免疫检查点抑制剂对晚期肺癌患者外周血淋巴细胞亚群及细胞因子水平的影响

The impact of immune checkpoint inhibitors on peripheral blood lymphocyte subsets and cytokine levels in patients with advanced lung cancer

摘要

目的 探讨免疫检查点抑制剂对晚期肺癌患者外周血淋巴细胞亚群及细胞因子水平的影响。 方法 采用流式细胞术检测32例晚期肺癌患者免疫治疗前、免疫治疗2周期后的外周血T淋巴细胞亚群（包括CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比值）、B淋巴细胞（CD19⁺）、NK细胞（CD16⁺CD56⁺）的绝对值计数，以及相关细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）的水平。 结果 32例肺癌患者免疫治疗前淋巴细胞亚群与年龄呈负相关，Ⅲ期患者淋巴细胞计数高于Ⅳ期。治疗2周期后，CD3⁺T、CD4⁺T及CD19⁺B细胞显著上升，CD8⁺T细胞下降；肺鳞癌、肺腺癌及Ⅲ、Ⅳ期患者均呈现CD3⁺T、CD4⁺T上升和CD8⁺T下降趋势。治疗后处于免疫抑制状态的人数比例从28.1%下降至3.1%，IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均显著提高。 结论 年轻患者在免疫治疗前具有更高的外周免疫活性；随着肿瘤的进展，患者外周免疫功能降低，免疫抑制程度逐渐加重。不同病理学类型、不同临床分期的肺癌患者接受免疫治疗2周期后外周免疫应答存在一定差异；且经免疫检查点抑制剂治疗2周期后，能够恢复机体CD4⁺T细胞的数量，提升整体免疫功能，有效地延缓疾病进展。细胞因子的动态变化（IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ）可辅助评价细胞免疫功能状态，揭示了免疫治疗下免疫微环境的重塑机制。

Abstract

Objective To investigate the impact of immunosuppressive agents on peripheral blood lymphocyte subsets and cytokine levels in patients with advanced lung cancer. Methods Flow cytometry was used to measure the absolute counts of peripheral blood T lymphocyte subsets （including CD3⁺， CD4⁺， CD8⁺， and the CD4⁺/CD8⁺ ratio）， B lymphocytes （CD19⁺）， and NK cells （CD16⁺CD56⁺）， as well as the levels of related cytokines （IL-2， IL-4， IL-6， IL-10， TNF-α， IFN-γ） in 32 patients with advanced lung cancer before and after two cycles of immunotherapy. Results In the 32 lung cancer patients， lymphocyte subsets before immunotherapy showed a negative correlation with age， and patients with stage Ⅲ disease had higher lymphocyte counts than those with stage Ⅳ. After two cycles of treatment， CD3⁺T， CD4⁺T， and CD19⁺B cells increased significantly， while CD8⁺T cells decreased. Patients with lung squamous cell carcinoma， lung adenocarcinoma， and those with stage Ⅲ or Ⅳ disease all showed a trend of increased CD3⁺T and CD4⁺T cells and decreased CD8⁺T cells. The proportion of patients with immunosuppression decreased from 28.1% to 3.1% after treatment， and the levels of IL-2， IL-6， TNF-α， and IFN-γ were significantly elevated. Conclusion Younger patients exhibited higher peripheral immune activity prior to immunotherapy. As the tumor progressed， patients' peripheral immune function declined， and the degree of immunosuppression gradually worsened. Differences in peripheral immune response were observed after two cycles of immunotherapy among patients with different pathological types and clinical stages of lung cancer. Furthermore， two cycles of treatment with immunosuppressive agents were able to restore the number of CD4⁺ T cells， enhance overall immune function， and effectively delay disease progression. The dynamic changes in cytokines （IL-2， IL-6， TNF-α， and IFN-γ） can assist in evaluating cellular immune function status， revealing the remodeling mechanism of the immune microenvironment under immunotherapy.

Graphical abstract

关键词

肺癌 / 免疫检查点抑制剂 / 外周血淋巴细胞亚群 / 细胞因子

Key words

Lung cancer / Immune checkpoint inhibitors / Peripheral blood lymphocyte subsets / Cytokines

肺癌是全球重大健康威胁，发病率和死亡率居高不下，位居癌症死因之首^［1］。长期以来，肺癌的主要治疗手段包括手术、放疗和化疗，然而传统治疗方法疗效有限。近年来，免疫治疗通过激活人体自身免疫系统攻击肿瘤细胞，彻底改变了晚期肺癌的治疗格局。其中，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂通过“松开”T细胞的“刹车”发挥抗癌作用，为患者带来了长期生存的希望。研究^［2］表明，肺癌的发生与发展不仅取决于肿瘤细胞自身，更受到肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的深刻调控。有学者^［3］提出的“种子与土壤”学说便强调肿瘤细胞与周围环境之间存在密切关系。TME是一个由肿瘤细胞、多种免疫细胞、基质细胞及信号分子等构成的复杂生态系统^［4］，在肺癌进展、免疫逃逸及治疗响应中发挥关键作用。在TME中，免疫细胞占据核心地位，主要包括肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）等。TIL中的T淋巴细胞，尤其是CD4⁺和CD8⁺T细胞，在抗肿瘤免疫中具有重要作用^［5］。CD4⁺T细胞可分化为Th1、Th2、Th17及调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）等亚型^［6］。Th1通过分泌IFN-γ、TNF-α等因子促进抗肿瘤免疫，而Th2和Treg则通过IL-4、IL-10、TGF-β等介导免疫抑制。CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），能够直接识别并杀伤肿瘤细胞，但其功能在TME中常因Treg浸润或耗竭而受损^［7］。CD4⁺/CD8⁺T细胞比值的变化可作为免疫状态的重要指标，比值降低通常提示免疫抑制及不良预后^［8］。

由于肿瘤组织活检存在异质性高、侵入性强及难以动态监测等问题，近年来外周血免疫指标逐渐成为评估整体免疫状态及预测免疫治疗响应的重要生物标志物^［9］。外周血中T细胞亚群比例、克隆扩增程度、耗竭标志物（如PD-1）表达等，均可反映TME的免疫状态^［10］。如，PD-1高表达的CD8⁺T细胞与PD-1/PD-L1抑制剂疗效相关，而Treg或髓源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）比例升高则通常提示治疗抵抗^［11］。外周血不仅可作为预测生物标志物的来源，还可作为治疗调节的靶点。通过细胞因子干预、联合化疗或免疫调节剂以逆转T细胞耗竭、降低Treg比例，已成为优化免疫治疗策略的重要方向^［11-12］。

因此，本研究选择通过对外周血淋巴细胞亚群的动态监测，评估肺癌患者的免疫状态，以期克服组织活检的局限性，为优化免疫治疗及提高患者临床获益提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入2023年12月至2025年1月在延安大学附属医院确诊的肺癌患者。纳入标准：① 组织病理学检查确诊为肺癌；② 临床分期为Ⅲ-Ⅳ期。③ 美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group， ECOG）评分≤2分；④ 接受免疫联合化疗作为系统抗肿瘤治疗；⑤ 临床资料完整；⑥ 年龄>18岁。排除标准：① 患有急性感染、免疫缺陷和自身免疫性疾病者；② 既往接受过免疫治疗；③ 另一种原发性肿瘤的病史；④ 正在接受全身性皮质激素治疗者；⑤ 免疫过敏者。最终共筛选出32例符合研究条件的患者，均经组织病理学检查确诊为肺鳞癌、肺腺癌或小细胞肺癌。所有入组患者在充分知情的前提下签署免疫治疗知情同意书，研究方案已通过本院伦理委员会审查。所有患者的住院病历资料完整且所有临床数据可溯源。

1.2 治疗方案

所有患者（n=32）每3周接受一次含铂类药物的标准化疗方案，具体方案包括：白蛋白结合型紫杉醇（260 mg/m²）或培美曲塞（500 mg/m²）或依托泊苷（100 mg/m²）联合卡铂（AUC=5）或顺铂（75 mg/m²），并联合PD-1/PD-L1单抗治疗。所使用的免疫治疗药物包括：帕博利珠单抗（200 mg）、纳武利尤单抗（3 mg/kg）、卡瑞利珠单抗（200 mg）、信迪利单抗（200 mg）、替雷利珠单抗（200 mg）或度伐利尤单抗（1 200 mg）。

1.3 标本获取

在肺癌患者首次接受免疫治疗前及治疗第2个周期结束后24 h内，采集清晨空腹状态下的外周静脉血2 mL。

1.4 淋巴细胞亚群水平检测

1.4.1 主要仪器与试剂

血液样本采集使用乙二胺四乙酸二钾（ethylenediamine tetra-acetic acid dipotassium，EDTA-K₂）抗凝管；流式细胞术相关试剂包括BD TrucountTM管及配套溶血试剂，均购自美国BD公司。

1.4.2 检测步骤

每例样本使用一支标记好编号的BD TrucounTM管。精准移取20 μL预混试剂，注意避免扰动微球，直接加至管底；取50 μL充分混匀的抗凝全血样本，加入含试剂的BD TrucounTM管中；盖紧管盖后，使用涡旋振荡器轻柔混匀，确保试剂与血样充分接触。随后于室温避光条件下孵育15 min；向反应体系中加入450 μL 1×BD荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activeel Cell Sorting，FACS）裂解液，立即轻柔涡旋混匀。同样在室温避光条件下继续孵育15 min将制备好的单细胞悬液直接上机，使用流式细胞仪测定外周血中T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞的绝对计数。

1.5 炎症细胞因子水平的检测

1.5.1 主要仪器与试剂

本研究采用青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司生产的人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒（流式荧光法）进行细胞因子水平检测。实验主要使用以下仪器设备：流式细胞仪、移液系统（含50 μL、200 μL和1 mL移液器及配套吸头）、1.5 mL Eppendorf试管、涡旋混匀器、恒温孵育振荡器、离心机。

1.5.2 检测步骤

采用流式荧光法检测血清样本中炎症相关细胞因子的表达水平。实验前，严格依据试剂盒说明书完成血清样本的采集与制备，并配制微球、洗涤缓冲液、基质B及各级校准品。校准品稀释过程中，取6支Eppendorf试管编号为C6至C1，每管加入75 μL实验缓冲液。取25 μL高浓度校准品C7加入C6管，充分混匀后获得浓度为2500 pg/mL的C6校准品，随后采用4倍梯度稀释法依次制备C5至C1校准品。

样本检测阶段严格遵循实验手册进行加样，并在避光条件下振荡孵育以促进细胞因子充分结合。随后对样品进行离心、涡旋混匀与重悬处理，确保反应体系均匀一致。

1.6 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件包进行数据整理与分析，利用Graphpad prism 8.0软件进行作图。计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，两组间采用独立样本t检验，自身前后对照数据采用配对t检验进行比较。计数资料采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前淋巴细胞亚群与临床特征的相关性

年龄≤65岁患者CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD16⁺CD56⁺细胞计数显著高于>65岁组（P<0.05，表1）。Ⅲ期患者CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺细胞计数高于Ⅳ期（P<0.05，图1）。而性别、病理学类型对治疗前淋巴细胞亚群无显著影响（P>0.05，表2、表3）。

2.2 免疫治疗对研究对象外周血淋巴细胞亚群水平的影响

2.2.1 研究对象免疫治疗前后外周血淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况

纳入患者接受免疫治疗2周期后，外周血中CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD19⁺B细胞的绝对计数较治疗前显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05），相较而言，CD8⁺T细胞的绝对计数在治疗后出现显著下降，差异同样具有统计学意义（P<0.05，图2）。此外，CD16⁺CD56⁺NK细胞的绝对计数在免疫治疗后虽有升高趋势，但差异并无统计学意义（P=0.05）。

2.2.2 不同病理学类型患者免疫治疗前后外周血淋巴细胞亚群的绝对计数

在鳞状细胞癌患者中，接受免疫治疗2周期后CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞的绝对计数及CD4⁺/CD8⁺比值较治疗前显著升高，而CD8⁺T细胞绝对计数显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05，图3）。在腺癌患者中观察到相似的变化趋势：CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞绝对计数及CD4⁺/CD8⁺比值在治疗2周期后显著升高，CD8⁺T细胞绝对计数下降，差异同样具有统计学意义（P<0.05，图4）。此外，在小细胞肺癌患者中，免疫治疗2周期后CD3⁺T细胞与CD4⁺T细胞的绝对计数亦显著高于治疗前，差异具有统计学意义（P<0.05，图5）。

2.2.3 不同临床分期患者免疫治疗前后外周血淋巴细胞亚群的绝对计数

在Ⅲ期肺癌患者中，免疫治疗2周期后外周血CD3⁺T细胞和CD4⁺T细胞的绝对计数较治疗前显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05，图6）。而在Ⅳ期肺癌患者中，免疫治疗2周期后CD3⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞的绝对计数及CD4⁺/CD8⁺比值均较治疗前显著上升，CD8⁺T细胞绝对值计数较治疗前显著下降，差异均具有统计学意义（P<0.05，图6）。

2.3 免疫治疗前后CD4⁺/CD8⁺的比值

免疫治疗2周期后患者的免疫状态较治疗前发生显著改变，处于免疫抑制状态（CD4⁺/CD8⁺<1.0）的患者数量明显减少（从28.1%下降到3.1%），变化具有统计学意义（P<0.05，图7）。

2.4 免疫治疗前后细胞因子的变化

免疫治疗2周期后，IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平均较免疫治疗前显著上升（图8），差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

肺癌患者常伴随免疫系统功能受损，表现为多种免疫细胞如T细胞、B细胞、NK细胞、DC及MDSC等的功能异常^［13］。特别是在CD8⁺T细胞中，PD-1、CTLA-4等免疫检查点分子过度表达，导致其杀伤功能下降，细胞因子（如IFN-γ、TNF-α和IL-2）分泌减少，代谢重编程异常（如糖酵解能力减弱），增殖与效应功能受限，呈现衰竭状态^［14］。此外，辅助T细胞亚群也发生改变^［15］：支持抗肿瘤免疫的Th1细胞减少，而具有免疫抑制功能的Treg增多，进一步促进免疫逃逸。基于此，本研究通过分析晚期肺癌患者在接受免疫治疗2周期前后外周血淋巴细胞亚群及细胞因子的动态变化，旨在明确免疫治疗对患者免疫状态的影响。

本研究结果显示，年龄是影响免疫状态的重要因素。≤65岁组在治疗前的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞、B细胞及NK细胞计数均显著高于>65岁组（P<0.05），提示年轻患者基线免疫活性更强，可能与年龄相关的“免疫衰老”现象有关^［16］。免疫衰老伴随胸腺退化、初始T细胞生成减少、慢性低度炎症等改变，导致免疫应答能力下降，在老年肿瘤患者中尤为显著^［17］。疾病分期也与免疫功能密切相关^［18］。Ⅲ期患者的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞及B细胞计数在治疗前均高于Ⅳ期患者（P<0.05），说明随着疾病进展，免疫抑制状态加剧，可能与肿瘤负荷增加、T细胞耗竭及免疫微环境抑制有关^［19］。

不同病理学类型患者对免疫治疗的反应存在一定差异^［20］。在鳞癌和腺癌患者中，治疗后CD3⁺、CD4⁺ T细胞计数及CD4⁺/CD8⁺比值显著上升，CD8⁺T细胞计数下降（P<0.05），提示免疫治疗更显著激活CD4⁺T细胞应答。小细胞肺癌组中也观察到CD3⁺及CD4⁺T细胞计数升高，但CD8⁺T细胞变化不显著，仍反映出一定免疫激活效应。进一步比较不同分期患者在免疫治疗前后的免疫应答差异：Ⅲ期患者在治疗后CD3⁺、CD4⁺T细胞计数显著升高（P<0.05）；而在Ⅳ期患者中，接受免疫治疗2周期后CD3⁺、CD4⁺T细胞的绝对值计数及CD4⁺/CD8⁺比值均较治疗前显著上升，CD8⁺T细胞绝对值计数较治疗前显著下降。无论临床分期如何，免疫治疗均可在一定程度上促进患者T细胞亚群的恢复与激活，尤其在Ⅳ期肺癌患者中基线免疫抑制更严重，免疫治疗后CD4⁺T细胞能够短暂激活T细胞介导的免疫应答，具有一定的免疫重塑作用，且表现出更广泛的T细胞应答。

免疫治疗显著改变了外周免疫细胞组成：治疗后CD3⁺、CD4⁺ T细胞及CD19⁺ B细胞计数显著上升，CD8⁺ T细胞计数下降（P<0.05）。更重要的是，CD4⁺/CD8⁺比值<1的免疫抑制状态患者比例从28.1%显著下降至3.1%（P<0.05），说明治疗有助于重建免疫平衡，尤其通过恢复CD4⁺T细胞数量增强整体免疫功能。

细胞因子分析显示，治疗后IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均较治疗前显著上升（P<0.05）。这些变化不仅反映了T细胞功能的恢复，也揭示免疫微环境在治疗过程中的动态重塑，提示这些细胞因子具备作为疗效监测生物标志物的潜力。

免疫治疗可在不同病理学类型和分期的肺癌患者中诱导差异性的免疫应答，尤其以CD4⁺T细胞的恢复和细胞因子水平的提升为共同特征。外周血淋巴细胞亚群及细胞因子的动态变化可作为评估免疫重建和治疗反应的有力工具，有助于构建预测模型，推动个体化免疫治疗策略的发展。鉴于本研究样本量有限，且标本采集时间范围跨度较大，尤其考虑到各研究指标在疾病发生、发展及治疗过程中存在显著的动态演变特征，当前得出的结论在代表性和普适性方面可能存在一定局限。研究成果的最终临床转化与应用，亟待通过样本量更充足的多中心前瞻性研究来加以验证与深化。

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基金资助

延安大学附属医院科学技术研究发展计划项目(2022ZD-09)