地椒提取物对LPS诱导系统性炎症的保护作用

Study on the protective effects of extracts from Thymus quinquecostatus Celak against LPS-induced systemic inflammation

摘要

目的 探究地椒提取物（百里香酚、香芹酚、挥发油、提取液、β-反式石竹烯和4-异丙基甲苯）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的系统性急性炎症损伤的保护作用。 方法 将45只雄性昆明小鼠随机分为空白对照组、模型对照组（大豆油）、阳性对照组（白藜芦醇）以及6个地椒提取物干预组。灌胃给药（50 mg/kg）7 d后，腹腔注射LPS（5 mg/kg）建立系统性炎症模型。24 h后进行热痛和悬尾实验。采用ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平；RT-qPCR检测胸腺、脾脏及大脑皮质中炎症因子mRNA表达；生化法检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性；Western blot检测大脑皮质中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）及其磷酸化蛋白（p-NF-κB）表达。 结果 与模型组比较，地椒提取液和β-反式石竹烯显著抑制胸腺中促炎因子TNF-α、IL-2和IL-6 mRNA表达（P<0.05， P<0.01）；4-异丙基甲苯和挥发油显著下调脾脏中TNF-α mRNA表达（P<0.05）；百里香酚与香芹酚在外周及中枢均表现出广谱抗炎活性，显著降低血清中TNF-α和IL-1β含量（P<0.05），并下调大脑皮质中p-NF-κB/NF-κB比值（P<0.05）。行为学上，百里香酚与香芹酚显著缩短悬尾静止时间（P<0.05），延长热痛反应潜伏期（P<0.05），其效果与阳性药白藜芦醇相当。抗氧化方面，地椒提取物能够协同提升SOD和GSH-Px活性，降低MDA和H₂O₂含量，其中香芹酚的抗氧化效果最为显著。 结论 地椒通过多种活性物质协同发挥抗炎、抗氧化以及神经保护作用，其独特成分组合（如百里香酚、香芹酚、挥发油）的协同效应可能是其区别于其他Thymus属植物的优势所在，为开发针对系统性炎症及其神经并发症的天然药物或功能性食品提供了实验依据。

Abstract

Objective To investigate the protective effects of extracts from Thymus quinquecostatus Celak （thymol， carvacrol， volatile oil， crude extract， β-caryophyllene， and 4-isopropyltoluene） against lipopolysaccharide （LPS）-induced systemic acute inflammatory injury. Methods Forty-five male Kunming mice were randomly divided into a blank control group， a model control group （soybean oil）， a positive control group （resveratrol）， and six Thymus quinquecostatus Celak extract intervention groups. After 7 days of intragastric administration （50 mg/kg）， a systemic inflammation model was established by intraperitoneal injection of LPS （5 mg/kg）. Thermal pain and tail suspension tests were performed 24 hours later. Serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） were measured by ELISA； mRNA expression of inflammatory factors in the thymus， spleen， and cerebral cortex was detected by RT-qPCR； malondialdehyde （MDA） and hydrogen peroxide （H₂O₂） content， as well as superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px） activities， were determined by biochemical assays； and the expression of nuclear factor kappa-B （NF-κB） and its phosphorylated protein （p-NF-κB） in the cerebral cortex was evaluated by Western blot. Results Compared with the model group， the crude extract and β-caryophyllene significantly inhibited mRNA expression of pro-inflammatory factors TNF-α， IL-2， and IL-6 in the thymus （P<0.05， P<0.01）； 4-isopropyltoluene and volatile oil significantly down-regulated TNF-α mRNA expression in the spleen （P<0.05）； thymol and carvacrol exhibited broad-spectrum anti-inflammatory activity both peripherally and centrally， significantly reducing serum levels of TNF-α and IL-1β （P<0.05） and down-regulating the p-NF-κB/NF-κB ratio in the cerebral cortex （P<0.05）. Behaviorally， thymol and carvacrol significantly shortened the immobility time in the tail suspension test （P<0.05） and prolonged the latency of the thermal pain response （P<0.05）， with effects comparable to those of the positive drug resveratrol. In terms of antioxidant effects， the Thymus quinquecostatus Celak extracts synergistically increased SOD and GSH-Px activities and reduced MDA and H₂O₂ levels， with carvacrol showing the most pronounced antioxidant effect. Conclusion Thymus quinquecostatus Celak exerts anti-inflammatory， antioxidant， and neuroprotective effects through the synergistic actions of multiple active substances. The unique combination of its components （such as thymol， carvacrol， and volatile oil） and their synergistic effects may represent an advantage over other Thymus species， providing an experimental basis for the development of natural medicines or functional foods targeting systemic inflammation and its neurological complications.

Graphical abstract

关键词

地椒 / 系统性炎症 / 氧化应激 / LPS / 保护作用

Key words

Thymus quinquecostatus Celak / Systemic inflammation / Oxidative stress / LPS / Protective effect

系统性炎症是多种急危重症与慢性病急性加重的共同病理环节。正常情况下，机体免疫与组织稳态处于精细的动态平衡，当受到内毒素如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等强刺激时，系统性炎症迅速放大，表现为以Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）及核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）为枢纽的炎性转录网络过度激活、炎症介质风暴、微循环与器官功能紊乱，最终导致多器官功能障碍综合征^［1-2］。流行病学研究^［3］显示，脓毒症等系统性炎症每年影响数千万人，其疾病负担在全球范围内持续加重。系统性炎症也可诱发神经系统疾病，通过破坏血脑屏障的完整性，促使外周免疫细胞和炎症因子进入中枢神经系统，诱发神经炎症，导致弥漫性脑功能障碍（包括抑郁样表现、认知下降、痴呆风险增加）^［4-5］。传统抗炎药物存在明显的抗药性及安全性问题，如糖皮质激素可致高血糖、感染易感、骨质代谢异常等不良反应^［6］；非甾体抗炎药存在胃肠道出血与心血管事件风险^［7-8］；高剂量静脉维生素C滴注对危重症系统性炎症无明确获益^［9］。因此，急需研发针对系统性炎症治疗的具备多通路协同调节能力且安全性更好的候选药物。天然产物尤其是药食同源活性成分，因同时作用于NF-κB、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）等炎症通路而具有安全高效等优势^［10］。

地椒（又名地花椒、山椒，Thymus quinquecostatus Celak）为唇形科植物^［11］，其味辛性温，具有祛风止咳、利湿通淋之功效^［12］。现代研究^［13］表明，地椒含有丰富的类黄酮、三萜皂苷、酚类等活性成分，在抗菌消炎、抗氧化、改善心脑血管缺血等方面具有潜在的应用价值^［14］。然而，针对其活性成分作用机制的研究仍较为有限。本研究采用LPS腹腔注射建立小鼠系统性急性炎症模型，旨在评价地椒提取物对系统性炎症损伤的保护作用，并探讨其抗炎抗氧化机制，为其作为功能性食品和天然抗炎药物的开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 动物

7周龄雄性昆明小鼠，体重40~45 g，购自陕西新程隆远生物科技有限公司，许可证号：SCXK（陕）2023-002。环境温度为22±3 ℃，自然昼夜，标准饲料喂养，自由进食饮水。实验方案经延安大学实验动物伦理委员会批准（伦理委员会批件号：YAU-G20240078）。

1.2 试剂与仪器

地椒活性物质：百里香酚（CAS#：89-83-8）、香芹酚（中农科化，CAS#：499-75-2）、挥发油（延安制药股份有限公司提供）、4-异丙基甲苯（MACKLIN，CAS#：99-87-6）、β-反式石竹烯（MACKLIN，CAS#：87-44-5）、地椒提取液（延安制药股份有限公司提供）；试剂级大豆油（Aladdin，CAS#：8001-22-7）；白藜芦醇（Aladdin，CAS#：501-36-0）；RT-qPCR试剂盒（11123ES）；LPS（Sigma，L2880）；兔源一抗NF-κB p65抗体（ABclonal，A19653）；Phospho-NF-κB p65（ABclonal，AP1294）；TNF-α ELISA试剂盒（FANKEWEI，F2312-A）；IL-1β ELISA试剂盒（FANKEWEI，F43264-A）；SOD、GSH-Px、MDA、H₂O₂检测试剂盒（Abbkine，批号KTB1030、KTB1640、KTB1050、KTB1041）

台式高速冷冻离心机（宁波北角生物科技有限公司，MP-H1-16KR）；实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司，2720500449）；基因扩增仪［杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H（b）］；酶联免疫分析仪（杭州奥盛仪器有限公司，FlexA-200）。

1.3 动物分组及处理

45只雄性昆明种小鼠随机分为9组（n=5）：空白对照组、模型对照组（大豆油）、阳性对照组（白藜芦醇）以及6个地椒活性物质干预组（百里香酚、香芹酚、地椒提取液、β-反式石竹烯、4-异丙基甲苯、挥发油）。每日灌胃50 mg/kg对应药剂^［15-16］，连续灌胃7 d。每天记录小鼠的水食消耗、体温和体重变化情况。第7天给药结束后除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS^［17］，空白对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 行为学检测

在LPS给药24 h后进行热痛实验、悬尾实验。

热痛实验：将热板仪调至55 ℃，随后将小鼠放置在热板上，同时开始计时；以小鼠舔后脚、原地跳跃或者明显缩脚作为标志，立即停止计时，记录小鼠对热痛的反应潜伏期，每只小鼠重复3次实验，每次间隔15 min。

悬尾实验：用小型夹子将小鼠尾巴的1/3处夹住悬挂在悬尾盒中的钩子上，记录其6 min内的运动静止时间。

1.5 炎症因子mRNA表达水平检测

采用Trizol法提取总RNA，经DNase消化去除基因组DNA后逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光定量PCR检测IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10 mRNA表达水平。使用引物见表1。

1.6 抗氧化指标检测

各组小鼠心尖取血后，收集血清，按照试剂盒说明书（KTB1030）测定各组小鼠血清中SOD活力；按照试剂盒说明书（KTB1640）测定各组小鼠血清中GSH-Px活力；按照试剂盒说明书（KTB1050）测定各组小鼠血清中MDA含量；按照试剂盒说明书（KTB1041）测定各组小鼠血清中H₂O₂含量。

1.7 酶联免疫吸附法测定TNF-α和IL-1β浓度

各组小鼠心尖取血后，收集血清，按照试剂盒说明书（F2312-A、F43264-A）操作，利用酶标仪测定样品的吸光度（OD值），计算测定各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β浓度。

1.8 Western blot检测小鼠大脑皮质中NF-κB蛋白表达情况

取小鼠大脑皮质组织，匀浆裂解后，加入上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，随后转膜至PVDF膜。室温5%脱脂奶粉中封闭2 h，4℃过夜孵育一抗NF-κB（1∶1000）、p-NF-κB（1∶1000）、β-actin（1∶40000），HRP标记二抗室温孵育2 h，洗膜后，加入ECL显影液，显影成像，使用Image J软件计算目的条带灰度值。

1.9 统计学方法

实验数据采用GraphPad Prism 9.5.1软件进行数据统计分析及作图。分析方法为单因素或双因素方差分析，Dunnett's多重比较检验，n=5，P<0.05为差异有统计学意义，在图表中分别以*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001标注不同水平的显著性差异。

2 结果

2.1 地椒提取物对小鼠正常生长状态无影响

通过记录各组小鼠灌胃地椒提取物7 d内小鼠整组体重和体温的变化情况发现，各组小鼠体重和体温与空白对照组小鼠相比无显著差异，体重呈逐渐增加趋势，体温无明显变化，表明地椒提取物对小鼠的生长状态无明显影响且无毒害作用，见图1。

2.2 地椒提取物抑制小鼠系统性炎症水平

为评估地椒提取物对小鼠炎症水平的影响，本研究采用ELISA和实时荧光定量PCR分别检测了各组小鼠血清中TNF-α与IL-1β的含量，以及胸腺和脾脏组织中炎症因子mRNA的表达变化。结果显示，与空白对照组相比，大豆油组小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量显著上升（P<0.0001），胸腺与脾脏中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达亦显著升高（P<0.01），提示LPS诱导的系统性炎症模型构建成功。与大豆油组相比，白藜芦醇、地椒提取液、挥发油、百里香酚和香芹酚处理组小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量均显著降低（P<0.01，图2）。

在胸腺组织中，地椒提取液与β-反式石竹烯可显著抑制TNF-α、IL-2和IL-6的mRNA表达（P<0.05）；白藜芦醇及各地椒干预组中IL-1β mRNA水平虽呈下降趋势，但差异无统计学意义。此外，白藜芦醇、地椒提取液、挥发油与香芹酚显著提升了IL-4 mRNA表达（P<0.05），地椒提取液亦显著上调了IL-10 mRNA水平（P<0.01）。上述结果表明，地椒提取液可有效地抑制胸腺中促炎因子表达并促进抗炎因子生成，从而缓解LPS诱导的炎症反应，见图3。

在脾脏组织中，LPS刺激显著提高了TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平（P<0.05），并降低了IL-10的表达（P<0.05）。与大豆油组相比，地椒提取液、4-异丙基甲苯、挥发油及百里香酚显著抑制了TNF-α mRNA表达（P<0.01）；地椒提取液亦显著降低了IL-1β mRNA水平（P<0.05）；白藜芦醇、β-反式石竹烯、挥发油和百里香酚显著下调了IL-6 mRNA表达（P<0.05）；IL-2 mRNA表达在各组间无显著差异；白藜芦醇、百里香酚和香芹酚显著促进了IL-4 mRNA表达（P<0.01）；白藜芦醇和β-反式石竹烯显著提升了IL-10 mRNA水平（P<0.05，图4）。

本研究发现地椒提取物在胸腺与脾脏中对炎症因子的调节具有组织与成分特异性：胸腺中以地椒提取液和β-反式石竹烯对促炎因子（TNF-α、IL-2、IL-6）的抑制效果最为显著；脾脏中则以4-异丙基甲苯与挥发油对TNF-α的下调作用最为突出。该差异提示地椒的抗炎效应由多种活性成分协同介导，而非单一组分主导。

2.3 地椒提取物提高小鼠抗氧化能力

炎症发生常伴随氧化应激损伤。为评估地椒提取物的抗氧化作用，本研究检测了LPS刺激后小鼠血清中SOD和GSH-Px活性。结果显示，与空白对照组相比，LPS诱导的大豆油组小鼠血清SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.001，P<0.000 1）。与大豆油组相比，白藜芦醇、百里香酚和香芹酚处理组SOD活性显著升高（P<0.001）；白藜芦醇、β-反式石竹烯和香芹酚组GSH-Px活性亦显著增强（P<0.01），提示上述成分可有效地增强抗氧化酶活性，缓解氧化应激反应，见图5。

进一步检测血清中MDA和H₂O₂含量发现，LPS刺激后大豆油组MDA和H₂O₂水平显著高于空白对照组（P<0.0001，P<0.001）；而与大豆油组相比，白藜芦醇、百里香酚和香芹酚显著降低MDA含量（P<0.05），白藜芦醇、地椒提取液、4-异丙基甲苯、挥发油及香芹酚显著降低H₂O₂水平（P<0.05），结果表明，各地椒提取物均能提升机体抗氧化能力，其中香芹酚在增强抗氧化酶活性及清除过氧化产物方面作用最为显著，见图6。

2.4 地椒提取物改善LPS诱导的行为异常

LPS诱发的系统性炎症常引起神经性炎症并伴发抑郁样行为及痛敏异常表型，为探究地椒提取物对LPS诱导的行为异常的作用，分别通过悬尾实验和热痛实验检测地椒提取物对LPS诱导的小鼠抑郁样行为和热痛的作用。悬尾实验显示，LPS模型组小鼠静止时间显著长于空白对照组（P<0.001）；而白藜芦醇、地椒提取液、百里香酚和香芹酚处理组静止时间显著缩短（P<0.05），提示其可缓解抑郁样行为。热痛实验表明，LPS导致小鼠热痛阈值显著下降（P<0.05），而白藜芦醇、百里香酚和香芹酚能显著提高热痛阈值（P<0.05），提示其具有一定镇痛作用，见图7。

2.5 地椒提取物改善小鼠神经系统炎症

为探究地椒提取物对小鼠神经系统炎症的影响，采用RT-qPCR检测大脑皮质中炎症因子mRNA表达。结果显示，与空白对照组相比，LPS刺激后，促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表达显著上升（P<0.0001），抑炎因子（IL-4、IL-10）表达下降；而与大豆油组相比，白藜芦醇、挥发油、百里香酚和香芹酚可显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达（P<0.05），显著升高IL-10的表达（P<0.05），其中白藜芦醇和香芹酚可显著升高IL-4的表达（P<0.05，P<0.00），表明白藜芦醇、挥发油、百里香酚和香芹酚对神经炎症具有明显抑制作用，见图8。

Western blot结果显示，与空白对照组相比，LPS刺激后引起大脑皮质p-P65/P65比值显著升高（P<0.0001）；而与大豆油组相比，白藜芦醇、挥发油、百里香酚和香芹酚能显著抑制p-P65/P65表达（P<0.05），提示白藜芦醇、挥发油、百里香酚和香芹酚对NF-κB通路中相关分子的表达有一定的抑制作用，从而减轻LPS诱导的神经炎症，见图9。

3 讨论

本研究基于LPS诱导的小鼠系统性炎症模型，系统评价了地椒提取物（含挥发油、百里香酚、香芹酚、β-反式石竹烯和4-异丙基甲苯）在抗炎、抗氧化及神经保护方面的作用。LPS刺激导致小鼠促炎因子显著升高，抗炎因子下降，呈现典型炎症反应特征^［18-19］。地椒提取物预处理后，各干预组促炎因子mRNA表达水平均有所下降，而抗炎因子IL-4和IL-10的mRNA表达显著上调，其中挥发油、百里香酚与香芹酚效果显著，与阳性对照白藜芦醇相当。ELISA结果进一步表明，上述成分可降低血清TNF-α和IL-1β含量，缓解炎症反应。香芹酚的急性处理亦表现出对LPS诱导炎症的抑制作用^［20］。

地椒作为中国西北地区代表性Thymus属植物，主要含百里香酚和香芹酚等酚类成分，以及β-反式石竹烯、4-异丙基甲苯等萜烯类物质。近年来研究^［21］发现，地椒中还含有地椒醌A与地椒苷A等新型醌类与酚苷类化合物，在抗炎与抗氧化方面具有重要作用，且在其他Thymus物种中鲜有报道，提示其化学成分具有独特性。本研究发现，不同地椒成分对胸腺和脾脏中炎症因子的调节具有组织和成分特异性：胸腺中地椒提取液与β-反式石竹烯显著抑制TNF-α、IL-2和IL-6；脾脏中4-异丙基甲苯与挥发油显著下调TNF-α。这表明地椒的抗炎效应为多成分协同作用。相比之下，同类研究如对Thymus atlanticus的研究^［22］多集中于整体提取物的抗炎与降血脂效应，未深入比较单一成分的组织特异性。

多项研究指出，Thymus属植物普遍具备抗炎与抗氧化潜力，但不同物种在成分与机制上存在差异。例如，Thymus vulgaris籽提取物可改善肥胖大鼠胰岛素敏感性并减轻肝氧化应激，其机制涉及调节脂联素/瘦素平衡，但其研究未涉及神经行为层面^［23］；Thymus serpyllum近期开展临床干预试验，其通过肠道微生物–免疫轴缓解功能性胃肠疾病，显示其在黏膜免疫与菌群调节方面的潜力^［24］。本研究显示，地椒提取物预处理可改善氧化应激状态，恢复SOD和GSH-Px活性，降低MDA和H₂O₂含量。其中香芹酚在提升抗氧化酶活性方面最为显著与刘霞等人^［25］研究结果一致。百里香酚与挥发油在减轻脂质过氧化方面作用突出，提示地椒活性成分通过协同增强内源性抗氧化防御缓解LPS诱导的氧化应激。

系统性炎症可经血脑屏障激活小胶质细胞，诱发神经炎症及相关行为异常。行为学实验显示，LPS模型组小鼠悬尾静止时间延长、热痛阈值降低，提示出现抑郁样行为与痛觉敏感。地椒提取物中，百里香酚与香芹酚可显著改善上述行为异常，并下调大脑皮质中p-NF-κB p65水平，其效果与白藜芦醇相当，提示百里香酚与香芹酚对神经性炎症的保护作用可能与抑制NF-κB通路有关。

综上所述，地椒通过多种活性物质协同发挥对系统性炎症的保护作用，其独特的成分组合（如百里香酚、香芹酚与挥发油）所体现的协同效应，可能是地椒区别于其他Thymus属植物的优势所在。本研究为地椒开发成为天然药物或功能性食品用于系统性炎症及其神经并发症的防治提供了理论依据与实验支持。

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基金资助

陕西省重点研发计划项目(2023-YBSF-543)

陕西省重点研发计划项目(2024NC-YBXM-172)

陕西省教育厅项目(22JC060)

延安大学科研项目(2023KXJ-001)

延安大学科研项目(2023JBZR-004)