皂翘消癖颗粒通过调控ER/RAS-RAF-ERK通路干预肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变的机制研究

Mechanism of Zaoqiao Xiaopi Granules in intervening breast cancer precancerous lesions with Ganyu Tanning pattern via regulating the ER/RAS-RAF-ERK pathway

摘要

目的 构建SD大鼠肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变模型，探讨皂翘消癖颗粒的作用及分子机制。 方法 40只SD雌性大鼠按体重随机分为空白对照组、模型Ⅰ组（DMBA+雌、孕激素诱导癌前病变）、模型Ⅱ组（模型I+6周应激诱导肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变模型）和皂翘消癖组。皂翘消癖组于造模后给药干预。HE染色观察乳腺病理学改变，免疫组化检测ERα、RAS、ERK2和p-ERK表达水平。 结果 血清5-HT含量比较：实验第9周末，模型Ⅱ组与皂翘消癖组（肝郁痰凝模型）显著高于模型Ⅰ组，空白组最低；实验第13周末，模型Ⅱ组血清5-HT含量最高，其余各组由高至低依次为模型Ⅰ组、皂翘消癖组、空白组。乳腺癌癌前病变发生率：皂翘消癖组显著低于模型Ⅰ组和模型Ⅱ组（P<0.05）；病变程度以模型Ⅱ组最重，模型Ⅰ组次之，皂翘消癖组最轻，且模型Ⅱ组出现1例原位癌。乳腺组织ERα、RAS、ERK2及p-ERK表达：模型Ⅰ组、模型Ⅱ组及皂翘消癖组均高于空白组（P<0.05），模型Ⅱ组高于模型Ⅰ组（P<0.05），皂翘消癖组低于模型Ⅰ组和模型Ⅱ组（P<0.05）。 结论 在DMBA诱导基础上联合雌、孕激素序贯刺激及慢性不可预见性应激，可成功地建立肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变大鼠模型。皂翘消癖颗粒能显著降低该大鼠乳腺癌癌前病变的发生率及非典型增生程度，并抑制其恶性进展；其机制与下调乳腺组织中ERα、RAS、ERK2及p-ERK的表达，从而抑制RAS-RAF-ERK信号通路的异常激活有关。

Abstract

Objective To establish a rat model of breast cancer precancerous lesions with the Ganyu Tanning （liver depression and phlegm coagulation） pattern and investigate the effects and underlying molecular mechanisms of Zaoqiao Xiaopi （ZQXP） Granules. Methods 40 female SD rats were randomly divided into four groups （n=10 per group）： control group， model I group （induced with DMBA and sequential estrogen/progesterone stimulation）， model II group （model I + 6 weeks of chronic unpredictable stress to establish the Ganyu Tanning pattern model） and the ZQXP group （Ganyu Tanning model treated with ZQXP Granules after modeling）. Mammary gland pathology was observed via HE staining. The expression levels of ERα， RAS， ERK2， and p-ERK in mammary tissues were detected by immunohistochemistry. Results Serum 5-HT levels： At week 9， levels in the model II and ZQXP groups （both Ganyu Tanning models） were significantly higher than in the model I group， with the control group being the lowest. At week 13， the model II group exhibited the highest serum 5-HT content， followed by the model I group， ZQXP group and control group. Incidence and severity of precancerous lesions： The incidence in the ZQXP group was significantly lower than in the model I and model II groups （P<0.05）. Lesion severity was greatest in model II， followed by Model I， and was mildest in the ZQXP group. Notably， one case of carcinoma in situ was observed in the model II group. 3. Expression of ERα， RAS， ERK2， and p-ERK： Expression was higher in the model I， model II， and ZQXP groups compared to the control group （P<0.05）. The model II group showed higher expression than model I （P<0.05）， while the ZQXP group showed lower expression than both model I and model II groups （P<0.05）. Conclusion A rat model of breast cancer precancerous lesions with the Ganyu Tanning pattern was successfully established using DMBA induction combined with sequential estrogen/progesterone stimulation and chronic unpredictable stress. ZQXP Granules significantly reduced the incidence and severity of atypical hyperplasia in this model and inhibited malignant progression. The mechanism may involve downregulating the expression of ERα， RAS， ERK2， and p-ERK in mammary tissue， thereby suppressing the aberrant activation of the RAS-RAF-ERK signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

皂翘消癖颗粒 / 肝郁痰凝型 / 乳腺癌癌前病变 / ER/RAS-RAF-ERK通路

Key words

Zaoqiao Xiaopi Granule / Liver depression and phlegm coagulation type / Precancerous lesions of breast cancer / ER/RAS-RAF-ERK pathway

近年来，乳腺癌发病率居全球女性恶性肿瘤第一位^［1］。中国女性乳腺癌发病率和死亡率均呈上升趋势^［2-3］；中位发病年龄为45~49岁，比西方国家早10~15年，且呈日益年轻化趋势^［4］。20世纪末，Page等提出了乳腺癌的多阶段发生模式假说，即“正常→增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌”的谱带式渐进性连续过程，并指出“增生→非典型增生”是一个漫长、必经且可逆的阶段，统称为乳腺增生症，被认为是癌前期病变^［5-6］。2019年出版的《WHO乳腺肿瘤组织学分类》（第5版）^［7］，亦将非典型增生归为乳腺癌癌前病变。中医理论将乳腺增生症归于“乳癖”范畴，其基本病因病机为“肝郁气滞、痰浊凝结”，其证型以肝郁气滞（36.33%）、肝郁痰凝（25.07%）为主，二者病因同源、病机递进^［8］。故本实验选用肝郁痰凝型大鼠乳腺癌癌前病变模型为研究对象。历代医家均曾明确指出，乳癖若长期不愈，可恶变发展为乳腺癌^［9］。因此，积极干预乳腺增生症（乳癖），有利于阻断癌前病变的进一步发展，降低女性乳腺癌发病率。近年来，中医药在乳腺癌及其癌前病变的防治方面，因其独特优势而日益受到广泛关注。

皂翘消癖颗粒的组成为连翘、皂角刺、莪术、浙贝母、延胡索、柴胡，以疏肝理气、化痰散结为核心治法，诸药相协，共奏清热解毒、活血化瘀、祛痰除湿、散结消癥、止痛之功效；组方切中病机，刚柔相济，体现了中医治病求本的原则。该方源于陕西中医药大学蔡国良教授与陕西省名中医马拴全教授的验方“止痛消结汤”，是二贤研习古籍，结合现代中药药理学成果与多年临床经验，总结而成的治疗乳腺增生症的有效方。该方不仅临床疗效显著^［10-11］，动物实验亦证实^［12］，其可有效地降低雌、孕激素诱导的乳腺增生模型大鼠血清卵泡雌激素水平，同时提升睾酮含量，显著减轻乳腺增生的病变程度。为推广临床应用，科研团队将其开发为颗粒制剂，即皂翘消癖颗粒。本实验旨在通过构建SD大鼠肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变模型，通过体内实验分析皂翘消癖颗粒的药效作用及相关分子机制，以期为该制剂的后续开发与临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

SPF雌性SD大鼠40只，5~6周龄，200±10 g，（西安交通大学实验动物中心提供，SCXK-2024-005）。本实验方案经陕西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（实验动物的伦理审批号：SUCMDL20240304001）。饲养于SPF级动物房，室温（24±2）℃，湿度（50±5）%，每筐5只，通风次数≥15次/h，自由进食饮水，适应性喂养1周后开展实验。

1.1.2 药品与试剂

二甲基苯并蒽（dimethylbenzanthracene，DMBA），12 mg/支，成都点纯科技有限公司（生产批号240602）；芝麻油：350 mL/瓶，莱阳鲁花花生油有限公司；苯甲酸雌二醇注射液：规格2 mL/支，杭州动物药品厂（生产批号240208）；黄体酮注射液：规格2 mL/支，杭州动物药品厂（生产批号240304）；皂翘消癖颗粒，规格9 g/包，陕西中医药大学科研攻关团队结合现代工艺提取加工。ERα、RAS、ERK、磷酸化ERK（p-ERK）兔抗大鼠一抗、伊红染液、羊抗兔二抗试剂盒、ELISA试剂盒、无水乙醇、二甲苯、PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、4%多聚甲醛等均由武汉塞维尔生物科技有限公司提供。

1.1.3 仪器

二氧化碳培养箱（德国BindCD-150），超净工作台（苏州净化），倒置显微镜（奥特BDS-200），普通石蜡切片机（A0-800型，上海医疗器械厂），全自动酶标仪（美国Bio-Tek ELX808IU））等。

1.2 方法

1.2.1 试剂制备

将DMBA用芝麻油制备为1 mg/mL的混悬液；根据人、鼠体重计量换算法计算，将皂翘消癖颗粒与生理盐水混合，配制成900 mg/mL的混悬液；置入4 ℃冰箱备用。

1.2.2 乳腺癌癌前病变动物模型的建立与分组

适应性喂养1周后，将40只SD雌性大鼠按体重随机分为4组（n=10），开始实验。空白组，实验第1天，给予一次性芝麻油液灌胃2 mL后正常饲养。模型Ⅰ组，实验第1天，将溶于芝麻油的DMBA混悬液（10 mg/mL）按照10 mL/kg灌胃一次，第2天起，连续25 d肌内注射苯甲酸雌二醇0.5 mg（kg/d），后改为连续5 d注射黄体酮4 mg（kg/d），建立大鼠乳腺癌癌前病变模型^［13-14］。模型Ⅱ组（肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变模型），在模型Ⅰ组方法的基础上，从第4周到第9周，连续给予大鼠慢性不可预见应激，包括禁食24 h、禁水24 h、昼夜颠倒、噪音刺激、纱布缠绕的止血钳夹尾刺激其中1只激怒打斗45 min。每日实验前，在线随机数生成器对5种应激因子进行随机排序，抽取1种应激因子，同一种应激连续施加不超过1次，28 d周期内确保每种应激因子施加4~5次，频次均衡，对照组仅同步抓取、转移。第64天，进行大鼠尾静脉采血，ELISA法检测血清5-HT含量变化，进行肝郁痰凝证模型验证^［13-14］。

1.2.3 给药方法

实验第10周起，连续4周，每周首日测量所有实验动物体重。皂翘消癖组，以皂翘消癖颗粒临床剂量（60 kg成人，9 g/次、2次/日）为参照，采用体表面积换算系数法（成人用du Bois公式、大鼠用Meeh-Rubner公式计算体表面积），结合大鼠初始体重（300±20）g及每周实际体重，计算每只大鼠每日总给药质量，再按900 mg/mL混悬液浓度换算为每日总给药体积，分2次灌胃。空白组、模型Ⅰ组、模型Ⅱ组：各组分别按照上述计算方法给予等体积生理盐水灌胃。若大鼠体重变化超过初始体重10%，重新计算体表面积及给药体积。

1.2.4 生物样品取材

末次给药后禁食24 h，称重，腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 mL/kg）麻醉，取大鼠体积明显增大的或有肿块的或胸部第2对乳头及其周围皮肤、皮下组织（乳腺），不小于1.0 cm×1.0 cm，4%多聚甲醛固定；打开腹腔，下腔静脉取血。

1.3 检测指标

1.3.1 ELISA法检测大鼠血清5-HT含量

对所有实验大鼠，于实验第9周末（第64天）行尾静脉取血检测，以验证肝郁痰凝证模型是否成功；于给药结束后（实验第13周末），处死大鼠后行下腔静脉取血检测，以评价皂翘消癖颗粒对肝郁痰凝证的治疗作用及相关调控效应^［15-16］。

1.3.2 乳腺组织形态学观察

将固定的乳腺组织进行石蜡切片、常规HE染色，光镜下观察各组乳腺组织形态变化。以WHO乳腺肿瘤分类标准为诊断标准^［17］，统计各组单纯性增生、非典型增生（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级）及原位癌的发生情况。

1.3.3 免疫组化染色法检测乳腺组织中ERα、RAS、ERK和p-ERK的表达

将乳腺组织的石蜡切片进行免疫组化学染色，一抗采用兔抗大鼠ERα、RAS、ERK和p-ERK抗体，二抗采用羊抗兔IgG。运用计算机图像分析仪进行半定量分析ERα、RAS、ERK和p-ERK的表达情况。

1.4 统计学方法

使用SPSS24.0统计分析实验过程中记录的实验数据，各组实验动物血清5-HT含量和乳腺组织ERα、RAS、ERK和p-ERK的表达情况数值以\overline{x}\pm s表示，数据服从正态分布采用单因素方差分析，再进行LSD多重比较，数据不服从正态分布采用非参数秩和检验；乳腺癌癌前病变发生例数为等级资料，采用非参数秩和检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的存活情况

造模期间，空白组大鼠各项情况均良好，无死亡现象；模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、皂翘消癖组分别于造模第2~3周内死亡2只实验动物，为DMBA毒性反应所致^［7］。

2.2 血清5-HT的含量

实验大鼠血清5-HT含量结果显示，实验9周末，模型Ⅰ组、模型Ⅱ组和皂翘消癖组均显著高于空白组（P<0.05），模型Ⅱ组和皂翘消癖组显著高于模型Ⅰ组（P<0.05），模型Ⅱ组和皂翘消癖组无明显差异（P>0.05）。实验13周末，模型Ⅰ组和模型Ⅱ组显著高于空白组（P<0.05），模型Ⅱ组显著高于模型Ⅰ组（P<0.05），皂翘消癖组和空白组无明显差异（P>0.05，表1）。

2.3 乳腺组织结构的变化

HE染色光学显微镜下观察结果显示，空白组乳腺导管被覆上皮为单层柱状，细胞排列整齐，大小形态一致，无明显增生，管腔内无分泌物；一个乳腺小叶有2~5个乳腺腺泡，腺泡上皮为单层立方或柱状，细胞大小形态一致，无明显增生，排列整齐，腺腔无扩张，腔内无明显分泌物；间质由脂肪组织和纤维结缔组织构成，无明显增生。模型Ⅰ组、模型Ⅱ组和皂翘消癖组均出现了不同比例和不同程度的增生性改变，与空白组比较有显著差异（P<0.05）；主要形态学变化表现为实质占比显著增多，小叶和导管扩张，小叶和腺泡数量显著增多，排列紊乱，腺腔及导管腔内可见多量均质淡粉染的分泌物和脱落的上皮细胞；部分实验动物乳腺导管上皮可见不同程度的非典型性增生及原位癌（乳腺癌癌前病变）。各组乳腺增生性病变和原位癌的发生率相比，皂翘消癖组的显著低于模型Ⅰ组和模型Ⅱ组（P<0.05），各组乳腺增生性病变和原位癌的病变程度相比，模型Ⅱ组最重、其次为模型Ⅰ组、皂翘消癖组最轻，且模型Ⅱ组有1例进展为原位癌（表2，图1）

2.4 免疫组化染色大鼠乳腺组织中ERα、RAS、ERK2和p-ERK的表达

空白组大鼠乳腺组织导管和小叶上皮细胞ERα、RAS、ERK2和p-ERK均呈弱阳性表达，模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、皂翘消癖组阳性细胞数明显增多，染色较深（图2）。IPP（Image-Pro Plus）定量分析结果显示（表3）：模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、皂翘消癖组高于空白组（P<0.05），模型Ⅱ组高于模型Ⅰ组（P<0.05），皂翘消癖组低于模型Ⅰ组和模型Ⅱ组（P<0.05）。

3 讨论

乳腺癌严重地威胁着全球女性身心健康，晚期患者5年生存率不足20%^［18］。研究显示，既往有乳腺增生病史者，10年后乳腺癌发病率是健康女性的1.4~1.5倍，尤其是导管非典型增生、小叶非典型增生者乳腺癌发生率高达正常人群的4~5倍，且恶变的概率与非典型增生的程度呈正相关^［19-20］。故给予乳腺增生症患者及时、有效的监控和干预，可有效地预防乳腺癌的发生^［21］。

大量研究^［22］表明，乳腺癌癌前病变发生和恶变的机制主要与内分泌失调、癌基因的表达、肿瘤血管的生成、细胞凋亡等有密切的关系。乳腺是性激素的主要靶器官，雌、孕激素水平的升高和比例失调在乳腺增生及癌变过程中起重要作用^［23］。雌激素可通过多种途径调节细胞增殖、血管生成，对良性疾病恶变，对肿瘤的发生、发展、转移和预后均有重要的作用^［24］。其中RAS-RAF-ERK信号通路备受关注，它是关于细胞增殖、分化和凋亡的一条关键性细胞内信号转导通路，受多种生长因子调控。研究^［25］发现，约30%的乳腺癌存在RAS基因突变，且其单点突变足以引发肿瘤的恶性转化。一般认为，发生激活型突变的RAS可以持续性激活RAF，RAF磷酸化激活MEK，MEK继而激活ERK，而ERK的底物包括多种与细胞生存状态密切相关的转录因子、核糖体蛋白、酶和骨架蛋白，使正常细胞获得癌细胞的生物学特征，发生癌变^［26］。研究^［22］表明，在乳腺非典型增生阶段，已经出现许多癌基因编码蛋白如RAS的表达；RAS基因是癌发生的启动基因，其产物RAS p21基因可能为乳腺癌的启动基因，RAS p21、c-Myc等多种癌基因得以活化，标志着乳腺癌癌前疾病有恶变倾向。因此，可通过研究药物对乳腺组织中ER及RAS-RAF-ERK信号转导通路相关蛋白RAS、ERK和p-ERK的表达及含量，以探讨其治疗乳腺癌癌前疾病、预防乳腺癌发生的可能分子机制。

皂翘消癖颗粒的组方为：连翘15 g，皂角刺12 g，莪术15 g，浙贝15 g，延胡索12 g，柴胡12 g组成。以皂角刺、连翘为君：皂角刺透脓溃坚，消积止痛；连翘有“疮家之圣药”之称，清热解毒、消肿散结^［27］；二者一温一寒，相须为用，针对乳腺增生症的“有形之邪”，发挥散结消肿核心作用 ^［28］。以莪术、浙贝母为臣：莪术行气破血、辛温行散、消积止痛，针对乳腺增生症的“血瘀”病机；浙贝母化痰消积，去痰湿，化坚积；与连翘相须为用，强化“化痰散结”之力，针对乳腺增生的“痰凝”病机。延胡索为佐，止痛辛温通利，活血行气，针对乳腺病变的“疼痛”症状，与莪术配伍增强活血止痛，与柴胡配伍兼顾“气滞”与“血瘀”所致的疼痛，实现“气血同调”。柴胡为使，疏肝理气、引药入肝，针对“肝郁气滞”的根本病机。该方遵循“君、臣、佐、使”配伍理论，针对肝郁气滞、痰浊凝结的核心病机，兼顾气滞血瘀、脾失健运、冲任失调等兼证及潜在病机，结合药物归经、性味功效及乳腺生理特点进行配伍。实现畅气机、化痰浊、散肿块、止疼痛的目的，同时兼顾调补肝脾、调和冲任，达到标本兼治、防止复发的效果。中医治疗乳腺增生症的用药规律及网络药理学研究发现，方中皂角刺、莪术、浙贝母、延胡索和柴胡均为医家治疗乳癖的高频次、核心用药^［29］。现代研究亦发现，方中诸药的有效成分可通过多靶点、多通路，如调节内分泌、抑制癌基因表达、抑制肿瘤血管生成、诱导异常细胞凋亡等，从分子层面实现抗乳腺增生、阻断恶性发展的作用。这为皂翘消癖颗粒抗乳腺癌癌前病变恶性发展及分子机制研究提供了可行性。

本实验结果显示，首先，在DMBA诱导基础上联合雌、孕激素序贯刺激及慢性不可预见性应激，可成功地构建肝郁痰凝型乳腺癌癌前病变模型大鼠。肝郁痰凝型大鼠乳腺癌癌前病变发生率高、非典型增生级别高，且有1例进展为原位癌，支持乳腺癌多阶段发病学说与中医肝郁痰凝的病机演变规律，为乳腺癌癌前疾病中医药研究提供了依据。其次，皂翘消癖颗粒不仅降低肝郁痰凝型大鼠血清中5-HT的含量、改善模型大鼠肝郁痰凝证，还可显著降低乳腺癌癌前病变的发生率和非典型增生的级别，并抑制其恶性进展；其作用机制可能与下调模型大鼠乳腺组织中ERα、RAS、ERK2和p-ERK的表达，进而抑制RAS-RAF-ERK信号转导通路的异常激活有关，为其临床应用提供了深层次的理论依据。

本研究存在以下局限性：一是模型证型缺乏量化标准，临床贴合度及恶性转化验证不足；二是药物研究未设置剂量与时间梯度，导致机制探索深度有限；三是缺乏细胞实验与临床数据的支持，转化应用价值尚不充分。下一步将优化模型构建与证型评价体系，深入探究药物的量效关系及作用机制，完善实验设计，开展体内外联合实验与临床观察，以推动研究成果的转化与应用。

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基金资助

国家级大学生创新创业训练计划项目(202410719032)