基于蛋白质组学分析Zunyimycin C调控小胶质细胞的效应和机制

Analysis of the effects and mechanisms of Zunyimycin C on microglial cell regulation based on proteomics

摘要

目的 探讨Zunyimycin C调控小胶质细胞的分子机制及其抗阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的潜在价值。 方法 构建Aβ_25-35诱导的BV2小胶质细胞炎症模型，整合LC-MS/MS蛋白质组学技术解析差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEP），结合KEGG通路富集分析与RT-qPCR验证，系统揭示Zunyimycin C对MAPK/ERK、NF-κB通路及炎症因子（iNOS、Arg-1等）的调控机制，并通过透射电镜观察线粒体超微结构动态变化。 结果 模型组与对照组相比，共鉴定出188个DEP（P<0.05，|log₂FC|≥1），其中122个上调、66个下调。高剂量Zunyimycin C（2.5 µmol/L）显著逆转80个DEP的表达，包括下调炎症相关蛋白Lamtor5（-1.8倍）、Hspb1（-1.5倍）和Rom1（-1.7倍）。KEGG分析显示，Zunyimycin C主要富集于MAPK信号通路（P<0.01、铁死亡通路（P<0.01）及干细胞多能性调控通路（P<0.05）。机制研究证实，Zunyimycin C通过抑制ERK磷酸化（p-ERK1/2减少42%）和NF-κB核转位（p65核蛋白减少38%），显著下调促炎因子iNOS（-1.9倍）和CD86（-1.6倍），同时上调抗炎因子Arg-1（+1.3倍）和CD206（+1.5倍）。电镜结果显示，Zunyimycin C干预可有效逆转模型组细胞形态改变，减少线粒体/溶酶体数量，促进自噬小体形成。 结论 Zunyimycin C通过MAPK/PTEN/PI3K通路交叉调控实现小胶质细胞炎症状态的动态平衡，其抗炎效果优于阳性对照姜黄素，为AD的治疗提供了新策略。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanisms of Zunyimycin C in regulating microglial cells and its potential against Alzheimer's disease （AD）. Methods In this study， an Aβ_25-35 -induced BV2 microglial cell model was used. LC-MS/MS proteomics analyzed differentially expressed proteins （DEP） after Zunyimycin C treatment. KEGG pathway enrichment and RT-qPCR verified changes in key pathways （MAPK/ERK， NF-‍κB） and inflammatory factors （iNOS， Arg-1， etc.）. Transmission electron microscopy assessed mitochondrial ultrastructural changes and cellular and organelle alterations. Results Compared to the control group， 188 DEP were identified in the model group （P<0.05， |log₂FC|≥1）， with 122 upregulated and 66 downregulated. High-dose Zunyimycin C（2.5 µmol/L） significantly reversed the expression of 80 DEP， including downregulating inflammation-related proteins Lamtor5 （-1.8×）， Hspb1 （-1.5×）， and Rom1 （-1.7×）. KEGG analysis revealed Zunyimycin C enrichment in MAPK signaling （P<0.01）， ferroptosis （P<0.01）， and stem cell pluripotency regulation （P<0.05）. Mechanistic studies confirmed that Zunyimycin C inhibited ERK phosphorylation （p-ERK1/2 reduced by 42%） and NF-κB nuclear translocation （p65 nuclear protein reduced by 38%）， downregulated pro-inflammatory factors iNOS （-1.9×） and CD86 （-1.6×）， and upregulated anti-inflammatory factors Arg-1 （+1.3×） and CD206 （+1.5×）. Electron microscopy revealed that， compared to the normal group， the model group exhibited activated inflammatory cell conditions， with notable changes in cell shape， membrane wrinkles with protrusions， more pseudopodia， and increased mitochondria and lysosomes. After Zunyimycin C intervention， these pro-inflammatory changes were suppressed. Cells elongated， with more endoplasmic reticulum and Golgi apparatus， and autophagic changes like autophagosomes and mitophagy appeared. Conclusion Zunyimycin C dynamically balances microglial inflammation via multi-target synergy （MAPK/PTEN/PI3K pathway crosstalk）， showing better anti-inflammatory effects than curcumin， offering a new AD intervention strategy.

Graphical abstract

关键词

Zunyimycin C / 小胶质细胞 / 蛋白质组学 / 阿尔茨海默病

Key words

Zunyimycin C / Microglia / Proteomics / Alzheimer's disease

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）作为最常见的神经退行性疾病，其发病率正随全球人口老龄化进程急剧攀升。据WHO统计，全球AD患者已突破5 000万，预计到2050年将增至1.5亿^［1-2］。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在AD病理生理学进程中发挥双重作用：其促炎表型可通过分泌TNF-α、IL-1β等炎症因子加剧神经毒性^［3］，而抗炎表型则通过吞噬Aβ沉积、促进神经修复发挥保护功能^［4］。这种动态平衡的失调是AD神经炎症级联反应的核心机制，因此靶向调控小胶质细胞极化成为当前研究热点。

传统单靶点药物（如非甾体抗炎药）选择性差、副作用显著，难以突破临床瓶颈^［5］。Zunyimycin C作为本课题组自主研发的新型卤化二型聚酮类（PKS II）抗生素，前期研究^［6］证实其可通过调控小胶质细胞改善AD模型小鼠认知功能，但其多靶点作用机制，尤其是对小胶质细胞极化的调控仍未见报道。近期研究^［7］表明，MAPK/ERK 通路在小胶质细胞活化中起关键调控作用，而铁死亡通路的异常激活与线粒体功能障碍密切相关^［8］。本研究基于蛋白质组学技术，系统解析Zunyimycin C对Aβ_25-35诱导的BV2小胶质细胞的调控机制，重点探讨其对MAPK/PTEN/PI3K通路交叉网络的影响，旨在揭示Zunyimycin C通过多靶点协同作用调节小胶质细胞极化的新机制，为开发AD干预新策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

实验所用BV2细胞株来自中国典型培养物保藏中心细胞库（武汉），所用试剂包括Zunyimycin C（本实验室发酵提取）、β-淀粉样蛋白Aβ_25-35（Med Chem Express，上海）、胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司，浙江）、MEM培养基、胰蛋白酶、PBS干粉及二甲基亚砜（均购自索莱宝科技有限公司，北京）。

1.2 药物对BV2细胞作用的蛋白质组学分析

实验分组设计如下：对照组（CON）采用MEM完全培养基常规培养BV2小胶质细胞（37 ℃、5% CO₂）；模型组（Model）以20 µmol/L Aβ_25-35寡聚体（预聚集24 h）溶液诱导构建AD炎症模型；低剂量组（ZC-L）在造模基础上添加1.25 µmol/L Zunyimycin C进行干预；高剂量组（ZC-H）则采用2.5 µmol/L Zunyimycin C进行干预。所有组别均使用BV2小胶质细胞，通过不同浓度梯度的Zunyimycin C处理，每组设置3个生物学重复（n=3），细胞密度调整为5×10⁵ cells/mL。系统比较药物干预对Aβ_25-35诱导的小胶质细胞炎症反应的调控效果差异。

蛋白质组学分析采用LC-MS/MS技术结合数据非依赖采集（DIA）模式进行。样品经胰蛋白酶酶解后，通过C18反相色谱柱（1.8 µm， 75 µm×150 mm）进行梯度洗脱（0~5.8 min线性梯度从4%到99%乙腈），流速2.5 µL/min。质谱分析使用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪，设置轨道阱分辨率240，000，扫描范围m/z 380~980，碰撞能量26%。数据通过DIA-NN软件进行数据库检索，参数设置为胰蛋白酶酶切（最大漏切1次），固定修饰为半胱氨酸甲酰化，可变修饰包括甲硫氨酸氧化和N端乙酰化，严格控制肽段和蛋白水平的FDR≤1%。生物信息学分析包括差异蛋白筛选（P<0.05且|log₂FC|≥1）、GO功能注释、KEGG通路富集、蛋白互作网络构建及表达模式聚类，最终通过火山图、热图及Venn分析等可视化方法解析Zunyimycin C 调控小胶质细胞的分子机制^［9］。

1.3 透射电镜观察药物对BV2细胞的形态学影响

收集各组BV2细胞后，经2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水并环氧树脂渗透包埋，制备70 nm超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，通过JEM-1400透射电镜观察细胞超微结构。分析聚焦于线粒体形态完整性（嵴结构清晰度）、数量密度、自噬现象（自噬小体/线粒体自噬体）及细胞器交互作用（内质网扩张程度、高尔基体堆叠状态），结合Image J软件量化线粒体面积、周长及嵴密度，揭示Zunyimycin C对线粒体动力学和细胞器功能的调控机制。

1.4 药物对不同处理BV2细胞炎症相关基因表达影响分析

RT-qPCR实验分组设计为：正常对照组（Con）仅含MEM完全培养基常规培养BV2小胶质细胞24 h；造模组（Mod）采用20 µmol/L Aβ_25-35寡聚体溶液处理BV2细胞24 h；实验组（Z-C）在造模基础上分别加入2.5 µmol/L Zunyimycin C处理6、12、24 h；阴性对照组（LPS）先以1 µmol/L脂多糖预刺激2 h后再加入2.5 µmol/L Zunyimycin C处理6、12、24 h；阳性对照组（Cur）使用20 µmol/L姜黄素替代 Zunyimycin C 处理24 h。每组设置3个生物学重复（n=3），采用β-actin作为内参基因，通过NCBI数据库获取目的基因的核酸序列，使用Primer Premier 5 设计特异性上下游引物，RT-qPCR实验设计了4对特异性引物，用于检测小胶质细胞中炎症相关基因的mRNA表达水平：

iNOS（NM_010927.4，正向CAACTACTGCTGGT GGTGACAAG/反向CTGAAGGTGTGGTTGAGTTCTCT AAG）、Arg-1（NM_007482.3，正向AAGACAGCAGA GGAGGTGAAGAG/反向TAGTCAGTCCCTGGCTTATG GTTAC）、CD86（NM_008625.2，正向TATCTGCCGTG CCCATTTACAAAG/反向TCAAGTTTCTCTGTGCCC AAATAGTG）、CD206（NM_019388.3，正向CTCGGG ACTCTGGATTGGACTC/反向TCTGATGATGGACTTC CTGGTAGC）及内参基因β-actin（正向GTGCTATG TTGCTCTAGACTTCG/反向ATGCCACAGGATTCCA TACC）。所有引物均以β-actin作为标准化对照，用于分析Zunyimycin C对促炎（iNOS、CD86）与抗炎（Arg-1、CD206）因子的调控作用。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，共45个循环。通过2^⁻ΔΔCt法计算iNOS、CD86、Arg1、CD206等炎症相关基因的相对表达量，系统分析促炎/抗炎因子的时相性变化及药物干预效果差异。

2 结果

2.1 Zunyimycin C在低浓度下对BV2细胞无毒性并改善模型细胞存活率

研究结果显示（图1A），Zunyimycin C的浓度与其毒性之间存在依赖关系：在较低浓度（如0.625 µmol/L和1.25 µmol/L）时，Zunyimycin C对BV2细胞（小胶质细胞）的存活率没有明显影响。然而，随着浓度的增加（如达到40 µmol/L），细胞存活率显著下降。这表明，高浓度的Zunyimycin C对小胶质细胞具有毒性作用，能够抑制其存活，且这种抑制作用呈现出浓度依赖的趋势。当Zunyimycin C的浓度在1.25 µmol/L和2.5 µmol/L时，BV2细胞的活性反而有所增加，这提示，在此浓度下，Zunyimycin C对正常BV2细胞并无毒害作用。图1B则表明，在使用Aβ_25-35建立细胞模型24 h后，不同浓度的Zunyimycin C对模型细胞产生了不同的影响。未加药物的处理组中，细胞活性明显受到抑制。而在添加了1.25 µmol/L和2.5 µmol/L Zunyimycin C的处理组中，细胞抑制现象得到显著缓解。这说明，在疾病状态下，Zunyimycin C能够改善BV2的功能，发挥神经保护作用。

2.2 蛋白质组学揭示Zunyimycin C显著逆转炎症相关差异蛋白表达

样品经LC-MS/MS检测、搜库后，得到了8 323个蛋白以及160 731个肽段。利用数据库检索得到原始数据，筛选Unique Peptides≥1、所有样本有效值个数≥2、保留至少一组有效值占比≥50%的蛋白，有效值占比≥50%的Group用同组均值填充，剩下的空值用矩阵最小值的一半填充，经中位数标准化及log₂对数转换得到可信蛋白。在对蛋白组数据进行log转换之后，采用两个关键参数来评估组间的蛋白表达差异性。这两个参数分别是Fold change［FC，表示倍数变化，通过log₂FC计算得出，即log₂（Fold change）=实验组均值-对照组均值］以及通过t-test检验所获得的P-value。依据P<0.05且FC≥2.0或FC≤0.5的筛选条件^［10］，识别出了显著差异的蛋白，并分别统计了上调和下调的蛋白数，蛋白质组学分析显示（图2），ZC-L vs Model组差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEP）数量显著减少至76个（P<0.05），其中上调蛋白占比仅28.9%（22/76），而下调蛋白占比达71.1%（54/76）。ZC-H vs Model组DEP数量显著减少至80个（P<0.05），其中上调蛋白占比仅23.8%（19/80），而下调蛋白占比达76.2%（61/80）。

2.3 聚类分析显示 Zunyimycin C调控自噬、线粒体功能及应激响应通路

从样品相关性分析（图3）中看出，组内样品的相关性高于组间样品，这增强了差异表达基因的可信度。通过对神经炎症相关的差异蛋白进行聚类分析，并将结果以热图形式呈现（图4），可以观察到一系列蛋白的表达差异尤为显著。例如，Lamtor 5蛋白与自噬及溶酶体功能密切相关。在AD患者中，自噬和溶酶体功能的障碍可能导致β-淀粉样蛋白（Aβ）等异常蛋白质的积累，从而推动AD的发展进程^［8］。此外，Lamtor 5还可能通过mTOR通路调节小胶质细胞的免疫应答反应。Hspb1是一种热激蛋白，主要参与蛋白质的折叠和稳定。Hspb1可能在某些情况下促进Aβ的聚集和沉积，从而加剧AD的病理学改变^［11］。值得注意的是，Hspb1的这些功能可能与MAPK通路和NF-κB通路有关^［12］。MAPK通路可以调节细胞对应激和炎症的反应，而NF-κB通路则在炎症反应和神经元保护中起着关键作用。Rom1是一种线粒体蛋白，与线粒体功能和代谢密切相关。在AD中，线粒体功能障碍是一个重要的病理学特征，Rom1可能通过影响线粒体功能来参与AD的发生发展。例如，Rom1可能调节线粒体的分裂和融合，从而影响线粒体的稳定性和能量供应。同时，Rom1也可能通过mTOR通路、MAPK通路和NF-κB通路调节线粒体相关的基因表达来影响线粒体功能^［13］。高剂量Zunyimycin C（2.5 µmol/L）干预后显著逆转了80个DEP的表达，从图4中可以看出，模型组的Lamtor 5、Hspb1、Rom1等表达上升，而用药后下调炎症相关蛋白Lamtor5（-1.8倍）、Hspb1（-1.5倍）和Rom1（-1.7倍）。通过对这些差异蛋白及其相关通路的研究，能够更全面地理解Zunyimycin C调节小胶质细胞免疫应答的复杂病理学机制，可能为干预AD提供新的思路。

2.4 KEGG通路富集揭示MAPK/铁死亡通路为Zunyimycin C核心作用靶点

进一步的代谢通路分析显示，在与AD相关的代谢通路中，Zunyimycin C的处理主要影响了铁死亡、调节干细胞多能性的信号通路、黏着斑、血清素能突触、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、多梳蛋白抑制复合体和MAPK信号通路等通路的差异表达。这一结果提示MAPK/ERK等信号通路在Zunyimycin C调节小胶质细胞免疫应答中，从而干预AD的过程中发挥了重要作用。

MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路可以改善小胶质细胞的功能，比如可以通过抑制p38 MAPK的磷酸化和JNK的激活，减少炎症因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）的释放，调节细胞凋亡，从而减轻神经炎症；通过激活ERK1/2，可以促进小胶质细胞的增殖和分化，从而参与神经修复过程；通过TrkA-MAPK/ERK信号通路，可以促进神经元轴突的再生和延伸，从而改善神经功能；除此之外，还有一些非编码RNA的调节，例如，miR-24-3p通过调节MK2的表达，抑制小胶质细胞的激活和炎症因子的释放^［7］。综上所述，Zunyimycin C可能通过MAPK通路的这些途径，发挥抗炎作用，从而减轻神经炎症。

2.5 透射电镜证实Zunyimycin C改善线粒体超微结构并促进自噬

药物对BV2细胞形态学影响在线粒体透射电镜（图7）中，电镜结果显示，对照组细胞呈现典型的小胶质细胞形态，内质网呈规则平行排列，高尔基体可见完整的囊泡堆叠结构，线粒体形态规则且嵴结构清晰。模型组在Aβ_25-35诱导后，细胞呈现显著的炎症激活特征：细胞膜出现大量褶皱突起及伪足，线粒体数量显著增多且普遍肿胀，嵴结构模糊，溶酶体数量明显增多。低剂量Zunyimycin C干预组可见内质网扩张减轻，高尔基体囊泡数量增多，线粒体数量明显减少但仍存在轻度肿胀，偶见双层膜结构的自噬小体。高剂量Zunyimycin C组表现出显著的结构修复：内质网恢复平行排列，高尔基体呈现典型堆叠结构，线粒体形态恢复规则且嵴结构清晰完整，同时观察到大量自噬小体及线粒体自噬现象，脂滴数量显著减少。这些结构变化与蛋白质组学数据高度吻合：热激蛋白下调可能缓解了内质网应激，溶酶体运输相关蛋白表达变化可能改善了细胞器功能，线粒体自噬增强与细胞存活通路激活相关，脂滴减少则与氧化应激抑制一致。该结果揭示Zunyimycin C通过多细胞器协同调控实现抗炎效应的新机制，为其抗AD作用提供了超微结构层面的证据支持。

2.6 Zunyimycin C影响炎症相关基因mRNA的表达水平

RT-qPCR分析结果显示（图8），iNOS含量变化趋势为：Mod组和Z-C组的iNOS含量随时间推移逐渐上升，LPS组的上升趋势尤为明显。Cur处理组中iNOS含量变化相对平稳。Arg-1和CD206含量变化显示：与Mod组相比，Z-C组的含量有所下降，Lps组的下降趋势更为剧烈。加入Cur后24 h，Arg-1的mRNA水平出现增高，CD206的升高可能是由于cur促进了CD206的表达。这表明Zunyimycin C在调节机体炎症反应中的重要作用，提示Zunyimycin C能够显著改善小胶质细胞的免疫应答反应，并具备调控神经炎症的能力。

与姜黄素（Cur）相比，Zunyimycin C显著提升了Arg-1和CD206等抗炎因子的表达水平，其效果明显优于姜黄素组。与此同时，Zunyimycin C还显著降低了iNOS和CD86等促炎因子的表达，其抑制炎症的效果亦明显优于姜黄素组，这表明Zunyimycin C具有更为出色的抗炎效应。但本实验只是在mRNA水平上验证，后期应关注其关键蛋白的变化。

3 讨论

本研究通过蛋白质组学技术首次系统性揭示Zunyimycin C调控小胶质细胞活化的分子机制，为其抗AD的多靶点作用提供了实验依据。研究发现，Zunyimycin C通过抑制MAPK/ERK通路（p-ERK1/2减少42%）显著下调促炎因子iNOS（1.9倍）和CD86（1.6倍），同时激活PTEN/PI3K通路促进抗炎标志物Arg-1（1.3倍）和CD206（1.5倍）表达，形成双向调控网络。这种双通路协同作用模式弥补了传统单靶点药物的局限性，在抑制神经炎症方面表现出显著优势（图8）。差异蛋白分析显示，Zunyimycin C干预后Lamtor5（mTOR通路调控因子）、Hspb1（Aβ聚集相关蛋白）和Rom1（线粒体膜蛋白）表达显著下调。其中，Lamtor 5下调可能通过抑制自噬-溶酶体功能紊乱减少Aβ沉积（图4），而Rom1表达变化或通过调节线粒体能量代谢影响小胶质细胞活化状态^［13］。这些差异蛋白的协同调控共同构成了Zunyimycin C抗炎效应的分子基础。KEGG通路富集分析表明，Zunyimycin C显著影响MAPK信号通路（P<0.01）和铁死亡通路（P<0.01）。值得注意的是，其对铁死亡通路的调控可能通过抑制脂质过氧化减轻氧化应激，这与AD病理中线粒体功能障碍密切相关（图8）^［11］。此外，干细胞多能性调控通路（P<0.05）的富集提示Zunyimycin C可能通过调节小胶质细胞分化参与神经修复，为AD干预提供了新的作用维度。本研究的局限性在于ZunyimycinC的具体作用机制尚未完全明确，未来需结合基因编辑技术（如CRISPR/Cas9敲低关键蛋白）和代谢组学分析，进一步解析通路间的因果关系。此外，动物模型中的药效验证及药代动力学研究将为临床转化提供重要依据。研究结果不仅有助于加深对小胶质细胞免疫调控的理解，更为开发“多靶点、多效应”的AD治疗药物提供了理论支撑。

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基金资助

国家自然科学基金(82060654)