有氧运动通过上调CHMP4B改善阿尔茨海默病小鼠细胞焦亡及炎症反应

Aerobic exercise ameliorates pyroptosis and inflammation in Alzheimer's Disease mice by upregulating CHMP4B

摘要

目的 探讨有氧运动（aerobic exercise，AE）通过上调带电多囊泡体蛋白4B（charged multivesicular body protein 4B，CHMP4B）改善阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）小鼠细胞焦亡及炎症反应的机制。 方法 生物信息学分析GSE48350数据库（AD患者，n=80；对照组，n=173）中的焦亡基因表达。8月龄MAPT P301L转基因小鼠接受8周跑步机有氧运动训练，分为对照组（WT）、模型组（MAPT）和有氧运动组（MAPT+AE），每组10只。RT-qPCR检测海马组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及TGF-β的mRNA水平，免疫印迹（Western blot，WB）检测CHMP4B及焦亡通路关键蛋白NLRP3、ASC、GSDMD-N的表达。此外，基于GSE110298数据库评估运动训练对AD患者海马CHMP4B mRNA的影响。并通过脑立体定向注射AAV-CHMP4B至MAPT小鼠海马，分为WT+Vector、WT+CHMP4B、MAPT+Vector、MAPT+CHMP4B组，检测CHMP4B、焦亡相关蛋白及炎症因子水平。 结果 GSE48350分析显示AD患者脑组织中CHMP4B水平显著下降，且与细胞焦亡及炎症相关。RT-qPCR结果显示，与WT组相比，MAPT组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达升高（P<0.05），而抗炎因子TGF-β显著降低（P<0.05）；MAPT+AE组促炎因子水平降低，抗炎因子水平升高（P<0.05）。WB结果显示，MAPT组小鼠NLRP3、ASC、GSDMD-N蛋白水平升高，而MAPT+AE组显著抑制其表达（P<0.05）。AE上调CHMP4B水平，AAV-CHMP4B过表达实验进一步证实，其过表达可显著抑制MAPT小鼠焦亡通路关键蛋白及炎症因子的表达（P<0.05）。 结论 有氧运动通过上调CHMP4B水平，抑制MAPT P301L小鼠细胞焦亡及炎症因子释放改善神经炎症。

Abstract

Objective To explore the mechanism by which aerobic exercise （AE） alleviates pyroptosis and inflammatory responses in Alzheimer's disease （AD） mouse models through the upregulation of charged multivesicular body protein 4B （CHMP4B）. Methods Bioinformatics analysis was performed on pyroptosis-related genes in the GSE48350 dataset （AD patients， n=80； control， n=173）. MAPT P301L transgenic mice at eight months of age underwent eight weeks of aerobic exercise training using a treadmill and were divided into three groups： wild-type control （WT）， AD model （MAPT）， and aerobic exercise model （MAPT+AE）， 10 in each group. RT-qPCR was used to evaluate the mRNA levels of inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， TNF-α， and TGF-β in the hippocampus. Western blot （WB） assays were performed to detect the protein expression levels of CHMP4B and key pyroptosis pathway proteins （NLRP3， ASC， GSDMD-N）. Additionally， the impact of exercise on CHMP4B expression in the hippocampus of AD patients was assessed based on the GSE110298 dataset. MAPT mice received stereotactic hippocampal injections of AAV-CHMP4B and were grouped as WT+Vector， WT+CHMP4B， MAPT+Vector， and MAPT+CHMP4B. Levels of CHMP4B， pyroptosis-related proteins， and inflammatory cytokines were subsequently measured. Results Analysis of GSE48350 indicated a significant reduction in CHMP4B expression in AD patients brain tissues， closely associated with pyroptosis and inflammation. RT-qPCR results revealed elevated pro-inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， and TNF-α， and decreased anti-inflammatory cytokine TGF-β in the MAPT group compared to WT （P<0.05）. These changes were reversed by AE treatment （P<0.05）. WB showed increased expression of NLRP3， ASC， and GSDMD-N in MAPT mice， significantly attenuated by AE intervention （P<0.05）. AE upregulated CHMP4B levels， and AAV-CHMP4B overexpression further confirmed that its overexpression significantly inhibited the expression of pyroptosis-related proteins and inflammatory cytokines in MAPT mice （P<0.05）. Conclusion Aerobic exercise attenuates neuroinflammation in MAPT P301L mice by upregulating CHMP4B， thereby suppressing pyroptosis and inflammatory cytokine release.

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 有氧运动 / 焦亡 / CHMP4B

Key words

Alzheimer′s disease / Aerobic exercise / Pyroptosis / CHMP4B

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是常见的神经退行性疾病之一，也是老年期痴呆的主要类型。AD病程隐匿，呈持续进展性，主要临床表现包括记忆功能减退、认知障碍及人格行为异常等^［1-2］。其核心病理学特征包括Aβ的异常沉积形成老年斑（senile plaques， SP）及Tau蛋白的过度磷酸化形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles， NFT），这些病理学改变均与神经炎症密切相关，共同导致神经元变性及认知功能损害^［3-4］。近年来，研究^［5-7］表明细胞焦亡（pyroptosis）在AD的病理生理学进程中发挥重要作用，可能是神经炎症加剧及神经元死亡的关键因素。

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡方式，其特征是细胞膜的破裂及促炎因子的释放，从而加剧炎症反应^［8-9］。在经典的焦亡通路中，NLRP3炎症小体在异常分子刺激下被激活，进而促使caspase-1的活化。随后，caspase-1介导GSDMD裂解，释放其N端活性片段（GSDMD-N），在细胞膜上形成孔洞，导致细胞焦亡并促进IL-1β、IL-18等促炎因子的释放^［10-11］。已有研究^［11-12］发现，在AD患者及动物模型中，NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡异常激活，释放大量促炎因子（如IL-1β、IL-18），加剧中枢神经系统慢性炎症，最终诱发神经元损伤。因此，靶向焦亡通路可能是延缓AD病程的重要策略。

内体分选复合物（endosomal sorting complexes required for transport， ESCRT）由ESCRT-0、-Ⅰ、-Ⅱ和-Ⅲ四个功能性复合体组成，是一种与膜重塑密切相关的复合物。神经系统研究^［13-15］表明，ESCRT系统广泛参与神经元的分裂、发育及自噬等过程。其中，带电多囊泡体蛋白4B（charged multivesicular body protein 4B， CHMP4B）是ESCRT-Ⅲ的核心亚基，在细胞膜重塑、胞吞功能以及自噬调控中发挥关键作用^［16-17］。近年来研究^［18］发现，ESCRT系统可被募集至细胞质膜，修复焦亡过程中GSDMD介导的细胞膜损伤，从而减少促炎因子的释放。而抑制ESCRT介导的膜修复功能则可加剧GSDMD依赖的细胞焦亡^［19］。有研究^［20］进一步指出，CHMP4B还参与调控GSDMD介导的膜修复及焦亡过程。此外，CHMP4B在细胞膜修复及炎症调控中具有重要作用^［21］。然而，CHMP4B是否介导有氧运动对AD相关神经炎症及细胞焦亡的调控仍不清楚。

近年来，越来越多研究表明，有氧运动（aerobice exercise， AE）可改善认知功能，并降低AD发病风险。研究^［22-24］表明，AE不仅可减少Aβ沉积及Tau蛋白过度磷酸化，还可上调脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF），促进突触可塑性并改善学习记忆能力。此外，AE还可抑制细胞焦亡相关炎症^［25］。但AE改善AD焦亡及炎症的具体分子机制尚不明确。本研究通过构建AD小鼠AE模型，并采用腺病毒介导的CHMP4B过表达策略，探讨AE对CHMP4B的调控作用及其在抑制细胞焦亡和炎症因子释放中的机制，为AD的运动干预提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

本研究使用的MAPT P301L转基因PR5小鼠（携带人源Tau P301L突变）由陆军军医大学王延江教授赠送。腺病毒AAV-CHMP4B（pAAV-CMV-CHMP4B-3Xflag-EF1a-EGFP-tWPA）由和元生物科技有限公司（上海）设计构建。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司（南京）；硝酸纤维素（NC）膜购自Millipore Sigma生物公司（美国）；Actin、CHMP4B购于SAB生物科技有限公司（美国）；NLRP3及ASC购于CST生物科技有限公司（美国）；GSDMD-N一抗购于Abcam生物科技有限公司（英国）；HRP标记羊抗兔IgG二抗购自赛默飞生物科技有限公司（美国）。蛋白电泳仪、电泳槽、转膜槽、全能型凝胶成像分析系统购自伯乐生物科技公司（Bio-Rad，美国），荧光定量PCR仪购自罗氏生物科技有限公司（中国）。

1.2 实验设计与分组

MAPT P301L小鼠饲养于江南大学医学院实验动物中心的SPF级环境（温度24±2 ℃，光照周期12 h明/暗交替，湿度55%±10%），自由摄食饮水。实验选取10只同窝8月龄WT及20只MAPT小鼠分为三组（n=10，雌雄各半）：静坐对照组（WT）、静坐模型组（MAPT）和有氧运动组（MAPT+AE）。有氧运动组小鼠在跑步机上训练周期为8周，每周5 d，每日14：00开始，持续40 min，总跑步距离450 m（6 m/min 5 min→9 m/min 5 min→12 m/min 20 min→15 m/min 5 min→12 m/min 5 min）。为避免训练阶段环境因素的干扰，未进行运动训练的WT小鼠和MAPT小鼠在每次实验过程中均被置于静止跑步机上。

另取8月龄WT及MAPT小鼠各20只8月龄小鼠，分为4组（n=10，雌雄各半）：野生型+空载病毒组（WT+Vector）、野生型+病毒组（WT+CHMP4B）、模型+空载病毒组（MAPT+Vector）、模型+病毒组（MAPT+CHMP4B）。以上实验获江南大学实验动物伦理委员会批准（编号：JN.No20240630t0321231［379］）。

1.3 RT-qPCR检测mRNA水平

行为学测试结束后，小鼠经麻醉处死，冰上迅速分离20 mg海马组织，按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，经DNase消化去除基因组DNA后逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β和IL-10 mRNA表达水平。引物序列如下：

IL-1β：5´-CCAGCTTCAAATCTCACAGCAG-3´（forward）和5´-CTTCTTTGGGTATTGCTTGGGATC-3´（reverse）；IL-6：5´-CCACCAAGAACGATAGTCAA-3´（forward）和5´-TTTCCACGATTTCCCAGA-3´（reverse）；TNF-α：5´-CTGTGAAGGGAATGGGTGT-3´（forward）和5´-CAGGGAAGAATCTGGAAAGG-3´（reverse）；TGF-β：5´-AGCGGACTACTATGCTAAAGAGGTCACCC-3´（forward）和5´-CCAAGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTA-3´（reverse）；IL-10：5´-AGGGTTACTTGGGTTGC-3´（forward）和5´-TGAGGGTCTTCAGCTTC-3´（reverse）。

1.4 Western blot检测蛋白水平

取20 mg小鼠海马组织，匀浆裂解后，加入上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，随后转膜至NC膜。室温5%BSA封闭1 h，4 ℃过夜孵育一抗CHMP4B、Actin、NLRP3、ASC、GSDMD-N，HRP标记二抗室温孵育1 h，化学发光显色，ImageJ软件定量分析蛋白条带灰度值。

1.5 脑立体定位注射腺病毒

小鼠经腹腔注射1.25%三溴乙醇（10 μL/g）麻醉，使用汉密尔顿微量注射器以0.2 μL/min速度立体定向注射0.5 μL CHMP4B-AAV（5.491 2 TU/mL）至海马CA3区（前囟后：2.0 mm，旁开：1.5 mm，深度：2 mm）。注射后针头停留10 min，缝合伤口，密切观察感染情况，待病毒表达1个月后进行行为学及分子生物学实验。

1.6 转录组分析

GSE48350和GSE100298基因表达数据来源于GEO数据库（Gene Expression Omnibus， GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。GSE110298数据采用R软件的sva包进行标准化处理，差异基因的筛选标准设定为P<0.05，且|log₂ fold change （FC）|>0。生物学过程（Biological Process， BP）分析、GO细胞组分（Cellular Component， CC）分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析、差异基因的热图及火山图绘制均通过在线生物信息学分析与可视化平台（https：//bioinformatics.com.cn/）完成。蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction， PPI）网络的可视化分析采用Cytoscape 3.9.1，并结合STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）进行网络构建和交互分析。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.1软件进行数据统计分析并绘制实验结果图。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。数据以（\overline{x}±s）表示，将P<0.05设定为显著性阈值（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1）。

2 结果

2.1 阿尔茨海默病焦亡相关基因筛选与鉴定

为探讨焦亡相关基因在AD中的潜在作用，本研究基于GSE48350数据集开展生物信息学分析。利用R语言sva包对数据进行整合与批次校正后，获得173例健康受试者与80例AD患者的全脑转录组数据。主成分分析（PCA）结果显示，标准化后AD组与正常人对照组在转录特征上明显分离（图1A），表明数据质量良好，适用于差异分析。

结合文献及GSEA数据库中焦亡相关基因集^［26］，共筛选出21个与焦亡相关的差异表达基因（DEG）（P<0.05），其中GSDMB、CHMP4B、CYCS等12个基因在AD中下调，NLRP7、GSDMD、TNF等9个基因上调（图1B）。GO功能富集分析显示，这些DEG主要富集于炎症反应调控、免疫调节、神经元死亡、细胞焦亡及IL-1β产生的正向调控等生物过程；GO细胞组分及KEGG通路分析揭示这些DEGs与炎症小体、ESCRT-Ⅲ复合体、阿尔茨海默病及TNF信号通路密切相关（图1C）。

为了进一步探讨DEG的相互作用，采用Cytoscape构建蛋白互作网络（PPI），发现ESCRT-Ⅲ相关基因（如CHMP4B、CHMP4A）与GSDMD等焦亡核心因子存在潜在互作关系（图1D）。MCODE模块聚类分析识别出关键调控模块，其中得分最高的Cluster 1显著富集于炎症及ESCRT-Ⅲ相关通路（图1E，1F）。

GSE48350分析揭示AD中焦亡相关基因表达异常，涉及炎症、焦亡及免疫调控信号通路，提示ESCRT-Ⅲ复合体可能参与AD相关神经炎症与焦亡过程。

2.2 AE改善MAPT P301L小鼠细胞焦亡及炎症

为探讨AE对MAPT P301L小鼠细胞焦亡及炎症反应的影响。本研究对8月龄MAPT小鼠进行为期8周的跑步机AE训练（图2A）。随后，采用Western blot和RT-qPCR分析焦亡通路关键蛋白及炎症因子的表达变化。Western blot结果显示（图2B，2C），与WT组相比，MAPT小鼠海马组织中焦亡相关蛋白NLRP3、ASC和GSDMD-N表达水平显著升高（P<0.05），提示焦亡通路被激活。AE干预后，MAPT+AE组上述蛋白表达均明显下降（P<0.05），表明AE可抑制NLRP3介导的焦亡反应。

进一步通过RT-qPCR检测海马组织炎症因子的mRNA水平（图2D）。与WT组相比，MAPT组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平显著升高（P<0.05），而抗炎因子TGF-β表达水平显著降低（P<0.05），而IL-10无显著变化（P>0.05），提示炎症反应增强。MAPT+AE组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著降低（P<0.05），而TGF-β表达水平显著升高（P<0.05），提示AE可能通过降低促炎因子水平、提高抗炎因子水平，从而改善AD相关神经炎症。

2.3 AE上调MAPT P301L小鼠ESCRT-Ⅲ亚基CHMP4B水平

为探讨AE抑制细胞焦亡及炎症的作用机制，本研究进一步分GSE110298数据集，评估运动训练对AD患者海马基因表达的影响。火山图分析结果显示，在高体力活动（high physical activity， HPA）（n=12）与低体力活动（low physical activity， LPA）（n=10）AD患者的比较中，共筛选出3 413个DEG，其中包括ESCRT-Ⅲ复合体亚基CHMP4B，其转录水平在HPA组显著上调（P<0.05），而其他ESCRT-Ⅲ相关亚基基因未见显著变化（图3A）。这表明CHMP4B可能是AE改善AD病理学的关键分子。

为进一步验证CHMP4B在MAPT小鼠中的表达变化，Western blot结果（图3B）显示，与WT组相比，MAPT组小鼠CHMP4B蛋白表达显著降低（P<0.01），而MAPT+AE组CHMP4B表达水平显著升高（P<0.01，图3C）。前期结果提示ESCRT-Ⅲ复合体可能参与炎症调控及焦亡通路。综上，AE可能通过上调ESCRT-Ⅲ亚基CHMP4B，改善MAPT P301L小鼠细胞焦亡及神经炎症。

为进一步验证CHMP4B在AE中改善AD焦亡及炎症的作用，本研究在MAPT P301L小鼠海马CA3区注射AAV-CHMP4B，分别设立WT+Vector、WT+CHMP4B、MAPT+Vector及MAPT+CHMP4B组（图4A）。Western blot结果（图4B，4C）显示，WT+CHMP4B组与WT+Vector组相比，NLRP3、ASC及GSDMD-N蛋白表达无显著变化（P>0.05），提示CHMP4B过表达对正常WT小鼠无影响。然而，与MAPT+Vector组相比，MAPT+CHMP4B组焦亡相关蛋白表达显著降低（P<0.05），并恢复接近WT+Vector组水平（P>0.05），这表明CHMP4B过表达可抑制MAPT小鼠焦亡信号通路的异常激活。

同时，RT-qPCR结果（图4D）显示，WT+CHMP4B组炎症因子表达水平与WT+Vector组无显著差异（P>0.05）。但是，与MAPT+Vector组相比，MAPT+CHMP4B组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低，抗炎因子TGF-β水平显著升高（P<0.05），这表明过表达CHMP4B能够抑制MAPT P301L小鼠炎症因子释放。

3 讨论

本研究通过生物信息学分析发现，ESCRT-Ⅲ复合体与AD中的焦亡及神经炎症密切相关，且ESCRT-Ⅲ亚基CHMP4B在AD中显著下降。与其他研究一致，已有文献^［27］指出，ESCRT-Ⅲ复合体在神经退行性疾病中发挥重要作用，且CHMP4B在AD患者脑组织中的表达显著下调与焦亡相关^［28］，这进一步提示CHMP4B在AD的焦亡过程中的关键作用。

针对AE对AD小鼠细胞焦亡调控中的作用及其分子机制，首先分析了AE对焦亡通路及炎症因子释放的影响。研究发现，MAPT小鼠在经过AE训练后，海马组织中NLRP3、ASC、GSDMD-N等焦亡通路关键蛋白的表达显著下调，且炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著降低，而抗炎因子TGF-β水平升高。这一研究与其他模型小鼠研究一致，表明AE能够有效抑制焦亡^［25］。此外，本研究还发现，AE不仅改善了MAPT P301L小鼠的细胞焦亡，还有效抑制了神经炎症。在AD患者运动后的海马组织转录组分析中，观察到ESCRT-Ⅲ复合体亚基CHMP4B的表达显著上调，提示CHMP4B可能是AE改善AD病理的关键分子。类似的，MAPT P301L小鼠海马中CHMP4B水平在经过AE后也显著升高。这些结果表明，AE可能通过上调CHMP4B调控ESCRT-Ⅲ复合体，从而抑制细胞焦亡和炎症反应。

为验证本研究的假设，通过在MAPT P301L小鼠海马中注射AAV-CHMP4B进行过表达实验，结果显示，CHMP4B过表达显著抑制了焦亡通路的激活，并减少了炎症因子的释放。与先前研究一致，ESCRT-Ⅲ复合体可能通过修复细胞膜损伤，减轻由GSDMD引起的细胞焦亡^［18］。这表明AE能通过上调CHMP4B水平抑制小鼠细胞焦亡及炎症。然而，尽管CHMP4B过表达可改善焦亡和神经炎症，其在AE中对NLRP3-GSDMD焦亡通路的直接或间接调控机制仍需进一步研究。

此外，CHMP4B在AD相关焦亡中的亚细胞定位及细胞类型特异性尚不清楚，特别是其在小胶质细胞、星形胶质细胞或神经元中的作用，未来可结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫荧光共定位等技术，进一步阐明其在不同细胞类型中的表达模式及功能。同时，CHMP4B介导的膜修复功能在焦亡抑制中的核心作用仍需验证，未来可结合光遗传学及超分辨成像技术，探讨CHMP4B在膜修复与焦亡调控中的相互关系。

综上所述，本研究首次揭示了AE通过上调CHMP4B水平，抑制MAPT P301L小鼠细胞焦亡及炎症因子释放改善神经炎症，这为AD的干预提供了新的理论依据。未来的研究将进一步探讨CHMP4B在不同细胞类型中的作用机制，探索其作为运动干预的潜在靶点，为AD的非药物治疗开辟新途径。

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基金资助

江苏省自然科学基金(BK20211238)