基于网络药理学与体外实验探究黄伞总黄酮抗阿尔茨海默病作用机制

Mechanism exploration of Pholiota adiposa total flavonoids against Alzheimer's disease based on network pharmacology and in vitro experiments

摘要

目的 探究真菌黄伞（Pholiota adiposa）总黄酮通过线粒体途径干预阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的潜在机制。 方法 运用代谢组学分析黄伞中的总黄酮活性成分；多种数据库筛选黄伞总黄酮与AD的交集靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络以确定核心靶点，开展京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集；采用分子对接技术验证活性成分与核心靶点的结合能力；体外实验检测总黄酮的抗氧化效能以及羟自由基清除能力，评估总黄酮对小鼠小胶质细胞增殖能力的影响，通过实时荧光定量PCR法检测M1型小胶质细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，INOS）和分化簇86分子（cluster of differentiation 86，CD86）的mRNA表达情况。 结果 鉴定出黄伞含有19种总黄酮活性成分，筛选得到总黄酮活性成分与AD共149个交集靶点，确定核因子κB亚基1（nuclear factor kappa B Subunit 1，NFKB1）、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）等10个核心靶点，主要富集于线粒体功能相关信号通路。分子对接显示淫羊藿苷等成分与核心靶点结合良好。体外实验表明，黄伞总黄酮在不同浓度梯度下分别表现出总抗氧化能力和羟自由基清除能力的剂量依赖性增强（P<0.001），黄伞总黄酮能促进BV2细胞增殖并下调Aβ_25-35诱导的BV2细胞中INOS和CD86的表达（P<0.001）。 结论 黄伞总黄酮可通过多靶点和多通路机制，特别是线粒体途径干预AD，发挥神经保护作用。

Abstract

Objective To explore the potential mechanism by which total flavonoids from the fungus Pholiota adiposa interfere with Alzheimer's disease （AD） through the mitochondrial pathway. Methods Metabolomics was used to analyze the active components of total flavonoids in Pholiota adiposa； multiple databases were employed to screen the common targets of Pholiota adiposa total flavonoids and AD， a protein-protein interaction network was constructed to identify core targets， and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis was conducted； molecular docking technology was used to verify the binding ability between active components and core targets； in vitro experiments were performed to detect the antioxidant capacity and hydroxyl radical scavenging ability of total flavonoids， evaluate the effect of total flavonoids on the proliferation of mouse microglia， and real-time quantitative polymerase chain reaction （qPCR） was used to detect the mRNA expression levels of M1-type microglia markers， including Inducible Nitric Oxide Synthase （INOS） and Cluster of Differentiation 86 （CD86）. Results Nineteen active components of total flavonoids were identified in Pholiota adiposa； a total of 149 common targets between total flavonoid active components and AD were screened out， and 10 core targets including Nuclear Factor Kappa B Subunit 1 （NFKB1） and AKT Serine/Threonine Kinase 1 （AKT1） were identified， which were mainly enriched in signaling pathways related to mitochondrial function.Molecular docking showed that components such as icariin had good binding ability to core targets.In vitro experiments showed that Pholiota adiposa total flavonoids exhibited a dose-dependent increase in total antioxidant capacity and hydroxyl radical scavenging ability under different concentration gradients （P<0.001）； moreover， Pholiota adiposa total flavonoids could promote the proliferation of BV2 cells and downregulate the expression of INOS and CD86 in BV2 cells induced by Aβ_25-35 （P<0.001）. Conclusion Total flavonoids from Pholiota adiposa can interfere with AD through a multi-target and multi-pathway mechanism， especially the mitochondrial pathway， thereby exerting a neuroprotective effect.

Graphical abstract

关键词

真菌黄伞 / 总黄酮 / 阿尔茨海默病 / 网络药理学 / 分子对接 / 线粒体途径

Key words

Pholiota adiposa / Total flavonoids / Alzheimer's disease / Network pharmacology / Molecular docking / Mitochondrial pathway

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种中枢神经系统的神经退行性疾病，是痴呆症最常见的类型^［1］。据统计，在发达国家，大约10%的65岁及以上老年人正处于AD的早期阶段；而在85岁及以上的高龄老年群体中，可能处于晚期AD并呈现典型症状和体征的比例超过三分之一^［2］。AD的发病机制涉及炎症、淀粉样蛋白斑块、氧化应激以及线粒体功能障碍等多个方面，其中线粒体功能障碍^［3］在AD发病机制中扮演着关键角色。真菌黄伞（Pholiota adiposa）是一种富含黄酮类化合物的真菌，黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎和神经保护作用，越来越多的研究显示，黄酮类化合物已成为一种很有前途的神经保护剂^［4］。近年来，研究^［5］表明黄酮类化合物在干预AD方面具有显著潜力，它具有强大的抗氧化特性及抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生，可减少因氧化应激导致的细胞功能障碍。本研究采用网络药理学技术和体外实验，聚焦于真菌黄伞中的总黄酮通过线粒体途径干预AD的潜在机制，借助多种数据库和技术筛选靶点、构建“总黄酮-靶点-疾病”网络、结合分子对接并开展体外实验评估总黄酮的神经保护作用，为总黄酮干预AD提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用真菌子实体采集于陕西省延安市，菌丝体由本课题组培养，黄伞保存于中国普通微生物菌种保藏中心（北京市朝阳区中国科学院微生物研究所，保菌号：CGMCC5.2265）。

小鼠小胶质细胞BV2细胞株购自中国典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。MEM高糖培养基、青霉素/链霉素、PBS缓冲液干粉、脂多糖、羟自由基清除能力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 黄伞分离及基因背景

本课题组前期通过分离纯化真菌黄伞得到11株纯净菌株，经过分子生物学鉴定出真菌Pholiota adiposa YAHS，Pholiota adiposa YAHS全基因组测序和注释分析表明菌株YAHS基因组总大小为55.2 Mp，GC含量为48.41%。基因组包含17710个预测的蛋白质编码序列，共检测到 719个碳水化合物活性酶编码蛋白。

1.3 总黄酮的提取与鉴定

将黄伞子实体56 ℃烘箱烘干、粉碎，通过超声波仪振动30 min，加速溶剂与细胞的接触。真空抽滤后通过旋蒸提取总黄酮，重复3次；得总黄酮干粉，-20 ℃保存；将黄伞子实体总黄酮命名为黄伞总黄酮（Huang San Zong Huang Tong，HT），通过NaOH反应观察溶液颜色变化。使用芦丁对照品在波长510 nm处分别测定吸光度值，绘制标准曲线，测得总黄酮含量。

1.4 使用网络药理学预测黄酮针对AD的靶点以及通路

1.4.1 活性成分及疾病靶点获取

本研究借助TCMSP数据库、PubChem及Swiss Target Prediction，对黄伞中黄酮类活性成分靶点展开全面检索。通过在Genecards、OMIM数据库中检索“Alzheimer's disease”相关人类基因，利用微生信的韦恩图对黄酮与AD的交集靶点进行可视化分析，共获得149个交集靶点。

1.4.2 蛋白交互网络构建及核心靶点筛选

基于STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）图，并运用Cytoscape软件对PPI网络靶点分析，筛选出degree值前十的靶点作为核心靶点深入研究。

1.4.3 KEGG富集分析及化合物-靶点-通路网络图

运用DAVID数据库开展京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析，针对“HOMO.sapiens”基因注释，设定显著性P≤0.05、错误发现率（false discovery rate，FDR）截断值≤0.05，前20个KEGG通路可视化。借助Cytoscape搭建“化合物-靶点-通路网络”，涵盖黄酮类化合物、KEGG通路及相关靶基因。

1.5 枢纽靶点的基因表达模式

1.5.1 AD患者与健康人在不同部位的基因表达水平图

运用Alzdata数据库评估核心靶点的基因表达水平，分别在内嗅皮层、海马体、颞皮层、额叶皮层等脑区，呈现出基因表达水平，直观对比健康人与AD患者间的差异。基于这些基因所参与的信号通路及生物学过程，探究黄伞总黄酮通过调控线粒体功能、氧化应激等途径干预AD。

1.5.2 TOP4核心靶点在各个细胞中的表达

使用在线数据库Alzdata评估通过CytoHubba鉴定的前4个枢纽靶点分别在胎儿休眠期细胞、胎儿增殖期细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞及神经元中的表达含量，明确黄酮干预AD时可能作用的细胞类型。

1.6 通过分子对接预测活性成分与靶点蛋白之间的亲和力

本研究借助分子对接技术，探究黄酮类化合物与线粒体功能相关中心靶点的相互作用。AD的3D结构通过公共化学数据库中检索获取，而靶标的蛋白质结构通过RCSB PDB数据库获取。运用AutoDock和Pymol软件可视化对接结果和优化构象，可推测总黄酮如何影响蛋白的空间构象和功能，进而影响下游信号通路干预AD病理进程。

1.7 体外验证

1.7.1 总黄酮的羟自由基清除力（TOC）检测

清除羟自由基能力的测定采用Fenton反应试剂盒法^［6］，每个样品在536 nm波长处的吸光度平行测定3次（n=3）。

1.7.2 总黄酮的总抗氧化能力（T-AOC）检测

体外总抗氧化能力采用Fe³⁺还原试剂盒测定^［7］，每个样品在593 nm波长处的吸光度（n=3），计算总抗氧化能力。

1.7.3 SRB法检测总黄酮对BV2细胞活力的影响

为探究总黄酮对BV2细胞增殖的影响，以揭示其干预神经炎症反应的机制，通过SRB法确定总黄酮对细胞增殖的影响及最佳作用浓度。

1.7.4 RT-qPCR法检测经总黄酮处理过的BV2细胞中炎症因子INOS和CD86的mRNA表达

为探究总黄酮对BV2细胞炎症因子INOS和CD86的mRNA表达影响，以揭示其在神经炎症反应中的调控机制，通过qPCR技术检测总黄酮处理后BV2细胞中INOS、CD86的mRNA表达水平变化。

1.7.5 统计学方法

使用Graph Pad Prism 10软件执行数据处理，包括统计分析及图表绘制，数据以（\overline{x}±s）的形式展现，以P<0.05为组间差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 总黄酮的纯度测定

本实验采用分光光度法对总黄酮进行含量测定以y=0.675 9x+0.038 9，R²=0.996 1，可得出总黄酮的纯度是85.4%。

2.2 黄伞中提取总黄酮活性成分

代谢组学分析测定黄伞菌丝体中含有3，4-亚甲二氧基苯、迪迪明、红黄酮D、Tricin 7-［鼠李糖基-（1->2）-半乳糖苷］、香叶木苷、夏大丹3-葡萄糖苷、芹菜素-8-C-葡萄糖（牡荆素）、香蒲甙、金丝桃素、6-C-β-吡喃葡萄糖基-8-C-α-阿拉伯吡喃糖基芹菜素、淫羊藿苷、漆叶苷、（R）-3，7-二羟基-2，4-二甲氧基异黄酮、杨梅素、莱鲍迪甙F，O-去甲基福布蒽酮、3-羟基布朗酮、2，7-二羟基-3，4-二甲氧基异黄烷、大豆黄素等总黄酮活性成分，均有抗炎、抗氧化、神经保护等生物活性^［8］。

2.3 黄酮与疾病靶点的获得

通过黄酮活性成分靶点基因进行合并得到靶点348个，通过GeneCards数据库查询“Alzheimer’s disease”，用OMIM数据库进行补充，得到疾病靶点2 005个，交集靶点共149个（图1A）；研究涉及149种蛋白质共397条边，表明这些蛋白质之间存在大量相互作用（图1B），根据度值筛选获得前十的核心靶点，其中包括肿瘤蛋白53（tumor protein p53，TP53）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等。它们均与线粒体和AD有关，证明了总黄酮通过线粒体途径干预AD具有潜在的可行性和科学性。

2.4 KEGG通路富集分析及化合物-靶点-通路网络

如图2A所示，黄酮类化合物的多个靶点作用于前20条通路。通过KEGG通路发现药物疾病共有靶点与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）等线粒体通路密切相关；如图2B所示，黄酮类化合物的多个活性成分共同作用于多个靶点。通过化合物-靶点-通路网络可以发现黄伞总黄酮共同作用于关键靶点以及通路间的相互作用，后续实验可以围绕这些靶点展开。

2.5 枢纽靶点的基因表达模式

观察到多个基因在不同细胞类型中的表达水平。如图3所示，NFKB1、TP53和GAPDH分别在小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中含量较高，因此在细胞实验中可以选用星形胶质细胞或者小胶质细胞，明确了总黄酮干预AD时可能作用的关键细胞类型。通过图3E、3F展示了不同基因在对照组（Control）和AD组（AD）中的跨平台标准化表达水平，NFKB1和TP53在AD组的表达水平中位数高于对照组，说明这些基因在AD状态下呈现上调趋势这些差异表达基因可作为总黄酮干预AD的潜在靶点。

2.6 分子对接

图4中清晰呈现了黄酮类化合物在蛋白结构上的具体结合位点，反映了总黄酮活性成分与蛋白之间的相互作用类型，通常结合能≤-7 kcal/mol视为强结合，其肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）与淫羊藿苷^［9］（MOL004425）结合，结合能位-8.8 kcal/mol；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）与2，7-二羟基-3，4-二甲氧基异黄烷（MOL000439）结合，结合能位-10.0 kcal/mol。表明这些核心黄酮类化合物可以通过以上神经炎症关键靶点来发挥干预AD的作用。

2.7 体外验证实验结果

2.7.1 总黄酮对羟自由基清除力和总抗氧化能力的影响

如图5A所示，黄伞总黄酮HT在5~40 mg/mL浓度范围内，羟自由基清除率随着浓度的升高而升高，表明黄酮类物质对于AD相关物质的清除作用呈现浓度依赖关系（P<0.001）；如图5B可知黄酮类物质的抗氧化能力呈现出明显的浓度依赖关系（P<0.000 1）。在0.5~8 mg/mL浓度范围内提高黄酮浓度，其抗氧化能力显著增强。以上两个实验说明总黄酮具备抗氧化及清除羟自由基的潜力。

2.7.2 总黄酮对BV2细胞活力及炎症因子INOS、CD86的mRNA表达影响

HT在浓度范围为5~80 µg/mL时，HT对BV2细胞的增殖均有促增殖作用，具有一定的依赖性。结果表明（图6A），不同浓度的总黄酮作用48 h后，对BV2细胞株的增殖影响不同。其中药物浓度为40 µg/mL时刺激作用最强，与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.000 1），说明黄酮在合适浓度下对细胞具有保护作用，提示其可能通过增强神经细胞的存活能力，干预AD进程。qPCR检测结果显示，相较于Control组，Aβ组INOS的mRNA表达水平升高约2.7倍（图6B）；相较于Aβ组，Aβ+HT组INOS的mRNA表达水平降低约3.4倍，Aβ+HT组INOS表达大幅下降，表明HT处理能有效抑制Aβ引起的INOS高表达；在CD86相对表达量中（图6C），相较于Aβ组，Aβ+HT组CD86的mRNA表达水平降低约0.07倍。这一结果表明，HT可能对Aβ引发的相关炎症或免疫反应有调节作用。

3 讨论

AD是一种进行性发展的神经退行性疾病，而黄伞总黄酮作为天然产物可通过多靶点、多途径干预AD^［8］。本研究综合运用网络药理学与分子对接技术结合体外实验，揭示黄伞总黄酮经线粒体途径干预AD的潜在机制，通过网络药理学技术并识别出NFKB1、AKT1等10个核心靶点，这些靶点不仅参与AD的关键病理过程，也与线粒体功能密切相关^［10］。KEGG通路富集分析提示这些靶点富集于MAPK^［11］、PI3K/AKT^［12］等线粒体相关信号通路，MAPK信号通路可阻断下游炎症信号传递和免疫调节防止细胞凋亡^［13］；PI3K/AKT信号通路可抑制神经小胶质细胞异常活化并保障线粒体功能完整等关键过程产生影响^［14］。分子对接结果进一步显示黄伞总黄酮中的活性成分与核心靶点的结合能力，从分子层面揭示总黄酮可与关键靶点相互作用，通过影响蛋白空间构象与功能调控下游信号通路，为其干预AD提供了分子层面的证据^［15］。体外实验进一步验证黄伞总黄酮的安全性与有效性，黄伞总黄酮的抗氧化能力随浓度升高而显著增强，其能够有效清除自由基、抑制活性氧的生成和减轻氧化损伤，保护神经细胞免受自由基的攻击，维持神经细胞的正常生理功能^［16］；在细胞增殖实验中，黄伞总黄酮对BV2细胞的增殖具有促进作用，其增殖活性为40 µg/ml时最强，有助于维持神经细胞的数量和功能稳定性^［17］；qPCR结果表明，黄伞总黄酮可下调小胶质细胞中炎症因子INOS和CD86的mRNA表达水平，进而发挥抗炎作用。

从目前的研究结论来看，尽管本研究为干预AD奠定了基础，但仍存在诸多问题有待深入探究，仍需进一步通过体内实验进行验证。未来研究可借助动物模型和多组学技术，系统探究黄伞总黄酮在体内的药代动力学和毒理学特性及相关病理指标的影响。此外，本研究仅聚焦于黄伞中的黄酮类化合物，其可能还存在其他活性成分可干预AD的作用。因此，后续研究可深入探究黄伞中其他活性成分与总黄酮之间的协同作用机制，为开发更高效的AD干预药物提供更多的研究方向和理论支撑。

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基金资助

贵州茅台医院科研与人才培养基金项目(MTyk2022-25)

学生创新创业计划项目(D2024048)

陕西省自然科学计划(2024JC-YBMS-755)

延安市科技计划(2024-SFGG-201)