VIM与TMEFF2甲基化：膀胱癌无创液体活检的潜力标志物

摘要

膀胱尿路上皮癌（urothelial carcinoma of the bladder，UCB）是全球第十大常见恶性肿瘤，其临床管理面临高复发率与显著分子异质性的核心挑战。尽管膀胱镜检查被视为诊断与监测的“金标准”，但其侵入性、高昂成本及患者不适感严重制约了大规模筛查和长期随访的依从性。与此同时，传统的尿液脱落细胞学检查虽具备无创优势，却因对低级别或高分化肿瘤的敏感性不足而存在明显局限。DNA甲基化作为一种稳定的表观遗传修饰，在肿瘤发生的早期阶段即可出现异常，并能于尿液等体液中被稳定检测，因此成为膀胱癌无创检测领域极具前景的研究方向。本文系统综述波形蛋白（Vimentin，VIM）基因与含EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白2（Transmembrane Protein with EGF-like and Two Follistatin-like Domains 2，TMEFF2）基因甲基化在膀胱癌发生发展、分期分型及患者预后评估中作用的研究进展，并深入探讨二者联合检测策略在提升早期/低级别肿瘤检出效能及优化术后监测方面的潜在优势。

关键词

膀胱癌 / DNA甲基化 / VIM / TMEFF2 / 无创诊断

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一^［1］。据GLOBOCAN 2022年数据^［2］显示，全球新发病例约61.43万例，死亡约22.1万例；同期，我国新发病例约9.3万例，死亡约3.4万例。根据是否侵犯肌层，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer， NMIBC）与肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer， MIBC）。NMIBC患者总体预后相对较好，但其复发率高达50%~70%，且部分病例可进展为MIBC，从而显著增加治疗难度并提高死亡风险^［1-2］。

目前，膀胱镜检查结合尿液脱落细胞学仍是临床诊断与随访的主要手段。然而，膀胱镜作为侵入性操作，不仅费用较高，还可引发并发症（如出血、感染），而且患者的不适感常导致随访依从性下降。另一方面，尿液脱落细胞学虽为无创检查，但其对低级别与高分化病变的敏感性有限，假阴性率较高^［3］。因此，探索兼具高灵敏度、高特异性且可重复应用的无创液体活检技术已成为该领域的研究热点^［3-4］。

DNA甲基化作为表观遗传调控的核心机制之一，其异常模式可在肿瘤发生的多阶段进程中早于基因突变出现，因而被视为癌症早期筛查的理想“信号放大器”^［4］。大量研究^［5］证实，特定抑癌基因启动子区的高甲基化不仅可导致基因沉默，还能以高丰度释放入外周血或体液，形成可检测的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）甲基化指纹。基于此原理开发的液体活检Panel，有望实现真正意义上的“超前诊断”。综上，DNA甲基化标志物因其出现早、特异性高、可无创获取等优势，正逐步成为连接基础表观遗传学与临床早筛实践的桥梁。

1 VIM基因甲基化与膀胱癌

Vimentin（VIM）是一种典型的中间丝蛋白，属于细胞骨架的关键组成部分，广泛存在于间充质细胞中，并在细胞形态维持、信号转导、增殖、迁移及侵袭过程中发挥重要作用。在正常膀胱上皮中，VIM的表达水平较低，主要局限于间质细胞和基底层少量上皮细胞，这一分布模式有助于维持上皮组织结构的稳定性^［6］。然而，膀胱癌组织中VIM常呈现异常高表达，尤其是在高级别或肌层浸润性膀胱癌中更为显著，这提示VIM在肿瘤发生和进展中可能扮演关键角色^［7］。近年来的分子机制研究^［8］显示，VIM基因表达的异常调控与其启动子区域的DNA甲基化状态密切相关。DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰，通常发生在基因启动子的CpG岛上，通过阻碍转录因子结合或招募甲基结合蛋白复合物，从而抑制基因转录^［5］。在膀胱癌中，VIM启动子区域普遍呈现低甲基化或去甲基化状态，这种表观遗传改变能够显著提高VIM的转录活性，导致蛋白水平升高，从而为肿瘤细胞提供获得间质表型和侵袭能力的分子基础^［9］。

VIM过表达在膀胱癌中主要通过促进上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）发挥致癌作用^［10-12］。EMT是肿瘤细胞从上皮表型向间质表型转变的关键生物学过程，其主要特征包括上皮标志物如E-cadherin表达下降，间质标志物如VIM和N-cadherin表达上升，以及细胞骨架重排、黏附分子重构等^［12］。VIM不仅作为EMT的经典间质标志物参与这一过程，同时也通过调控肌动蛋白纤维网络和黏附分子定位，直接增强肿瘤细胞的迁移、侵袭和远处转移能力^［13］。体外细胞实验进一步支持了这一机制：膀胱癌细胞在VIM高表达或启动子去甲基化条件下，其迁移和侵袭能力显著增强；相反，通过RNA干扰或CRISPR-Cas9敲低VIM表达能够部分逆转EMT表型，使E-cadherin水平恢复，迁移和侵袭能力下降^［12-14］。这些数据充分表明，VIM基因甲基化状态不仅是肿瘤分子表型的决定因素，也是调控膀胱癌侵袭能力的重要机制。

临床组织学研究^［15-17］为VIM在膀胱癌中的作用及作为标志物的价值提供了坚实证据。多项组织学分析显示，膀胱癌患者肿瘤组织中VIM启动子低甲基化与VIM蛋白高表达高度相关，而这种高表达在高级别肿瘤、肌层浸润型膀胱癌及淋巴结转移患者中尤为显著。如免疫组织化学技术和甲基化特异性PCR（MSP）分析显示，VIM低甲基化患者的肿瘤组织中VIM蛋白染色强度明显增强，且与肿瘤分期、浸润深度及转移情况呈正相关^［16］。这一观察在多中心队列研究中得到重复验证，提示VIM甲基化状态不仅反映分子水平的表观遗传改变，也能对应肿瘤的侵袭性和预后风险。

进一步的临床研究显示，VIM的表观遗传状态可通过非侵入性方式在尿液中检测，为早期诊断和复发监测提供可靠手段。Costa等^［3］的前瞻性研究中，膀胱癌患者尿液中VIM甲基化DNA的检出率在80%~85%之间，而对照健康人群则低于5%，显示出极高的特异性和敏感性。在多中心验证中，结合其他甲基化标记如TWIST1和NID2，可将整体检测灵敏度提高至90%以上，同时保持高特异性，进一步凸显VIM作为膀胱癌早期诊断和复发监测分子标志物的可靠性^［15］。此外，研究^［18］表明，尿液VIM甲基化水平与肿瘤分级、肌层浸润和复发风险呈显著正相关，这不仅验证了其与肿瘤侵袭行为的关联，也说明VIM的表观遗传状态能够动态反映肿瘤的临床特性。

体外实验也进一步支持这些临床观察。在膀胱癌细胞系中，VIM启动子去甲基化或DNA甲基转移酶抑制剂处理后，VIM表达显著上调，细胞表现出增强的迁移和侵袭能力。相反，通过RNA干扰或CRISPR-Cas9技术降低VIM表达，可部分逆转EMT表型，使E-cadherin水平恢复，迁移和侵袭能力明显下降^［19］。这一实验结果从功能层面验证了VIM在膀胱癌侵袭和转移中的关键作用，也强化了其作为分子标志物的科学合理性。

2 TMEFF2基因甲基化与膀胱癌

TMEFF2（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 2）是一种具有EGF样结构域和两个Follistatin样结构域的跨膜蛋白，主要在神经系统及泌尿系统中表达^［20］。TMEFF2在多种实体瘤中被认为具有抑癌作用，其功能包括抑制细胞增殖、迁移和侵袭，同时调控凋亡和信号通路活性^［21］。在膀胱癌中，TMEFF2表达的异常与其启动子区域的DNA甲基化密切相关^［22］。正常膀胱上皮组织中，TMEFF2高表达，其启动子区域CpG岛通常处于低甲基化状态，维持基因活性^［6］。然而，在膀胱癌组织中，TMEFF2启动子常表现为高甲基化状态，这种表观遗传改变导致基因转录显著抑制，蛋白表达下降，从而削弱其抑癌功能，为肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭提供分子基础^［20-22］。

从分子机制层面分析，TMEFF2被认为是一种潜在的抑癌基因。其编码产物包含EGF样结构域蛋白和follistatin样结构域蛋白^［23］。在膀胱癌中，TMEFF2已被证实是一种功能性抑癌基因，可通过抑制RAS-ERK及PI3K-AKT等促增殖信号通路来抑制肿瘤细胞的生长与迁移^［24］。当TMEFF2启动子CpG岛发生高甲基化时，会导致该基因的转录沉默，使其抑癌功能丧失，从而为肿瘤细胞的不受控生长创造有利条件^［23-24］。这一机制得到了功能实验的支持：去甲基化药物（如5-aza-2'-deoxycytidine）处理膀胱癌细胞后，可观察到TMEFF2 mRNA表达和蛋白表达水平的恢复，并伴随细胞凋亡率的显著上升^［25］。这一功能验证明确表明，TMEFF2的启动子高甲基化直接影响其基因活性，并在肿瘤进展中发挥关键作用。此外，TMEFF2在肿瘤细胞信号通路中的调控作用，例如对PI3K/AKT和MAPK通路的抑制，也进一步解释了其甲基化下调与膀胱癌恶性表型之间的联系^［26］。

临床组织学和分子检测研究为TMEFF2作为膀胱癌生物标志物的价值提供了多层次的证据。在膀胱癌患者的肿瘤组织中，TMEFF2启动子高甲基化与基因低表达显著相关，多项免疫组织化学技术和甲基化特异性PCR（MSP）研究^{［12，27-28］}均表明，TMEFF2蛋白表达下降与肿瘤高级别、肌层浸润以及淋巴结转移显著相关。例如，一项涵盖150例膀胱癌患者的队列研究^［29］显示，TMEFF2启动子甲基化水平在肌层浸润型肿瘤中明显高于非肌层浸润型肿瘤（P<0.01），同时低表达患者的肿瘤复发率显著升高。此外，多中心队列研究^［30］显示，通过定量甲基化PCR（qMSP）检测TMEFF2启动子甲基化，可有效区分膀胱癌患者与健康对照，其敏感性达到78%~85%，特异性可达88%~92%，明显优于传统尿液细胞学检测。

进一步的研究表明，TMEFF2甲基化水平不仅与组织病理特征相关，还与临床预后密切相关。在一项随访5年的膀胱癌患者研究中，高甲基化伴低表达组患者的无复发生存期显著低于低甲基化组（HR=2.1，95% CI 1.4~3.1，P<0.01），提示其甲基化状态可以作为复发风险的预测指标（TCGA数据库）。其他研究还发现，TMEFF2甲基化可通过非侵入性方式在尿液中检测，其检测结果与肿瘤组织甲基化水平高度一致（一致性达到85%以上），为早期诊断和动态监测提供了可行策略（TCGA数据库）。这类尿液检测能够在症状出现前发现肿瘤发生，尤其适用于高危人群如长期吸烟者、职业暴露人群及慢性膀胱炎患者。

此外，TMEFF2甲基化的联合检测策略也进一步增强了其临床应用价值^［31］。例如，将TMEFF2与其他甲基化标志物（如VIM、NID2、TWIST1）联合检测，可将敏感性提升至90%以上，同时保持较高特异性，从而显著提高膀胱癌早期筛查和复发监测的准确性^［32］。这种联合标志物策略不仅可以反映肿瘤分子表型，还能够对肿瘤侵袭性、分级及复发风险进行预测，为膀胱癌的个体化管理提供可靠依据。

3 VIM基因与TMEFF2基因甲基化联合检测的优势

近年来，多项研究表明，单一基因的甲基化检测在膀胱癌早期筛查和复发监测中存在一定的局限性。虽然VIM和TMEFF2均已被证实为膀胱癌的关键分子标志物，但两者在肿瘤分子表型及生物学功能上存在互补性：VIM启动子低甲基化导致其过表达，通过促进EMT增强肿瘤细胞迁移、侵袭及转移能力；而TMEFF2启动子高甲基化导致其表达下调，削弱抑癌功能，促进肿瘤增殖、侵袭及复发风险^［33］。由此可见，VIM和TMEFF2分别反映了膀胱癌细胞的侵袭性与增殖能力，联合检测可从多个分子维度捕捉肿瘤早期及微小病变信息，从而提高诊断敏感性^［34］。这种多维度信息不仅提高了检测的灵敏度，也降低了假阴性率。在一项涵盖200例膀胱癌患者的多中心研究^［24］中，联合VIM和TMEFF2甲基化检测在早期膀胱癌患者中检出率达92%，而单独VIM或TMEFF2检测仅为80%~85%，说明联合策略能够覆盖单基因检测未能识别的肿瘤亚群。

根据癌症基因组图谱（The Cancer Genome Gtlas， TCGA）膀胱癌分子分型研究^［7］，VIM甲基化/表达更富集于“基底样”亚型（占35%），而TMEFF2甲基化在“管腔乳头状”亚型（占40%）中频率更高。由于膀胱癌具有高度异质性，单一标志物难以覆盖所有亚型。而VIM+TMEFF2双靶点组合可覆盖超过90%的尿路上皮癌分子亚型，显著提升整体检测灵敏度^［7，35］。

从临床验证角度，联合甲基化检测在尿液非侵入性检测中显示出显著优势。Costa等^［3］在多中心研究中报道，单独VIM或TMEFF2检测敏感性分别为80%~85%和75%~82%，特异性约为88%~92%，而将二者联合检测时敏感性可提升至90%~95%，特异性仍保持在85%~90%。联合检测尤其适用于低级别或非肌层浸润膀胱癌的早期发现，可显著降低假阴性率^{［3，7，35-36］}。

此外，联合检测在复发监测中也表现出优越性。患者尿液中VIM和TMEFF2甲基化联合呈阳性可提前数周至数月预测复发风险，相比单一标志物检测，临床干预时机更早^［36］。进一步的研究^［5，23］显示，联合检测结果与组织学甲基化水平高度一致（85%~90%），验证了其可靠性和重复性。

多项前瞻性与回顾性研究验证了VIM/TMEFF2联合检测的临床效能（表1）。基于上述证据，2023年欧洲泌尿外科学会（European Association of Urology， EAU）指南首次将“尿液甲基化检测（如含TMEFF2的多基因Panel）”列为非肌层浸润性膀胱癌患者随访的Ⅱb级推荐（证据等级B）^［17］。需要指出的是，目前获批的商业化产品如Bladder EpiCheck^®美国食品药品监督管理局（U.S.Food and Drug Administration， FDA）于2021年批准和UROMARK研究中的检测Panel，虽同为基于DNA甲基化的无创检测方法，但其具体的甲基化标志物组合与 VIM/TMEFF2策略不同，这凸显了该领域多种技术路径并行发展的现状^［8，10］。

4 结论与展望

综上所述，传统膀胱镜与尿脱落细胞学作为目前膀胱癌筛查与术后监测的“金标准”，均存在难以克服的瓶颈。DNA甲基化作为肿瘤发生早期的“驱动性”表观遗传事件，具有信号稳定、可经尿液无创富集等优势，已成为液体活检领域颇具转化前景的策略之一。

大量研究^［37］证实，VIM与TMEFF2基因启动子区CpG岛高甲基化在膀胱癌中呈现高频、特异改变，且甲基化水平与肿瘤分期、分级呈正相关，与术后无复发生存期呈负相关，提示其兼具早期诊断与预后评估双重价值。多中心队列数据^［7，11］表明，VIM/TMEFF2双靶点联合检测可将早期/低级别尿路上皮癌的灵敏度提升至91.4%，特异度达93.1%，显著优于现行方案；在术后复发监测中，该组合可有效地预测短期内（如6个月内）的复发风险，阴性预测值（NPV）高达96.7%。

然而，当前研究多基于单中心设计，缺乏统一的样本前处理、亚硫酸氢盐转化效率评估及甲基化定量阈值设定标准。未来需开展大样本、多中心、前瞻性注册临床试验，系统评估VIM/TMEFF2甲基化检测在不同风险分层人群中的长期获益，建立标准化、可重复的实验流程与质量控制体系，并结合卫生经济学模型明确其成本-效果优势，方能推动该策略由科研验证迈向常规临床应用，实现膀胱癌精准筛查与个体化随访的重大革新。

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基金资助

陕西省重点研发计划项目(2024NC-YBXM-172)

陕西省秦创原“科学家+工程师”队伍建设项目(2022KXJ-152)

延安大学科研项目(2023KXJ-001)