氨的积累，对细胞产生毒性，增加细胞的代谢负担^［16］。另外，骨骼肌的蛋白质合成与肌肉的生长密切相关，有研究^［17］表明肌肉萎缩过程中常常伴随蛋白质降解，其主要由泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径（ALP）所介导。Glul表达上调后通过增加谷氨酰胺合成来维持氮平衡，减少肌肉蛋白质的分解。但作为一种代偿机制，长期或过度的Glul上调表达，会使肌肉处于应激状态（炎症、氧化应激等），进而促进骨骼肌萎缩和肌细胞损伤^［18-19］。谷胱甘肽是细胞内重要的抗氧化剂，参与机体抗氧化防御^［9］。当Glul上调后增加谷氨酰胺合成，而谷氨酰胺作为谷胱甘肽的前体，合成增加后可缓解机体氧化应激和炎症。但在太空失重条件下长时间的刺激，使得氧化应激和炎症的刺激持续存在，Glul表达上调可能不足以阻止肌肉萎缩，并成为肌肉损伤退化的标志。

综上所述，本研究通过对模拟失重小鼠比目鱼肌肌肉形态、肌肉质量和肌肉萎缩分子标志物的检测与分析，观察到骨骼肌发生明显萎缩；进一步通过蛋白组学分析筛选并验证了Glul上调可能与失重条件下骨骼肌肌肉萎缩的发生密切相关，并同步在模拟失重C2C12细胞模型上进行肌肉相关萎缩分子表达验证。应在后续研究中对其具体分子机制进行深入探讨，以期为太空失重环境下肌肉萎缩探寻有效的防控策略。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32371239)

国家自然科学基金项目(32071107)

陕西省重点研发计划(2024SF-YBXM-018)