沉默或敲除HPV E6/E7基因防治宫颈癌的研究进展

摘要

宫颈癌是女性常见肿瘤，绝大部分的宫颈癌都由人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）引起。整合入细胞的HPV E6/E7基因高表达E6/E7癌蛋白是细胞发生癌变的主要原因，也是癌变状态维持的原因。若能沉默或敲除HPV E6/E7基因，即可对宫颈癌进行一级预防或预防性治疗。本文综述siRNA技术和基因编辑技术沉默或敲除HPV E6/E7基因用于防治宫颈癌的研究进展。

关键词

宫颈癌 / 人乳头状瘤病毒 / E6/E7基因 / siRNA技术 / 基因编辑技术 / CRISPR

宫颈癌（cervical cancer）是女性常见肿瘤^［1］。全球范围内，宫颈癌发病率和死亡率均在女性所有恶性肿瘤中占第4位，在20~39岁女性中，宫颈癌占癌症死因的第2位^［2］；在低中收入国家，其发病率和死亡率分别占女性所有恶性肿瘤的第2位和第3位^［3］。按照世界卫生组织GLOBOCAN项目预测，2030年全球新出现的宫颈癌病例会增加到近85万^［4］。根据2022年国家癌症中心发布的最新数据，中国妇科肿瘤的发病率继续呈现上升的趋势，其中宫颈癌年发病例数为119 300例，年死亡病例数为37 200例。此外，宫颈癌在年轻女性中的发病率近年来有明显的上升趋势^［5］。

几乎所有的宫颈癌都由人乳头状瘤病毒（human papillomavirus， HPV）引起^［6］。HPV是乳头状瘤病毒科感染人的一种病毒，无包膜，核衣壳呈二十面体对称，病毒基因组为环状双链DNA，约8 000 bp长，编码6种早期蛋白和2种晚期蛋白，其中E6和E7为癌蛋白^［7］。已经发现HPV有200多个型别，其中有13~15个型别可引起癌症，属高危型别（主要为16、18型）^［8］。HPV只能在皮肤和黏膜细胞中增殖，病毒基因组可以整合入细胞基因组而产生过量的E6、E7蛋白^［9］。高危型HPV通过E6和E7两种癌蛋白引起恶性肿瘤，HPV可引起多种肿瘤，其中最常见的是宫颈癌^［10］。

从理论上讲，若能敲除E6和/或E7基因的功能或沉默E6和/或E7基因的表达，或者阻断E6和E7蛋白的作用，即可防止被HPV感染的细胞发生癌变，并可使已经癌变的细胞不能维持癌变状态而凋亡，从而实现对宫颈癌的一级预防或预防性治疗作用。敲除E6和E7基因可用基因编辑技术，沉默E6和E7基因可用siRNA技术亦可用基因编辑技术，本文综述siRNA技术和基因编辑技术沉默或敲除HPV E6/E7基因用于防治宫颈癌的研究进展。

1 SiRNA技术沉默E6和E7基因

1.1 siRNA基因沉默技术的早期研究

RNA干扰（RNA interference， RNAi）是细胞内的小RNA分子在转录后水平抑制基因表达或沉默基因的一种现象，其机制主要是降解mRNA分子或抑制mRNA分子的翻译^［11］。Fire和Mello两人因研究RNAi的贡献而获2006年度的诺贝尔生理学或医学奖^［12］。RNAi在体内具有调控基因表达、影响个体发育和保护细胞免受病毒感染等多种功能。可以介导RNAi的小分子RNA有两种类型：小干扰RNA（siRNA， small interfering RNA）和微小RNA（miRNA， microRNA）^［13］。

siRNA是一类双链RNA分子，一般是20~25个碱基对长，每条链的3′端比另一条链长出两个核苷酸；siRNA能够与特异性的mRNA分子的互补序列结合而抑制其表达（通过降解mRNA或抑制蛋白翻译）^［14］。Tuschl等于2001年发现人工合成的siRNA在进入细胞内后能够诱导RNAi，从而引来了世界范围内siRNA技术的应用热潮^［15］。siRNA在研究中的一种主要应用是抑制特定基因的表达，在生物医学研究特别是肿瘤治疗研究或药物开发研究中有广泛用途。

siRNA技术属于转录后水平的基因沉默技术，Jiang等^［16］首先于2002年用SiRNA技术沉默整合入宫颈癌细胞中的E6/E7基因，发现E6 siRNA能够升高细胞内p53含量、抑制细胞增殖，E7 siRNA能够促进细胞凋亡。接下来有人用RNAi进行了小鼠体内实验，发现转染了E6 siRNA的HPV阳性宫颈癌细胞在小鼠体内成瘤明显减缓^［17］。此后数年，有不少实验室进行了类似的体外和体内实验并得到了类似的结果^［18］。这些研究虽然没有达到理想的效果，但确实说明干预E6/E7基因可以作为防止细胞癌变的一种措施。

1.2 siRNA递送系统的改进及临床前研究

siRNA分子的递送是决定该技术能否成功地临床转化的一个关键。传统的裸siRNA分子存在血清稳定性差、细胞摄取效率低等问题，近年来发展起来的新型纳米颗粒递送系统显著解决了这些局限，提高了siRNA基因沉默的效率^［19］。其一是脂质纳米颗粒，能通过可电离脂质实现pH依赖性的内体逃逸，比如用脂质纳米颗粒系统将E7 siRNA递送至宫颈癌模型，可使肿瘤体积与对照组相比减少68%，且显著降低肝毒性；其二是聚合物纳米颗粒如聚乙烯亚胺衍生物，比如靶向性聚乙烯亚胺-siRNA复合物能通过叶酸受体介导的内吞作用，在HeLa细胞中实现90%以上的E6基因沉默效率；其三是外泌体递送系统，可展现天然生物相容性的优势，一项研究^［20］显示骨髓间充质干细胞来源的外泌体装载E6/E7 siRNA后，可穿透宫颈癌组织深层并持续释放，小鼠移植瘤生长抑制率达75%。

基于病毒载体的siRNA递送在宫颈癌模型中近年来也取得了重要进展^［21］。其一是腺相关病毒（AAV）因其低免疫原性被广泛采用，用AAV9-shE7通过静脉注射靶向宫颈癌组织，能持续抑制E7表达4个星期以上，并且无肝肾功能损伤；其二是慢病毒载体可实现稳定基因沉默，最近的研究将E6/E7特异性shRNA与CRISPR-dCas9系统联用，在类器官模型中实现了长达60 d的持续抑癌效果；其三是在溶瘤病毒协同递送方面，用单纯疱疹病毒搭载E6 siRNA能显著增强病毒复制特异性，在人源性组织异种移植（patient-derived xenograft， PDX）模型中观察到完全缓解率可达40%。

在2020—2023年期间，有多项研究^［22］在临床前研究方面取得了标志性成果：其一是PhaseBio公司开发的温度敏感型PLGA微球缓释E6/E7 siRNA，单次注射可维持有效浓度21 d，能显著延长荷瘤小鼠生存期；其二是南京大学团队设计的“双靶向”siRNA递送系统（同时靶向E7 mRNA和PD-L1）展现出协同效应，使CD8⁺ T细胞浸润增加3倍，35%的小鼠原位肿瘤完全清除；其三为目前进展最快的候选药物siG12D-E6，已进入新药临床试验（investigational new drug， IND）申报阶段，该药物采用改良脂质纳米颗粒配方，在灵长类动物实验中显示出90%以上的HPV16⁺肿瘤抑制率。

1.3 siRNA药物的临床应用

到目前为止，已有几种基于RNAi的药物进入了临床应用。2018年8月，美国FDA首次批准通过了以RNAi机理治疗疾病的药物上市^［23］，该siRNA药物的名称为Patisiran，能够沉默一种导致遗传性甲状旁腺素淀粉样变性的罕见基因，用于治疗成人遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性多发性神经病。这种疾病会导致变性的甲状腺素蛋白在体内积累，以周围神经损害为主，有时会损害心脏功能。2019年11月，FDA又批准了第二个作治疗用途的siRNA药物上市^［24］。该siRNA药物叫作Givosiran，用于治疗罕见病急性肝卟啉症，该病是由于肝内卟啉代谢紊乱导致间歇发作性腹痛、呕吐、便秘及神经精神症状等一系列症候群的肝病，临床表现复杂多样，长期反复发作还会发展为原发性肝癌、高血压和肾衰竭等，甚至危及生命。2020年，全球第三个基于RNAi的药物获批上市，药物名称为Oxlumo。和前两个获批的siRNA药物类似，Oxlumo亦出自基因药物公司Alnylam Pharmaceuticals、亦用于一种罕见病的治疗。Oxlumo用于治疗原发性高草酸尿症。原发性高草酸尿症是一种罕见的严重常染色体隐性遗传病，病理学机制为肝脏过氧化丙氨酸-乙醛酸盐氨基转移酶缺乏，导致草酸产生过多，临床表现为高草酸尿症和反复尿路结石。在Oxlumo获批之前，针对原发性高草酸尿症的药物治疗选择只有一种方法——“过度水合”，即使用过量的液体稀释草酸盐。而唯一解决该疾病根源的治疗方法是肝移植。RNAi药物Oxlumo的获批为该疾病提供了一种新的药物治疗途径。目前尚无沉默E6或E7基因的siRNA药物被FDA或其他的药品监督管理局批准上市。

2 基因编辑技术敲除和沉默E6和E7基因

2.1 经典的CRISPR技术及其衍生技术

2012年，CRISPR-Cas9基因编辑技术问世，带来了生物医学技术上的一次新的革命，该技术除了可改正基因错误外，主要用于敲除基因功能^［25］。CRISPR-Cas9基因编辑技术利用含有crRNA片段的gRNA（guide RNA）将Cas9蛋白引导于目标DNA，使用Cas蛋白的脱氧核糖核酸酶活性在目标DNA上造成双链断裂（double strand break， DSB），激活细胞的DSB修复功能，从而实现对目标基因的编辑^［25］。

2013年，在CRISPR-Cas9基因编辑的基础上衍生出了CRISPR干扰（CRISPR interference， CRISPRi）技术，CRISPRi属于转录水平的基因沉默技术^［26］。CRISPRi用的也是CRISPR-Cas9系统，但是利用了没有酶活性的Cas9蛋白（dCas9），所以当gRNA将dCas9引导到特定的DNA序列时，其结果不是切割DNA，而是阻遏目标基因转录，即沉默目标基因^［26］。

2015年，研究人员利用2类CRISPR-Cas系统Ⅴ型的Cas12a蛋白，创立了CRISPR-Cas12a基因编辑，被认为是第二代基于CRISPR的基因编辑技术^［27］。CRISPR-Cas12a基因编辑技术问世后在国际上得到了广泛的应用。与CRISPR-Cas9基因编辑相比，CRISPR-Cas12a（亦称CRISPR-Cpf1）基因编辑具有以下优点：① Cas9需要2个RNA分子（crRNA和tracrRNA），而Cas12a只需一个RNA分子（crRNA），所以操作更简单；② Cas12a基因比Cas9基因小，易被导入细胞故编辑成功率高；③ Cas12a的PAM序列距离crRNA识别位点远，使编辑位置的选择有更多的可选性；④ Cas12a切割产生黏端，便于新的DNA序列插入（Cas9切割产生平端）^［27］。

2017年，利用2类Ⅵ型CRISPR-Cas系统的Cas13a具有RNA酶活性、能切割RNA的特性，创立了CRISPR-Cas13技术，可从转录后水平沉默基因^［28］。该技术仍然利用gRNA将Cas13a蛋白导向于目标，但利用的是后者的RNA酶活性切割RNA或者用没有酶活性的Cas13a蛋白干扰mRNA的翻译，所以可以用于编辑RNA或抑制mRNA翻译；如将gRNA设计为靶向mRNA的，即可从转录后水平沉默基因。CRISPR-Cas13技术与SiRNA技术都可以从转录后水平沉默基因，二者沉默基因的效率基本接近，但是CRISPR-Cas13技术比SiRNA技术具有特异性高等优点^［28］。

2.2 新一代基因编辑技术——碱基编辑与先导编辑

传统的CRISPR-Cas9技术依赖DNA双链断裂实现基因编辑，可能引发染色体结构异常或大片段缺失。为解决这一问题，碱基编辑和先导编辑技术应运而生。

碱基编辑技术（base editing， BE）通过融合脱氨酶与nCas9（切口酶）或dCas9（无切割活性Cas9），在不引起双链断裂的情况下实现单碱基转换。① C→T或A→G转换：腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE）已成功应用于HPV E6/E7基因的精准修正。2024年，用ABE8e靶向HPV16 E7基因的致癌位点（如T751C突变），在SiHa细胞中实现了A→G修正，显著降低E7蛋白表达并恢复pRb功能，且未检测到脱靶效应。② 局部表观遗传调控：dCas9-脱氨酶融合蛋白还可用于靶向甲基化或乙酰化修饰，沉默E6/E7转录。2025年的一项研究^［29］，通过靶向HPV18 E6启动子的CpG岛甲基化，实现了长期基因沉默。

先导编辑技术（prime editing， PE）通过逆转录酶与nCas9的融合，结合pegRNA（prime editing guide RNA），可实现任意碱基的插入、删除或替换。其优势在于：① 多碱基编辑能力：2025年，有人利用先导编辑系统PE6在HeLa细胞中精准修复HPV18 E7基因的连续突变位点（如Δ647-650缺失），恢复了p53通路功能，且编辑效率达65%。② 低脱靶风险：与CRISPR-Cas9相比，先导编辑无需供体DNA模板，且pegRNA的设计灵活性更高。近期研究^［30］显示，靶向HPV16 E6的PE3系统在宫颈癌类器官模型中实现了90%的突变修正率，且全基因组测序未检测到脱靶事件。

针对传统CRISPR基因编辑技术可能造成DNA双链断裂导致大片段碱基缺失或染色体失序、脱靶、定向递送和免疫原性等挑战，哈佛大学华裔科学家刘如谦团队开发的碱基编辑和先导编辑系统，通过靶向ANGPTL3基因的腺嘌呤碱基、优化脂质纳米颗粒配方、高效递送腺嘌呤碱基编辑器mRNA和特异性导向RNA，在小鼠模型中实现了高效安全的ANGPTL3基因敲除，可对单个碱基进行编辑而不会造成DNA双链断裂^［31］。

2.3 基因编辑技术在HPV相关宫颈癌中的应用研究

以上各项基因编辑技术，为肿瘤等疾病的基因治疗提供了丰富的机遇。基于CRISPR的基因干预技术特别适合于宫颈癌的治疗，因为宫颈癌是由整合入细胞基因组的病毒基因引起的，而对病毒基因的干预不会影响到细胞功能。

Hu等^［32］首次用CRISPR/Cas技术靶向HPV阳性细胞中HPV16-E7 DNA，发现sgRNA引导的CRISPR/Cas系统能够阻断SiHa和Caski细胞中HPV16-E7 DNA的作用、下调E7蛋白表达、上调pRb蛋白表达，从而诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。Zhen等^［33］在HPV阳性SiHa细胞中用CRISPR/Cas9靶向HPV 16 E6和E7基因的启动子及其转录物，结果发现，靶向E6/E7启动子和转录物导致p53蛋白和p21蛋白的积聚并显著性地抑制宫颈癌细胞的体外增殖。将这些细胞经皮下接种裸鼠建立移植瘤模型后发现，成瘤作用被显著性地抑制。Kennedy等^［34］用针对E6/E7的Cas9 RNA引导的内切酶和sgRNA能够切割HPV基因组并将插入和缺失变异引入E6或E7基因，并进一步引起p53和Rb的表达上调和细胞周期阻滞，最终导致宫颈癌细胞凋亡。Zhen等^［35］发现，针对HPV E6/E7基因的CRISPR/Cas9系统能够增强顺铂对宫颈癌的化疗作用。Wang等^［36］用CRISPR/Cas9系统靶向HPV18的E6/E7基因，有效地阻断了E6/E7基因在HeLa细胞中的表达。Zhu等^［37］用HPV16 E7靶向性CRISPR/shRNA和纳米颗粒作为基础治疗药物，治疗HPV感染及其引起的癌变，结果发现，CRISPR/shRNA纳米颗粒能够抑制HPV16 E7基因表达、抑制宫颈癌细胞增殖、抑制裸鼠体内成瘤，并能逆转HPV16转基因鼠的上皮细胞表型恶变。Yoshiba等^［38］使用基因工程建立了持续表达Cas9的宫颈癌细胞系，使用AAV载体携带sgRNA靶向E6基因，结果发现，被靶向的E6基因序列频繁出现多种突变，E6蛋白表达下调，p53蛋白表达上调，宫颈癌细胞凋亡增强。Jubair等^［39］建立了持续表达E6、E7蛋白的宫颈癌动物模型，用脂质体导入CRISPR/Cas9系统进行治疗，得到了肿瘤完全消失、动物全部生存的效果。Zhen等^［40］将CRISPR-Cas9介导的针对HPV16 E6/E7的靶向治疗与免疫监测点PD-1通路阻断结合应用，得到了对宫颈癌进行治疗的协同性的增强效果。Gao等^［41］用超支化聚（β-氨基酯）基复合纳米颗粒递送靶向HPV16 E7基因的CRISPR/Cas9系统治疗HPV感染，在体外达到对宫颈癌细胞增殖的强抑制作用，在体内达到对裸鼠移植瘤生长的强抑制作用。Chen等^［42］研究了应用CRISPR/Cas13a系统在体外和在体内介导E6/E7 mRNA裂解抑制宫颈癌细胞增殖，得到了良好的效果。Inturi等^［43］探索了抑制HPV癌基因的新的途径，发现用CRISPR/Cas9系统使HPV E6/E7癌基因失活，可以使HeLa细胞老化。Xiong等^［44］发现，用多（β-氨基酯）纳米颗粒导入靶向E7基因的CRISPR/Cas9系统，在体内外具有较好的安全性和较低的毒性，可以显著性地抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的增殖，显著性地逆转宫颈癌动物模型上皮细胞的恶变。为了增强基因敲除的效果，Tian等^［45］建立了基因敲除链反应，该方法可以持续地诱导基因突变破坏HPV18 E6和E7基因的功能；发现通过靶向HPV18 E6/E7癌基因，能够显著地上调P53/RB蛋白表达并抑制HeLa细胞增殖。Fan等^［46］利用CRISPR- Cas9系统与34nt非同源双链寡核苷酸共转染，发现可以改进基因编辑效能并同时能检测脱靶效应。有迹象表明，当p53蛋白恢复正常水平时，可使多种肿瘤发生消退产生较好的效果，Idres等^［47］CRISPRa使p53基因启动子高表达以克服HPV介导的p53基因沉默，发现可以抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖并杀灭癌细胞。Hu等^［48］使用重组溶瘤单纯疱疹病毒1型与CRISPR- Cas9基因编辑系统结合，打断整合入宫颈癌细胞中的HPV16基因，发现能够有效地敲低HPV16癌基因，从而抑制细胞增殖且诱导细胞凋亡。

2.4 新一代基因编辑技术临床前研究进展

精准碱基编辑：在E6/E7关键位点编辑精准修正致癌突变方面，2024年，有研究人员^［49］利用ABE8e（高活性腺嘌呤碱基编辑器）靶向HPV16 E7基因的T751C突变（该突变导致E7蛋白稳定性增强），在SiHa细胞中实现A→G修正，使E7蛋白表达降低80%，并恢复pRb抑癌功能，且全基因组测序显示脱靶率低于0.1%。在表观遗传调控方面，2025年，Chen等^［50］通过dCas9-TET1融合蛋白靶向HPV18 E6启动子的CpG岛，诱导去甲基化，实现长期转录沉默，并在小鼠模型中抑制肿瘤生长。

递送系统优化：在AAV递送方面，2023年，Wei等^［51］使用AAV9递送CBE4max至宫颈癌类器官，成功修复HPV16 E6的C→T突变（T413C），恢复p53表达。在纳米颗粒递送方面，2024年，Li等^［52］开发了脂质纳米颗粒包裹的ABE8e-mRNA系统，通过静脉注射靶向HPV16 E6的T350G突变，在小鼠移植瘤模型中使肿瘤体积缩小70%，且肝脏毒性显著低于传统Cas9系统。

先导编辑多碱基修复与插入缺失修正：在HPV E7框内缺失修复方面，2025年，Liu团队^［53］利用PE6系统在HeLa细胞中修复HPV18 E7基因的Δ647-650缺失（该缺失常见于高级别病变），编辑效率达65%，并显著抑制细胞增殖。在启动子区调控方面，2025年，Wang等^［54］设计pegRNA靶向HPV16 E6启动子的-32位点，插入抑制性元件（如KRAB结构域），使E6表达降低90%。

联合和体内治疗及安全性：2025年，Zhou等^［55］将PE5系统与PD-1抑制剂联用，在HPV16阳性小鼠模型中不仅修复了E7突变，还激活了抗肿瘤免疫应答，显著延长生存期。Zhou等^［56］于2025年通过电穿孔将PE5 mRNA和pegRNA进行局部递送导入小鼠宫颈肿瘤，修复HPV16 E7的G638A突变，联合PD-1抑制剂后，5/8小鼠达到完全缓解。2024年，Kim等^［57］在小鼠模型中证实，先导编辑对生殖细胞和干细胞无显著脱靶效应。

3 结语

宫颈癌发病率和死亡率均比较高，发病率在近年还有上升趋势，对女性人群健康是很大的威胁，目前对发现有异常并明确需要进行干预或处理的个体，主要使用的是有创性的措施即手术。从分子水平靶向HPV癌基因对宫颈癌患者进行预防性或早期治疗，属无创性的措施，若能转化为临床应用将会有非常重大的现实意义。

高危型HPV感染细胞后，其基因组整合入宿主细胞基因组，整合入的E6/E7基因持续高表达，既是癌变发生的原因也是癌变状态维持的原因^［58］。二十一世纪以来出现的SiRNA技术和CRISPR基因编辑技术，为多种肿瘤的基因治疗提供了有效的手段。基于RNAi和CRISPR的基因干预技术特别适合于宫颈癌的预防和治疗，因为宫颈癌是由整合入细胞基因组的病毒基因及其产物引起的，对病毒基因及其产物的干预，不会对细胞的正常功能造成影响。

无论用siRNA技术沉默E6和E7基因还是用基因编辑技术敲除/沉默E6和E7基因，在得到临床应用之前，首先需要解决的一个问题是用能够在体内应用的方式把siRNA分子或CRISPR系统导入到细胞中去。向特定细胞靶向性地导入药物或其他治疗分子，是目前医学和药学研究所面临的一大挑战，使用功能化的纳米颗粒主动并特异性地向目标细胞导入药物，具有多种优点和很大的临床应用潜能。可用于功能化纳米颗粒的配体分子有多种，包括核酸适配体、抗体、肽类、糖类和叶酸等，其中核酸适配体因其易于与纳米颗粒偶联、几乎无免疫原性和体积小等特点，是较好的一种选择^［59-63］。

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