基于网络药理学和体外实验探讨中药复方YA3D7抗阿尔茨海默病的作用机制

Exploring the mechanism of action of the traditional Chinese medicine compound YA3D7 against Alzheimer's disease based on network pharmacology and in vitro experiments

摘要

目的 运用网络药理学的方法，结合体外实验技术，探究中药复方YA3D7（川芎、当归、白术、茯苓、生姜）抗阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）的作用机理。 方法 运用网络药理学的相关数据库和软件工具，构建疾病-药物共同基因靶点的韦恩图，并对交集基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析及分子对接研究；体外细胞实验评估YA3D7对BV2细胞增殖能力的影响，检测YA3D7的抗氧化效能及羟自由基清除能力，并通过实时荧光定量PCR法检测M1型小胶质细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、分化簇86分子（cluster of differentiation 86，CD86）的mRNA表达情况。 结果 确定了复方YA3D7各成分与AD的130个交集靶点，KEGG富集分析结果显示，YA3D7干预AD主要与磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）等线粒体相关通路有关。体外细胞增殖实验结果显示，YA3D7浓度在50 μg/mL时BV2细胞增殖能力最强（P<0.05）；YA3D7在不同浓度梯度下分别表现出总抗氧化能力和羟自由基清除能力的剂量依赖性增强（P<0.05）；YA3D7处理显著降低了Aβ_25-35诱导的BV2细胞中iNOS、CD86的表达（P<0.05）。 结论 YA3D7可通过多途径、多靶点、多通路对AD发挥干预作用，为深入探究其在干预AD中的应用提供了理论依据。

Abstract

Objective This study employs network pharmacology approaches combined with in vitro experimental techniques to explore the mechanism of action of the traditional Chinese medicine compound YA3D7 （Chuanxiong， Danggui， Baizhu， Fuling， and Shengjiang） against Alzheimer's Disease （AD）. Methods Using relevant databases and software tools in network pharmacology， a Venn diagram of common gene targets between the disease and the drug was constructed. Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment analysis and molecular docking studies were performed on the intersecting genes. In vitro cell experiments were conducted to evaluate the effect of YA3D7 on the proliferation capacity of BV2 cells， detect the antioxidant efficacy and hydroxyl radical scavenging ability of YA3D7， and measure the mRNA expression levels of M1 microglial markers—inducible nitric oxide synthase （iNOS） and cluster of differentiation 86 （CD86）—by real-time fluorescent quantitative PCR. Results A total of 130 intersecting targets related to both YA3D7 components and AD were identified. KEGG enrichment analysis showed that YA3D7 for the intervention of AD was primarily associated with mitochondrial-related pathways， such as the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （Akt） and mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathways. In vitro cell proliferation assays confirmed that BV2 cells exhibited the highest proliferative capacity at a YA3D7 concentration of 50 μg/mL （P<0.05）. YA3D7 demonstrated dose-dependent enhancement of total antioxidant capacity and hydroxyl radical scavenging ability across different concentration gradients （P<0.05）. Intervention with YA3D7 significantly reduced the expression of iNOS and CD86 in Aβ_25-35-induced BV2 cells （P<0.05）. Conclusion YA3D7 can play an intervention role in AD through multi-pathway， multi-target， and multi-signaling mechanisms， providing a theoretical foundation for further exploration of its application in AD intervention.

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 网络药理学 / 体外实验 / 线粒体功能障碍

Key words

Alzheimer's disease / Network pharmacology / In vitro experiments / Mitochondria dysfunction

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease， AD）是一种以认知和记忆功能低下为主的进行性发展的神经退行性疾病，是痴呆症最常见的类型^［1］。相关数据统计，预计到2050年全球痴呆患者人数将高达1.13亿，这一问题不仅严重影响了AD患者的生活质量，也给家庭及社会带来了心理和经济压力^［2］。当下对AD的研究主要聚焦于β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein， Aβ）沉积、神经炎症反应等关键病理学因素。但越来越多的研究显示，线粒体功能障碍是AD发病机制中的早期事件^［3］，线粒体作为维持细胞能量代谢的“动力工厂”，一旦在AD病理进程中损伤，便会引发氧化应激反应、能量代谢功能紊乱及钙离子释放失衡等诸多负面效应，这些现象与AD的神经退行性病变进程紧密相连^［4］。

目前，临床用于治疗AD的西药主要有乙酰胆碱酯酶抑制剂及N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受体拮抗剂等^［5］，这些药物在一定程度上可延缓病情的进展，尚不能针对AD复杂的病理学机制实现根本性干预^［6］。因此，开发靶向干预AD且显著缓解症状的药物具有迫切的现实需求。研究表明，中药因其成分的多样性和复杂性在AD的防治措施中展现出潜在的疗效，中药可以有效地抵抗Aβ的沉积^［7］，阻断Tau蛋白异常磷酸化级联反应，改善中枢胆碱能神经递质系统功能和维持线粒体稳态^［8］。网络药理学是一门整合了医学生物学、信息科学和计算机科学等学科的多学科交叉研究领域，通过构建复杂的“药物-靶点-疾病”网络，分析三者相互作用关系^［9］。本研究拟采用网络药理学技术和体外实验探究YA3D7干预AD的主要有效成分和作用效应，为中药复方YA3D7的药理学研究提供一定的参考依据。

1 材料

1.1 实验选用细胞

小鼠小胶质细胞BV2细胞系购自中国典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 实验药材

中药复方YA3D7购自紫芸苑药业有限公司。

1.3 主要试剂

胎牛血清购自天杭生物科技股份有限公司（浙江），MEM培养基、胰蛋白酶、总抗氧化能力检测试剂盒及羟自由基清除能力检测试剂盒（购自北京索莱宝公司，北京）。

2 方法

2.1 使用网络药理学预测YA3D7抗AD的潜在靶点与通路

综合运用中药系统药理分析平台TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获取中药活性成分；UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）对靶点名称进行标准化处理；Genecards数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM数据库（https：//www.omim.org）及STRING数据库（https：//string-db.org）分别获得AD相关靶点及蛋白互作数据；微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn）用于靶点交集分析；DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）进行功能富集分析；Alzdata数据库（http：//www.alzdata.org）评估枢纽靶点的基因表达水平及其在脑内各类细胞中的含量；Cytoscape 3.7.1（https：//cytoscape.org）进行网络可视化。

2.2 通过分子对接预测活性成分和靶点蛋白之间的亲和力

本研究对YA3D7成分与核心靶点进行分子对接。通过TCMSP获取活性成分结构， RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org）获取靶点蛋白结构，使用AutoDock和Pymol软件进行处理及可视化分析。

2.3 体外实验

2.3.1 药物的制备

首先将药材浸泡于UP水中30分钟；随后，加入UP水按10：1比例煎煮，浓缩至100 mL；最后，烘干得5 g粉末。

2.3.2 细胞培养

将BV2细胞接种于完全培养基中，置于5% CO₂、37℃的培养箱中培养24 h，根据生长情况定期传代。

2.3.3 SRB法检测YA3D7对BV2细胞增殖能力的影响

采用SRB法检测细胞增殖能力，取对数生长期的BV2细胞以5×10⁴/mL接种在96孔板上。实验分对照组（加MEM完全培养液）、0.01% DMSO处理组和不同浓度的中药处理组，每组设3个复孔。每个样品在490 nm波长测吸光度值。

2.3.4 RT-qPCR检测YA3D7处理后M1型小胶质细胞标志物iNOS、CD86的表达

使用TRlzol提取细胞总RNA，测定其纯度后，按照cDNA和qPCR试剂盒说明书进行逆转录和qPCR体系反应。

2.3.5 铁离子还原法（FRAP法）检测YA3D7的总抗氧化能力

体外总抗氧化能力采用Fe³⁺还原试剂盒测定^［10］，每个样品在593 nm波长处的吸光度平行测定3次。

2.3.6 羟自由基清除实验检测YA3D7的羟自由基清除能力

清除羟自由基能力的测定采用Fenton反应试剂盒法^［11］，每个样品在536 nm波长处的吸光度平行测定3次。

2.3.7 统计学方法

使用Graph Pad Prism 10软件执行数据处理任务，数据以（\overline{x}±s）的形式展现，设定P<0.05为组间差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 抗AD潜力中药的挖掘

本研究依托TCMSP中医药数据库资源，以线粒体功能障碍及阿尔茨海默病作为搜索条件，筛选出具备潜在疗效的中药单体。同时，通过广泛查阅大量中英文文献，挖掘出使用频率较高的常用中药，并以此建立数据库。运用Excel 2019软件，从该数据库中筛选出使用频率位居前18的中药（表1），将其作为核心中药进行组方。随后，采用网络药理学方法对组方进行优化，最终成功地获得四组中药方剂，具体如下：组方一由白术、茯苓、川芎、当归、生姜组成；组方二由人参、黄芪、淫羊藿、菟丝子、山药组成；组方三由甘草、防风、陈皮、枸杞子组成；组方四涵盖熟地黄、党参、柴胡、三七。前期网络药理学预测结果表明，组方一在信号通路（前 20 条）、核心靶点（TOP10）以及生物学过程等方面的关联强度均优于其他组方。基于此，本研究选定组方一开展深入的研究，并将其命名为YA3D7。依据吴红彦等^［12-13］的研究成果，剂量调整为：川芎10 g、当归9 g、白术12 g、茯苓12 g、生姜9 g。

3.2 中药成分靶点、疾病靶点的筛选和韦恩图制作

3.2.1 中药成分靶点筛选

通过使用TCMSP数据库，以化合物类药性DL≥0.18，口服利用度OB≥30%来筛选出符合条件的化合物共36种，来自白术7种、茯苓15种、当归2种、川芎7种、生姜5种；经UniProt等数据库获取相关活性成分对应靶点且删除重复值后共获得成分靶点361个。

3.2.2 疾病靶点的筛选和韦恩图制作

以“Alzheimer's Disease”为关键词，在Genecards数据库、OMIM数据库中检索去重后，得到疾病靶点2 029个，使用微生信在线平台将药物靶点和疾病靶点取交集，共获取交集靶点130个，得到韦恩图如图1A所示。

3.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）构建

如图1B右图所示，PPI网络图中有130个节点，191条边；根据度值进行筛选获得网络中前十的关键靶点（图1B 左图），其中包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）等。

3.4 化合物-靶点-通路网络构建和KEGG功能富集分析

3.4.1 药物-靶点-信号通路网络图

如图2A所示，YA3D7能够与AKT1、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3， MAPK3）等关键靶点发生相互作用。

3.4.2 KEGG通路富集分析的桑基图

KEGG通路富集分析结果显示共有151条通路获得P<0.05。如图2B所示，气泡的大小表示通路基因数量的多少，气泡越大越显著；气泡的颜色代表通路的显著性，颜色越接近红色越显著，Gene Ratio代表基因比例。通过KEGG富集分析发现药物和疾病共有靶点与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B， Akt）、 MAPK、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products， AGE）等线粒体通路密切相关。

3.5 枢纽靶点的基因表达模式

分析多个基因在不同细胞类型（星型胶质细胞、小胶质细胞、神经元等）中的表达水平；如图3A-D所示，这四个靶点在小胶质细胞中均有较高的表达。因此，体外实验中选用小胶质细胞来开展细胞实验；如图3E、3F呈现了不同基因在对照组和AD组中的跨平台标准化表达水平，TNF、B细胞淋巴瘤/白血病2基因（B-cell lymphoma/leukemia gene 2， Bcl-2）在AD组的表达水平中位数高于对照组，这两个靶点在AD状态下呈上调趋势可作为YA3D7干预AD的潜在靶点。

3.6 分子对接预测重要成分与核心靶点的亲和力

将主要成分去氢表儿茶素、酒酵母甾醇等与核心靶点TNF、AKT1等进行分子对接验证，如表2所示，结合能均小于-5 kcal/mol（结合能绝对值越大越稳定）。表2数据表明YA3D7关键成分与关键靶点结合良好，可视化结果如图4所示。

3.7 YA3D7对BV2细胞增殖能力的影响

如图5A所示，BV2细胞经不同浓度YA3D7处理36小时后，细胞并未出现死亡，且在50 μg/mL时细胞增殖活性最高（P<0.05），当药物浓度进一步增加时，增殖能力反而逐渐减弱。

3.8 RT-qPCR检测BV2细胞相关iNOS、CD86的mRNA表达水平

如图5B、5C所示，与β-淀粉样蛋白25~35（Aβ_25-35）诱导的BV2细胞对照组相比，YA3D7处理的M1型小胶质细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、分化簇86分子（cluster of differentiation 86，CD86）表达水平显著降低（P<0.05），这一结果表明，YA3D7在一定浓度范围内可有效地抑制M1型小胶质细胞的活化。

3.9 YA3D7对总抗氧化能力和羟自由基清除能力的影响

如图6A所示，设置0.5、1、2、4、8 mg/mL的药物浓度梯度，YA3D7的抗氧化能力随浓度升高显著增强（P<0.05）。如图6B所示，设置4、8、16、32、64 mg/mL的药物浓度梯度，YA3D7的羟自由基清除能力亦随浓度的增加而上升（P<0.05）。以上结果表明，YA3D7在体外具有良好的抗氧化能力和羟自由基清除能力。

4 讨论

中药复方是一个由多味单药配伍组合而成的复杂体系，其多靶点、多途径、多层次的特性在干预AD过程中发挥重要作用^［14］。网络药理学通过构建化合物-靶点网络图来预测药物治疗疾病时潜在靶点及通路，揭示药物作用机制^［15］。PPI分析结果表明各靶点之间联系极为密切，通过上调或下调TNF、AKT1等细胞因子干预AD，这与大多数研究一致^［16］；KEGG通路富集分析显示，YA3D7干预AD主要与PI3K/Akt、MAPK及AGE-RAGE等信号通路相关。PI3K/Akt信号通路在维持神经元突触可塑性、抑制小神经胶质细胞异常活化、保障线粒体功能完整等方面发挥重要作用^［17］；MAPK通路在细胞内主要发挥信号转导和免疫调节的作用^［18］；有研究显示，2型糖尿病与AD发病进程有着紧密的关联^［19］，在高糖状态下AGE大量聚集，诱导活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）过度生成，引发细胞的不可逆损伤和神经元数量减少^［20］，YA3D7可能通过抑制脑内AGE与AGE受体（receptor for AGE， RAGE）的结合，减少 ROS产生，修复受损突触神经元，改善认知功能。分子对接结果显示，YA3D7中的关键成分去氢表儿茶素、酒酵母甾醇等与核心靶点TNF、AKT1等展现出良好的结合活性，从分子层面为阐明YA3D7的潜在药效机制提供了证据支持。体外实验进一步验证了YA3D7的有效性和安全性，在细胞增殖实验中，BV2细胞经YA3D7处理36小时后，其增殖活性在50 μg/mL时最强（P<0.05）。总抗氧化能力和羟自由基清除能力检测实验通过对不同浓度梯度下YA3D7的抗氧化能力进行评估，结果显示，其总抗氧化能力和羟自由基清除能力均呈现出剂量依赖性的显著增强趋势（P<0.05），说明YA3D7具备良好的抗氧化潜力，在病理学条件下能够有效地清除体内过多的羟自由基，减轻氧化应激对神经元造成的损伤。RT-qPCR结果显示，在Aβ_25-35诱导的BV2细胞炎症模型中，经YA3D7处理后M1型小胶质细胞标志物iNOS、CD86的表达水平明显降低（P<0.05），说明YA3D7能够调控相关基因的表达，抑制M1型小胶质细胞的活化进而能够有效地缓解炎症。

然而本研究存在一定的局限性：缺乏更加严谨的体内实验验证，对YA3D7主要入血成分及功能未深入探讨。基于上述不足，后续研究将采用APP/PS1转基因小鼠作为AD体内动物模型，运用多组学技术，进一步探究YA3D7在体内的药物代谢动力学特征及药效学效应，全面揭示YA3D7的作用机制，明确各成分之间的协同关系。为研发安全性更高、疗效更优的AD干预药物奠定了坚实的基础。

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基金资助

延安大学科研计划项目(2023KXJ-012)

延安大学科研计划项目(2023CGZH-001)