单细胞测序联合TCGA数据分析揭示白藜芦醇在前列腺癌治疗中的关键基因

Single-cell sequencing combined with TCGA data analysis reveals key genes of resveratrol in the treatment of prostate cancer

摘要

目的 基于单细胞测序与TCGA数据库联合分析，探讨白藜芦醇（resveratrol，Res）调控前列腺癌（prostate cancer，PCa）肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的作用机制及其潜在治疗靶点。 方法 通过TCMSP及Herb数据库筛选Res潜在靶点，并与PCa相关基因取交集；利用clusterProfiler软件包进行GO及KEGG功能富集分析。采用单因素COX回归及LASSO回归模型筛选Res相关预后基因，构建风险预测模型并进行验证。借助IOBR软件包分析肿瘤免疫微环境中免疫细胞浸润特征，评估Res对TME的调控作用。采用RT-qPCR检测Res干预前后PC-3细胞中关键预后基因的表达变化。最后，利用STRING数据库构建差异靶点与Res四条核心信号通路关键基因的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络，并运用Cytoscape软件进行可视化分析与核心靶点识别。 结果 单细胞测序结果显示，PCa组织以管腔型（luminal）上皮细胞为主。通过对Res-PCa相关数据集的筛选与交集分析，共获得64个差异表达基因；功能富集分析提示，Res可能通过调控细胞凋亡、TNF、NF-κB及TLR等信号通路发挥抗PCa作用，并鉴定出9个关键靶点基因。生存分析结果显示，在TCGA队列和GSE54460队列中，高风险组患者的总体生存时间均显著短于低风险组（TCGA：P<0.000 1；GSE54460：P=0.008 5）。免疫细胞浸润分析进一步表明，Res可调节TME中免疫细胞的组成与分布。RT-qPCR验证结果显示，Res处理可显著下调风险相关基因—白三烯C4合成酶（leukotriene C4 synthase，LTC4S）和杆状病毒IAP重复蛋白5（baculoviral IAP repeat-containing 5，BIRC5）的mRNA水平（P<0.05），同时显著上调保护性基因—叉头盒蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）及JunB 原癌基因（JunB proto-oncogene，JUNB）的表达（P<0.05）。进一步的生物信息学关联分析提示，FOXO1、PTGS2、JUNB 与BIRC5为核心关键靶点，这些基因可能通过与Res其他差异靶点协同作用，共同调控凋亡、TNF、NF-κB及TLR等核心信号通路。 结论 单细胞与TCGA数据分析表明，FOXO1、PTGS2、JUNB与BIRC5可能是Res抑制PCa生长的关键靶点基因。这些基因的表达水平与患者预后显著相关，其机制可能涉及调节TME中T细胞浸润和巨噬细胞极化等免疫过程。

Abstract

Objective To elucidate the mechanism and potential therapeutic targets of resveratrol （Res） in modulating the tumor microenvironment （TME） of prostate cancer （PCa） through single-cell sequencing and TCGA data analysis. Methods Res targets were screened using the TCMSP and Herb databases， intersected with PCa-related genes， and analyzed via clusterProfiler for Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment. Univariate COX and LASSO regression were employed to screen Res-related prognostic genes for model construction and validation. The “IOBR” tool was used to analyze immune cell components and assess Res’s regulatory effects on the TME. RT-qPCR was performed to validate the impact of Res on the expression of prognostic genes in PC-3 cells. A protein-protein interaction （PPI） network of differential targets and key genes from four core signaling pathways of Res was constructed using the STRING database and visualized with Cytoscape software. Results Single-cell sequencing revealed that PCa was predominantly composed of luminal-like epithelial cells. A total of 64 Res-PCa intersection genes were identified. Enrichment analysis indicated that Res exerts anti-PCa effects by regulating pathways such as apoptosis， tumor necrosis factor （TNF）， nuclear factor kappa-B （NF-κB）， and toll-like receptors （TLR）， with nine key target genes identified. Survival analysis showed that in both the TCGA and GSE54460 cohorts， patients in the high-risk group had significantly shorter survival times compared to the low-risk group， with P values of P<0.000 1 and P=0.008 5， respectively. Immune cell component analysis suggested that Res can modulate the distribution of immune cells in the TME. RT-qPCR confirmed that Res significantly downregulated the risk genes leukotriene C4 synthase （LTC4S） and baculoviral IAP repeat-containing 5 （BIRC5）， P<0.05， while upregulating protective genes forkhead box O1 （FOXO1）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， and JunB proto-oncogene （JUNB）， P<0.05. Bioinformatics analysis of the association between Res differential targets and four core signaling pathways revealed that FOXO1， PTGS2， JUNB， and BIRC5 were key targets， interacting with other Res genes through the regulation of apoptosis， TNF， NF-κB， and TLR signaling pathways. Conclusion Single-cell and TCGA data analyses suggest that FOXO1， PTGS2， JUNB， and BIRC5 may be key target genes for Res in inhibiting PCa growth. The expression levels of these genes are significantly correlated with patient prognosis， and the underlying mechanism may involve the regulation of immune processes such as T cell infiltration and macrophage polarization in the TME.

Graphical abstract

关键词

前列腺癌 / 白藜芦醇 / 单细胞测序 / 联合单细胞测序与癌症基因组图谱 / 预后模型 / 肿瘤免疫

Key words

Prostate cancer / Resveratrol / Single-cell sequencing / Integrated single-cell sequencing and TCGA analysis / Prognostic model / Tumor immunity

《2020年全球癌症统计》数据显示，前列腺癌（prostate cancer，PCa）现已成为全球范围内男性最常见的癌症类型，并且是男性癌症死亡的第二大原因^［1］。虽然通过前列腺特异性抗原检测和直肠指诊等早期筛查，已在一定程度上提高了PCa的早诊率、改善了其预后，降低了死亡风险，但复发、转移和去势抵抗性Pca仍显示出持续上升的趋势。手术和局部放疗通常是早期PCa治疗的首选方法。然而，多数患者由于早期阶段症状不明显，往往在发展到中晚期时才被确诊。雄激素剥夺治疗是中晚期PCa的主要治疗手段，遗憾的是，大多数患者后期对雄激素剥夺治疗产生耐药，形成去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），治疗效果明显受限，且肿瘤细胞的扩散极大地增加了患者的生存风险。因此，探寻新的治疗方法，寻找更有效、低毒的治疗药物较为迫切。白藜芦醇（resveratrol，Res）作为一种广泛存在于葡萄、虎杖、桑葚等多种植物中的天然多酚化合物，引起了研究者的关注。研究^［2-3］表明，Res能通过多种机制发挥作用，包括调控细胞凋亡信号转导通路中半胱天冬蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、BCL2关联X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）和B细胞淋巴瘤基因-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的表达，上调缺氧诱导因子-1α和抑癌基因p53的表达以及增加活性氧浓度，从而诱导PCa细胞凋亡。此外，Res还可通过抑制波形蛋白、血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶7的表达，上调E-钙粘蛋白和膜联蛋白2的表达，有效抑制PCa的转移^［4］。有研究^［5］表明Res还能通过影响雄激素受体和趋化因子受体4抑制PCa细胞的生长。通过调控c-Jun氨基末端激酶、细胞外调节蛋白激酶和ETS转录因子ELK1等信号分子，上调Rad9蛋白表达并提高活性氧水平，抑制NF-κB通路，从而抑制癌细胞生长于转移^［6-8］。在调节TME方面，Res通过Wnt/β-连环蛋白通路抑制CAFs的转化生长因子-β表达^［9-10］，还可以激活衰老相关分泌表型通路，并抑制信号转导和转录激活因子和鞘氨醇-1-磷酸-Yes相关蛋白信号轴，促进M1巨噬细胞极化或抑制M2巨噬细胞极化^［11］，并通过CAFs促进上皮-间充质转化^［12］。这些研究不仅进一步揭示了Res在抗肿瘤治疗中的潜力和其作用机制的多样性，也强调了深入探索其调控网络的重要性。但当前的研究依然局限于对特定分子或生物通路的研究，对Res在抗PCa中整体分子网络的作用机制尚不清晰。

单细胞技术在肿瘤研究中发挥着关键作用，可以深入了解肿瘤内部的细胞异质性，揭示肿瘤细胞群落中不同亚群的特征和功能^［13］，还可以对个体细胞的基因表达、突变状态、表观遗传学修饰等进行高分辨率的分析，从而识别和理解肿瘤内不同细胞亚群的功能^［14］。本研究将通过单细胞测序联合TCGA数据分析，系统解析PCa肿瘤免疫微环境中免疫细胞组分的差异，并筛选与PCa进展密切相关的免疫调节关键基因和信号转导通路，旨在为Res在PCa治疗中的应用提供新的理论依据，并为开发基于天然化合物的PCa治疗策略奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人前列腺癌PC-3细胞株来自延安大学医学研究实验中心细胞库，RPMI-1640培养基（上海达特希尔生物科技有限公司），胎牛血清（美国MRC公司），Res（上海源叶生物公司），PT-qPCR分析引物由上海生工生物工程公司合成，Trizol（美国赛默飞世尔科技有限公司），RNA反转录试剂盒和qPCR试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司），CO₂恒温细胞培养箱（美国赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 转录组数据与单细胞测序数据的获取与处理

使用R包“TCGAbiolinks”下载癌症基因组图谱（TCGA；https：//portal.gdc.cancer.gov）数据，并选择下载TPM数据类型。同时从高通量基因表达数据库（GEO；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中获取Res数据集GSE54460，以供后续验证队列的使用。为了进行后续分析，本研究对所有的数据进行了log₂转换。从GEO数据库下载单细胞数据集GSE193337，提取其中PCa与CRPC样本。采用Seurat包进行处理，其中包括数据质量控制，筛选单个细胞基因数目大于200的细胞、排除线粒体基因比例过高的细胞，进行核糖体基因表达分析以及高度可变基因数设定为3 000。使用IntegrateData函数对数据进行校正和整合，并使用umap方法降低数据的维度，再利用K最邻近方法进行细胞聚类。细胞标志物的注释是通过CellMarker2.0网站完成的，并通过“PercentFeatuet”函数导入Res相关基因的信息。

1.3 Res-PCa潜在靶点筛选及基因本体（Gene Ontology，GO）/京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

以口服利用度 ≥30%和类药性 ≥0.18为标准，通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP；https：//tcmsp-e.com）筛选Res相关蛋白靶点，并且经过uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）转换为基因靶点，获得Res药物靶点。通过“copykat”包进行细胞拷贝数变异分析，以区分正常细胞和肿瘤细胞，并进行差异比对，获得PCa相关基因。将Res药物靶点与PCa相关基因汇总，去除重复基因，得到Res相关靶基因。同时，使用“clusterProfiler”包进行富集分析，包括功能注释和通路分析。

1.4 Res预后模型的构建及外部验证

首先通过单因素COX回归分析，从Res靶基因中筛选具有预后价值的候选基因。随后，使用最小绝对值收缩和选择算子LASSO回归对候选基因进一步筛选，构建基于靶基因的预后风险模型。通过模型计算每个PCa样本的风险分数，将TCGA PCa队列中的患者分为高危组和低危组，中位数作为分界点。GEO中的GSE54460队列被选为外部验证队列。随后进行生存分析以明确验证队列中高危组和低危组之间预后是否存在差异，并使用ROC曲线评估模型的准确性。最后，使用主成分分析（principal components analysis，PCA）来探索模型中高风险组和低风险组是否具有代表性。

1.5 免疫浸润与相关评分的分析

使用R包“IOBR”进行免疫浸润分析。使用CIBERSORT、EPIC、Quanti-seq、TIMER等多种方法对PCa样本进行免疫细胞组成分析。并进一步分析不同风险组免疫细胞浸润的差异，使用热图可视化不同浸润水平的免疫细胞。

1.6 细胞培养和干预

PC-3细胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ug/mL链霉素的RPMI-1640培养液培养，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中。实验设实验组和对照组，50 μmol/L Res的5%胎牛血清培养液处理48 h的PC-3细胞为实验组，加入等体积的5%胎牛血清完全培养液处理48 h的PC-3细胞为对照组。实验选取对数生长期细胞进行研究。

1.7 RT-qPCR

按1.6分组弃上清液收集PC-3细胞。采用Trizol法提取RNA，反转录、荧光定量检测按照试剂盒说明书步骤进行。被检测基因所使用的引物序列见增强出版附件表1。以GAPDH为内参，采用2^-△△CT方法测定靶基因的相对表达水平。

1.8 Res差异靶点与核心信号转导通路的关联性生信分析

基于KEGG富集分析明确的Res抗PCa核心信号转导通路与RT-qPCR验证的差异表达靶点，通过生信分析解析两者的关联性。利用STRING数据库构建“关键靶点-Res-核心信号转导通路”蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）网络，并通过Cytoscape软件进行可视化分析。

1.9 统计学方法

使用SPSS22.0软件进行统计分析。R编程语言中的ggplot2包进行数据可视化，以直观展示数据分布。采用GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行处理。进行t检验来比较两组的数据集，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单细胞测序分析描绘PCa细胞图谱

本研究分析PCa的单细胞测序数据集GSE193337，以整合不同的样品。首先将研究样本根据临床类型分为PCa和更具侵袭性的CRPC（图1A），并展示两种类型样本的细胞数量（图1B）。然后，通过K最邻近聚类算法将所有单元聚类为13个不同的细胞（图1C）。将13个细胞簇注释为具体的细胞类型，包括有：Luminal样上皮细胞、Basal样上皮细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤干细胞（图1D）。各细胞类型的计数图，其中Luminal样上皮细胞为数量占比最高的亚群（图1E）。以点图形式，展示用于注释的标记基因在各细胞类型中的特异性表达水平（图1F）。最后，通过细胞拷贝数和克隆亚结构分析将细胞区分为恶性细胞和非恶性细胞（图1G）。

2.2 Res-PCa潜在靶点基因获取及通路富集分析

通过将TCMSP和Herb数据库获得的靶点基因汇总并去重，共得到321个Res潜在靶点基因。将恶性细胞与非恶性细胞两组进行差异对比，得到1 889个PCa相关基因。利用Venn图取交集，得到64个交集基因（图2A、B）。利用clusterProfiler包，对靶点基因进行GO/KEGG富集分析。研究Res-PCa相关靶点基因的生物过程、细胞组分和分子功能，根据P<0.01，确定了1 080个GO条目，107个KEGG通路。生物过程主要涉及细胞对化学应激的反应、对活性氧的反应和凋亡信号转导通路的调控等。细胞组分主要涉及膜微区、膜筏、细胞器外膜等。分子功能主要涉及细胞因子受体、抗氧化活性、蛋白磷酸酶结合、趋化因子受体结合等。KEGG富集分析结果显示，Res抗PCa的调节作用主要涉及凋亡、肿TNF、NF-κB及Toll样受体等信号转导通路（图2C）。

2.3 Res预后模型构建与外部验证

单因素COX回归分析初步获得Res预后相关基因。LASSO回归分析进一步筛选（图3A），得到9个关键靶点基因，分别为BIRC5、CASP8、CCNE1、FOXO1、JUNB、LTC4S、PTGS2、SPARC、TPT1，并构建预后模型（表2）。通过生存分析发现，在TCGA队列和GSE54460队列中，高风险组患者的生存时间均显著短于低风险组，两组P值分别为P<0.000 1和P=0.008 5（图3B、C）。使用ROC曲线来评估模型的准确性，TCGA队列训练组的1、2、3、5年曲线下面积约0.7，曲线下面积（rea under curve，AUC）值分别为0.693、0.714、0.737和0.778（图3D），GSE54460队列验证组的1、2、3、5年曲线下面积约0.65，AUC值分别为0.655、0.641、0.634和0.630（图3E），结果显示高风险组与低风险组的样本在整体基因表达谱上呈现明显的分离趋势。通过PCA降维可视化，结果显示高风险组与低风险组的样本在整体基因表达谱上呈现明显的分离趋势（图3F、G）。

2.4 Res相关预后靶点的免疫细胞组成分析与定位分析

在低风险组患者中，观察到更高水平的M0型巨噬细胞和CD8⁺ T细胞浸润，在高风险组患者中展现出较高水平的调节性T细胞（Tregs）、CAFs以及M2巨噬细胞的浸润，CD8⁺ T细胞比例下降（图4A）。每个目标基因在肿瘤细胞、免疫细胞（细分亚型）、基质细胞等中的表达量（图4B）。在单细胞水平上，可视化展示关键预后基因的表达如何分布在不同细胞簇中，BIRC5和CCNE1主要在Luminal细胞中表达，CASP8在T细胞中占主导地位，FOXO1主要在内皮细胞中表达，LTC4S在肿瘤干细胞中有显著表达，PTGS2则在巨噬细胞和肿瘤干细胞中表达，SPARC主要在内皮细胞和成纤维细胞当中、表达，而JUNB和TPT1在各细胞类型中广泛分布（图4C）。

2.5 RT-qPCR验证Res对PCa预后相关靶点基因表达的影响

RT-qPCR结果表明，与对照组比较，50 μmol/L Res处理PCa PC-3细胞中FOXO1、PTGS2和JUNB的mRNA相对表达显著上调，同时LTC4S和BIRC5的mRNA相对表达显著下调（P<0.05），而TPT1、CASP8、CCNE1和SPARC的mRNA相对表达变化差异无统计学意义（P>0.05，图5）。

2.6 Res差异靶点与核心信号转导通路的关联性生信分析

PPI网络构建结果显示，LTC4S未与凋亡、TNF/NF-κB等核心通路中的关键基因形成直接互作，故将其排除。最终，FOXO1、PTGS2、JUNB与BIRC5被确定为位于网络枢纽位置的关键靶点，并作为后续机制解析的核心。该互作网络的可视化结果为，绿色节点代表Res相关核心预后靶点蛋白，蓝色节点代表Res相关的凋亡通路蛋白，粉色节点代表Res相关的TNF/NF-κB通路蛋白，橙色与紫色节点代表Res相关的TLR通路蛋白，节点间连线代表蛋白间的直接相互作用（图6）。

3 讨论

Res因其广泛的药理机制而在抗肿瘤作用中备受关注。近年来，越来越多的研究聚焦于TME。研究^［15］发现TME中的各种细胞参与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、免疫逃逸等过程。Res是否通过调节PCa肿瘤微环境改善肿瘤预后是一个值得探讨的问题，因此本研究基于单细胞测序数据分析PCa中恶性细胞的分布、筛选与预后相关的靶点基因，分析其对TME的调节，为PCa的治疗探寻新的策略提供理论依据。

本研究利用单细胞测序技术构建了一个PCa单细胞图谱，研究显示PCa与CRPC的具有微环境差异，表明PCa TME具有高度的细胞异质性，同时鉴定出PCa TME中包含至少13种转录状态不同的细胞群体和细胞比例。基于已知的细胞类型特异性标记基因，将13个细胞簇注释为具体的细胞类型，包括：免疫细胞的B细胞、T细胞、巨噬细胞；基质细胞的内皮细胞、成纤维细胞；上皮/肿瘤细胞的Luminal样上皮细胞、Basal样上皮细胞、肿瘤干细胞。其中Luminal样上皮细胞为腔上皮样上皮细胞，Basal样上皮细胞为基底样上皮细胞，这两种细胞与肿瘤干细胞的高占比，提示肿瘤内部存在分化状态的异质性及干细胞特性，这可能与治疗抵抗和肿瘤复发相关。本研究同时对各细胞类型中表达的标记基因转录水平进行了验证，细胞注释的准确性确保了后续所有基于细胞类型的分析是可靠的。本研究进一步将上皮细胞区分为恶性细胞和非恶性细胞，恶性细胞在Luminal样上皮细胞亚群中分布最多，与PCa上皮源性细胞认知相一致^［16］。这些恶性细胞很可能是Res作用的直接靶点。本文利用单细胞测序发现，PCa TME是一个由多种细胞协同作用的复杂系统，它为整个研究提供了细胞身份坐标系，使得后续对Res作用靶点、通路和机制的探讨能够准确地“定位”到具体的细胞类型和生物学过程中。

本研究分析获得了64个Res抗PCa相关的的靶点基因，进一步通过GO/KEGG通路富集发现，生物学过程基因显著富集细胞对化学应激的反应、凋亡信号转导通路的调控、对活性氧的反应等过程。这直接暗示Res可能通过影响细胞的应激反应和程序性死亡来对抗PCa。细胞组分基因产物主要定位在膜微区、膜筏、细胞器外膜等。这提示其作用可能与细胞膜信号转导和细胞器功能密切相关。分子功能基因编码的蛋白质具有抗氧化活性、蛋白磷酸酶结合、趋化因子受体结合等功能。这为Res的抗氧化和信号干扰作用提供了分子基础。KEGG通路显著富集的核心信号转导通路有：① TNF与NF-κB信号转导通路：这是经典的炎症、细胞存活与凋亡调控通路，在癌症发展中至关重要；② TLR信号转导通路：连接先天免疫与炎症反应；③ PCa通路：直接证实这些基因参与PCa的疾病进程；④ 细胞凋亡与p53信号转导通路：是肿瘤抑制的关键机制。本研究通过GO/KEGG分析提示了Res可能通过调控一组与前列腺癌共享的核心基因网络，影响凋亡、炎症和氧化应激等关键通路，从而抑制肿瘤发展。

本研究通过Lasso回归筛选特征基因，构建了一个预后风险模型。该预后风险模型的特征基因包括BIRC5、CASP8、CCNE1、FOXO1、JUNB、LTC4S、PTGS2、SPARC、TPT1，该模型在内部训练集（TCGA队列）和外部独立验证集（GSE54460队列）中均进行了系统验证，内容包括生存分析、时间依赖性ROC曲线和主成分分析PCA。生存分析发现，无论是在TCGA队列（P<0.000 1）还是GSE54460队列（P=0.008 5），高风险组患者的生存时间均显著短于低风险组。这证明该模型能有效区分预后良好和预后不良的患者群体。时间依赖性ROC曲线结果发现，在TCGA队列模型具有中等到良好的预测能力，尤其在2年、3年期的预测表现最佳（AUC>0.79），表明模型对中远期预后的预测较为可靠。在外部验证集中，模型展现了优异且稳定的预测性能，所有时间点的AUC值均较高，这支持了模型的泛化能力，即其预测效果在不同数据集中具有可重复性。主成分分析PCA结果显示高风险组与低风险组的样本在整体基因表达谱上呈现明显的分离趋势。这表明风险分组与全局基因表达差异相关，证明了该模型具有稳定的预测能力。本研究通过对Res相关的基因构建预后风险模型发现，模型组的基因与临床结局密切相关，证实了这些基因具有重要的临床意义。

为深入理解上述差异的潜在病理机制及Res在PCa患者免疫应答中的作用，本研究对免疫细胞组成及关键预后基因的细胞层面表达定位进行分析，核心意义在于明确了免疫浸润特征与PCa患者预后的密切关联，以及Res调控TME免疫微环境的潜在价值。研究明确了低风险组患者具有更优的免疫浸润状态，表现为CD8⁺ T细胞等效应性免疫细胞浸润水平更高，而高风险组则呈现免疫抑制表型，即Tregs等免疫抑制性细胞浸润增加、CD8⁺ T细胞浸润减少，这一差异直接揭示了免疫微环境失衡是高风险组患者预后不良的关键原因，也为Res发挥抗肿瘤作用的免疫调控路径提供了核心线索。结合关键预后基因的细胞层面表达定位，进一步明确了Res相关靶点基因可通过调控上述免疫细胞及肿瘤相关细胞的生物学行为，重塑TME免疫稳态。有研究^［17］显示，Res可以抑制M1型巨噬细胞的极化，同时促进M2型巨噬细胞极化，并具有调控巨噬细胞能量代谢的功能。童晨曦等^［18］发现，Res可以增加骨肉瘤荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞、NK细胞、NKT细胞百分比，降低MDSCs和Treg细胞百分比。这些研究表明，Res可能通过作用于该组预后基因，改变特定免疫细胞的功能状态，进而重塑整个肿瘤免疫微环境，最终影响患者的疾病进程和预后。

研究^［19-20］发现，LTC4S通过促进Treg细胞的增殖、增强IL-4、IL-5等细胞因子的分泌，以及调节钙通道的活性，抑制效应T细胞的活性，从而导致免疫逃逸现象的发生。BIRC5可促进M2型巨噬细胞及Treg细胞的富集程度提高，并对CTLA4及PD-1/PD-L1的阻断表现出更高的敏感性^［21］。FOXO1能够促进CD8⁺ T细胞的“干细胞样”表型，抑制Treg细胞的功能，从而增强Th17细胞的活性，提高其持久性及抗肿瘤活性^［22-23］。PTGS2能够逆转T细胞的排斥反应，使肿瘤对免疫治疗产生更高的敏感性^［24］。JUNB则在调节巨噬细胞的极化及细胞因子的分泌方面起到重要作用，同时参与调节性CAF、TAMs、Treg及Treg介导的免疫稳态的分化，改变TME的特征^［25-26］。此外，有研究^［27］报道，在多种肿瘤细胞中LTC4S、BIRC5、FOXO1、PTGS2和JUNB蛋白表达与肿瘤的预后不良、肿瘤分期及转移风险增加相关。在本研究中，通过RT-qPCR对单细胞测序的生物信息分析结果进行验证，发现Res可以下调PC3细胞中LTC4S和BIRC5的表达，同时上调FOXO1、PTGS2和JUNB的表达。这些发现提示Res可能通过上述5个基因的表达调节肿瘤免疫微环境，影响PCa的生长和进展，可作为治疗的潜在靶点基因和评估患者预后的生物标志物。

通过Res差异靶点与核心信号转导通路的关联性生信分析结果发现，FOXO1、PTGS2、JUNB、BIRC5均与四条核心通路的关键蛋白存在广泛且直接的互作关系：其中PTGS2与TNF通路的TNF、IL6蛋白互作最为显著，同时与凋亡通路的CASP3、CL2蛋白形成强相互作用；FOXO1主要锚定凋亡通路，与BAX、BCL2等核心调控蛋白存在直接互作；JUNB同时关联TNF/NF-κB 通路的RELA、NFKB1，以及TLR通路的TLR4、TRAF6蛋白；BIRC5则与凋亡路的CASP8、XIAP等关键蛋白高度耦合，构成核心调控节点。上述PPI网络分析证实，Res可通过调控FOXO1、PTGS2、JUNB、BIRC5四个核心靶点，精准衔接凋亡、TNF、NF-κB及TLR信号转导通路，进而发挥抗PCa作用，明确了差异靶点与核心通路的调控关联，完善了Res抗PCa的分子机制解析。

目前的研究发现Res可以影响调节TME中免疫细胞的基因表达，而这些基因可以作用PCa单细胞测序的细胞类型上，并与患者预后相关，推测Res可能是PCa潜在的治疗药物。然而，本研究仍有一些局限性：未在肿瘤细胞与巨噬细胞的共培养模型及动物微环境模型中进行进一步实验，同时也缺乏对临床样本的验证和分析结果。未来的研究应结合单细胞测序数据进行更深入的机制研究，将有助于识别影响治疗效果的关键因素，从而推动个体化治疗策略的实施。

综上所述，鉴于TME的复杂性，采用网络药理学与PCa的单细胞分析对Res的调控网络进行深入 分析，该模型不仅揭示了Res在PCa治疗中的新机制，展现了其显著的治疗潜力，还发现Res可能通过BIRC5、FOXO1、PTGS2、JUNB相互作用共同发挥治疗PCa的作用。通过构建一个从整体网络角度探索 Res治疗PCa潜在靶点的模型，展现了Res在体内复杂环境中调控网络的广度，超越了传统的单一靶点研究方法。这一综合方法为深入理解Res的作用机制和开发新的治疗策略提供了有力的科学依据。

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基金资助

陕西省科技厅项目(2024CX-GXPT-27)

延安市科技计划项目(2023-SFGG-098)

陕西省大学生创新项目(S202410719094)