湖北贝母内生真菌Fusarium foetens化学成分研究

Chemical constituent and anti-inflammatory activity of endophytic Fungus Fusarium foetens from Fritillaria hupehensis

摘要

采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、MPLC和（半）制备HPLC的方法对湖北贝母内生真菌Fusarium foetens固体发酵产物的乙酸乙酯萃取物进行研究，共分离得到10个化合物，通过波谱学数据分析并结合其物理性质，将其鉴定为： n-苯乙基乙酰胺（1）、fusaric acid（2）、beauvericin（3）、methylp-hydroxy benzeneacetate（4）、fumitremorgin x（5）、1-acetyl-2，4，5，7-tetrahydroxy-9（6）、5，5'-dimethoxybiphenyl-2，2'-diol（7）、p-（acetylamino） benzoic acid（8）、gibepyrone D （9）、5-羟甲基-2-呋喃甲醛（10）. 其中化合物5为新化合物. 采用脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7巨噬细胞产生NO炎症效应对以上化合物进行抗炎活性检测，其中化合物8表现出良好的抗炎活性（IC₅₀ = 22.91 μM）.

Abstract

By using gel column chromatography， Sephadex LH-20， MPLC， and （semi-） preparative HPLC， the chemical constituent of Fusarium foetens from Fritillaria hupehensis was studied， from which 10 compounds were obtained. According to the spectroscopic data， combined with their physical and chemical properties， their structures were identified as n-phenethylacetamide （1），fusaric acid （2），beauvericin （3），methylp-hydroxy benzeneacetate （4），fumitremorgin x （5），1-acetyl-2，4，5，7-tetrahydroxy-9 （6），5，5'-dimethoxybiphenyl-2，2'-diol （7），p-（acetylamino） benzoic acid （8），gibepyrone D （9），5-hydroxymethylfurfural （10）， in which compound 5 wase first reported as a natural product. All compounds were evaluated for anti-inflammatory activity， and compound 8 showed great anti-inflammatory activity.

Graphical abstract

关键词

湖北贝母 / 内生真菌 / 化学成分 / 抗炎活性

Key words

Fritillaria hupehensis / endophytic fungi / chemical constituent / anti-inflammatory activity

内生真菌广泛存在于健康植物组织中，与植物之间存在复杂的微生态关系，是一种新的微生物资源. 通过与植物协同进化，内生真菌会合成与宿主植物相同或相似的代谢产物，在医药、农业和工业生产等方面均有应用且在不断发展^［1］. 内生真菌除可产生与宿主植物相同或相似活性成分，还表现出与药用植物具有协同互作等多种生物学功能，为解决珍稀濒危药用植物资源保护和可持续利用问题提供了新的思路^［2］. 湖北贝母（Fritillaria hupehensis Hsiao et K. C. Hsia）是百合科贝母属草本植物，其干燥鳞茎入药，微苦，性寒，归肺、心经^［3］. 为拓展新的药物先导化合物资源，本课题组选取了一株湖北贝母内生真菌（Fusarium foetens），对其大米发酵物的次生代谢产物进行了研究，共得到10个化合物单体（图1）. 通过波谱学数据分析并结合其物理性质，将其鉴定为： n-苯乙基乙酰胺（1）、fusaric acid（2）、beauvericin（3）、methylp-hydroxy benzeneacetate（4）、fumitremorgin x（5）、1-acetyl-2，4，5，7-tetrahydroxy-9（6）、5，5'- dimethoxybiphenyl-2，2'-diol（7）、p-（acetylamino） benzoic acid（8）、gibepyrone D（9）、5-羟甲基-2-呋喃甲醛（10）. 其中化合物5为新化合物.

1 实验部分

1.1 仪器与材料

核磁共振波谱仪（AM600型，德国Bruker），柱色谱材料：正相柱色谱硅胶（200~300目，500~800目）与薄层色谱硅胶板（青岛海洋化工厂）；Sephadex-LH 20（瑞典Amersham Biosciences）；反相材料Chromatorex（40~75 μm）（日本Fuji Silysia）； HPLC（1260型，美国Agilent），色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18柱（4.6 mm × 150 mm），粒径为5 μm；制备型HPLC为Agilent 1260，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（9.4 mm × 150 mm），粒径为5 μm. 显色方法为紫外灯下波长254 nm和365 nm处观察荧光，香草醛溶液及10%硫酸乙醇溶液显色剂加热显色.

1.2 内生真菌的分离、鉴定及其发酵培养

该菌分离自新鲜湖北贝母植株的根部，新鲜湖北贝母采自湖北省恩施州恩施市新塘乡双河社区.

内生真菌分离过程：湖北贝母块根，自来水冲洗1~2 min，经75%乙醇润洗30 s，放入1.5%次氯酸钠溶液中1.5 min，再用无菌水漂洗3次，以最后一次无菌水清洗液为对照，在PDA培养皿涂布后同步培养观察. 吸干水分，无菌条件下，将湖北贝母块根切成0.5 cm左右的小块，接至含2%青链霉素混合液的PDA固体培养基中，置25 ℃的恒温培养箱中培养. 待真菌长出后，挑取菌丝进行纯化培养得单一菌株. 通过ITS序列测定结果对比得知，该序列与Fusarium foetens的最大相似度达100%. 基因库登录号为OP967916.1. 故将其鉴定为Fusarium foetens. 该菌株保藏于中南民族大学药学院微生物菌种库.

研究采用大米固体发酵培养，培养基：每瓶大米50 g，水50 mL，共340瓶，置于500 mL培养瓶中经120 ℃高温灭菌20 min，于25 ℃恒温暗培养30 d.

1.3 提取分离

将发酵后的大米培养物用乙酸乙酯反复浸泡3次，合并提取液，减压浓缩后以少量水溶解，并用乙酸乙酯反复萃取4次，合并萃取液浓缩，得到浸膏160 g. 浸膏经正相硅胶柱层析（氯仿-甲醇：100∶0→0∶100）梯度洗脱得到6个组分（A-E）. 组分C经过正相硅胶柱层析（石油醚-丙酮： 100∶0→0∶100）分离，用薄层层析色谱检测，浓缩得到6个亚组分C1-C6. 组分C5经正相硅胶柱层析（石油醚-丙酮）分离得到4个组分. C5-1经凝胶柱色谱分离得到6个组分，C5-1a经高效液相色谱（色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A，S-5 μm，12 nm，AA12S05-1510WT，水-乙腈80∶20→0∶100）分离纯化，得到化合物3 （1.0 mg）、5 （2.3 mg）和6 （0.8 mg）. C5-1b经高效液相色谱（色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A，S-5 μm，12 nm，AA12S05-1510WT，水-乙腈80∶20→0∶100）分离纯化，得到化合物1 （2.2 mg）、2 （1.4 mg）和4 （2.3 mg）. C4经中压液相色谱（色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A，S-5 μm，12 nm，AA12S05-2510WT，水-甲醇：80∶20→0∶100）分离得到5个亚组分（C4-1~C4-5）. C4-4经凝胶柱色谱分离得到4个组分. C4-4c经高效液相色谱（色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A，S-5 μm，12 nm，AA12S05-1510WT，水-乙腈80∶20→0∶100）分离纯化，得到化合物7 （0.9 mg）、8 （1.5 mg）、9 （1.6 mg）和10 （2.6 mg）.

1.4 抗炎活性检测

采用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞产生NO的炎症效应对化合物1-10进行了抗炎活性的检测. 在37 ℃，5% CO₂环境下，向Dulbecco's培养液中加入10%胎牛血清. 选择处于对数生长期的RAW 264.7细胞，接种在12孔板中（每孔1 mL）培养，分为空白对照组， 阳性对照组（阳性对照药为Pyrrolidinedithiocarbamate）和实验组处理. 培养24 h后每孔加入100 μL MTT溶液继续培养2 h，随后每孔加入200 μL DMSO. 取上清液100 µL，加入100 µL Griess试剂，使用酶标仪在540 nm处测量吸光度.

2 结构鉴定

分离得到的化合物的结构式如图1所示.

化合物5：白色粉末，通过 HRESIMS分析，确定其化学式为C₁₉H₂₃N₃O₂ （m/z 326.18622 ［M+H］⁺， 计算值为326.18630），得出不饱和度为10. 其 ¹³C NMR 光谱显示有19个信号，分别由3个甲基碳［δ_C 24.4 （C-18）， 21.3 （C-21）， 19.3 （C-22）］、2个sp³杂化亚甲基碳［δ_C 45.7 （C-19）， 27.9 （C-10）］、4个sp³杂化次甲基碳［δ_C 54.2 （C-9）， 52.9 （C-6）， 45.9 （C-3）， 23.4 （C-20）］、8个烯烃碳［δ_C 136.2 （C-17）， 133.7 （C-2）， 126.5 （C-12）， 122.7 （C-15）， 120.3 （C-14）， 118.4 （C-13）， 111.2 （C-16）， 106.8 （C-11）］和2个羰基碳［δ_C 167.4 （C-8）， 165.0 （C-5）］. 其 ¹H 和¹³C NMR 数据与demethoxyfumitremorgin C相似. 明显的不同之处在于 C-3处的异戊烯基变成了甲基（δ_C 24.4）和C-6位上的四氢吡咯开环. H-6/H-19/H-20/H-21（H-22）、H-9/H-10、H-3/H-18和H-13/H-14/H-15/H-16的¹H-¹H COSY相关证实了图2所示的四个相连片段，以及H-9与C-5、H-3与C-5、H-6与C-5和C-8及H-19与C-6和C-5 HMBC相关也证实了二酮哌嗪这一骨架. 此外，H-9/H-18之间的ROESY相关性表明它们位于同一侧并被指定为α取向. 此外，根据ECD计算（图3），确定了该化合物的绝对构型. 因此，5的绝对构型被确定为（3R，6S，19S），对比文献^［4］，将该化合物命名为fumitremorgin x.

化合物1：C₁₀H₁₃NO，乳白色无定形粉末. ¹H NMR （CDCl₃，600 MHz） δ_H 1.97 （3H， s， H-2）， 3.56 （2H， t， J=7.2 Hz， H-1'）， 2.86 （2H， dt， J=6.6 Hz， H-2'）， 7.23 （2H， d， J = 7.2 Hz， H-2″， H-6″）， 7.35 （2H， t， J=7.2 Hz， H-3″， H-5″）， 7.28 （1H， t， J=7.2 Hz， H-4″）. ¹³C NMR （150 MHz， CDCl₃）： δ_C 170.1 （C-1）， 40.6 （C-2）， 35.6 （C-1'）， 23.3 （C-2'）， 138.3 （C-1″）， 128.7 （C-2″， 6″）， 128.8 （C-3″， 5″）， 126.6 （C-4″）. 以上数据和文献［5］数据一致. 故化合物1被确定为n-苯乙基乙酰胺.

化合物2：C₁₀H₁₃NO₂，白色粉末. ¹H NMR （CDCl₃， 600 MHz） δ_H 0.95 （3H， t， J=7.3 Hz）， 1.38 （2H， m）， 1.64 （2H， m）， 2.73 （2H， t， J=7.8 Hz）， 7.75 （1H， d， J=7.8 Hz）， 8.15 （1H， d， J=7.9 Hz）， 8.50 （1H， s）. ¹³C NMR （CDCl₃， 150 MHz） δ_C 164.7 （C-11）， 148.1 （C-6）， 144.2 （C-2）， 143.2 （C-5）， 138.1 （C-4）， 123.7 （C-3）， 32.9 （C-7）， 32.7 （C-8）， 22.1 （C-9）， 13.7 （C-10）. 以上数据和文献［6］数据一致. 故化合物2被确定为fusaric acid.

化合物3：C₄₅H₅₇N₃O₉，白色针状晶体. ¹H NMR （CDCl₃， 600 MHz） δ_H 0.41 （9H， d， J=6.6 Hz， H-14）， 0.79 （9H， d， J=6.6 Hz， H-15）， 1.99 （3H， m， H-13）， 2.96 （3H， dd， J=14.5， 12.1 Hz， H-3b）， 3.00 （9H， s， H-10）， 3.37 （3H， dd， J=14.5， 5 Hz， H-3a）， 4.89 （3H， d， J=8.5 Hz， H-12）， 5.51 （3H， dd， J=12.1， 5 Hz， H-2）， 7.15-7.27 （15H， m， H-5， 6， 7， 8， 9）. ¹³C NMR（CDCl₃， 150 MHz） δ_C 170.0 （C-1， 1'， 1″）， 169.6 （C-11， 11'， 11″）， 136.5 （C-4， 4'， 4″）， 128.8 （C-6， 6'， 6″， 8， 8'， 8″）， 128.5 （C-5， 5'， 5″， 9， 9'， 9″）， 126.7 （C-7， 7'， 7″）， 75.5 （C-12， 12'， 12″）， 57.1 （C-2， 2'， 2″）， 34.7 （C-3， 3'， 3″）， 32.2 （C-13， 13'， 13″）， 29.7 （C-10， 10'， 10″）， 18.3 （C-14， 14'， 14″）， 17.3 （C-15， 15'， 15″）. 以上数据和文献［7］数据一致. 故化合物3被确定为beauvericin.

化合物4：C₉H₁₀O₃，白色晶体. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δ_H 7.06 （2H， d， J=8.5 Hz， H-2， H-6）， 6.72 （2H， d， J=8.5 Hz， H-3， H-5）， 3.65 （3H， s， -OCH₃）， 3.52 （2H， s， H-7）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 173.2 （C-8）， 156.2 （C-4）， 129.9 （C-2， C-6）， 124.9 （C-1）， 114.9 （C-3， C-5）， 60.0 （C-1）， 39.5 （C-7）. 以上数据和文献［8-9］数据一致. 故化合物4被确定为methylp-hydroxy benzeneacetate.

化合物5：C₁₉H₂₃N₃O₂， 白色粉末. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δ_H 7.92 （1H， s）， 7.48 （1H， d， J=7.75 Hz）， 7.35 （1H， d， J=8.16 Hz）， 7.20 （1H， d， J=7.20 Hz）， 7.14 （1H， d， J=7.67 Hz）， 6.19 （1H， s）， 5.86 （1H， dd， J=7.9， 6.1 Hz）， 3.49 （1H， d， J=11.21 Hz）， 2.91 （1H， d， J=12.69 Hz）， 4.40 （1H， d， J=7.86 Hz）， 1.81 （2H， d， J=5.91 Hz）， 1.65 （1H， m）， 1.55 （3H， d， J=6.9 Hz）， 0.97 （6H， m）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 167.4 （C-8）， 165.0 （C-5）， 136.2 （C-17）， 133.7 （C-2）， 126.5 （C-12）， 122.7 （C-15）， 120.3 （C-14）， 118.4 （C-13）， 111.2 （C-16）， 106.8 （C-11）， 54.2 （C-9）， 52.9 （C-6）， 45.9 （C-3）， 23.4 （C-20）， 45.7 （C-19）， 27.9 （C-10）， 24.4 （C-18）， 21.3 （C-21）， 19.3 （C-22）.

化合物6：C₁₆H₁₀O₇，淡黄色粉末. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δ_H 2.50 （3H， s）， 6.56 （1H， d， J=2.3 Hz）， 6.61 （1H， s）， 7.11 （1H， d， J=2.3 Hz）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 206.4 （C=O）， 190.9 （C-10）， 183.9 （C-9）， 167.0 （C-7）， 166.4 （C-5）， 166.2 （C-4）， 163.1 （C-2）， 136.3 （8a）， 132.9 （C-9a）， 127.9 （C-1）， 110.3 （C-8）， 110.2 （C-10a）， 109.7 （C-6）， 109.6 （C-3）， 109.4 （C-4a）， 31.3 （Ac-1）. 以上数据和文献［10］数据一致. 故化合物6被确定为1-acetyl-2，4，5，7-tetrahydroxy-9，10-anthraquinone.

化合物7：C₁₄H₁₄O₄，无色油状. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δ_H 7.14 （1H， s）， 7.02 （1H， J=8.2 Hz）， 6.79 （1H， d， J=8.1 Hz）， 3.88 （3H， s）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 149.7 （C-6， C-12）， 149.2 （C-3， C-14）， 128.3 （C-9）， 123.3 （C-2）， 116.2 （C-4， C-5， C-10， C-11）， 111.3 （C-1， C-13）， 56.3 （C-8， C-17）. 以上数据和文献［11］数据一致. 故化合物7被确定为5，5'-dimethoxybiphenyl-2，2'-diol.

化合物8：C₉H₉NO₃，白色结晶. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δ_H 7.97-7.63 （4H， d， J=8.8 Hz）， 2.15 （3H， s）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 131.6 （C-2， C-6）， 119.8 （C-3， C-5）， 23.8 （CH₃）. 以上数据和文献［12］数据一致. 故化合物8被确定为 p-（acetylamino） benzoic acid.

化合物9：C₁₀H₁₁O₄， 无色结晶. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δH 7.36 （1H， dd， J=7.23 Hz， 0.9 Hz， H-4）， 6.66 （1H， d， J=7.04 Hz， H-5）， 6.58 （1H， s， H-8）， 4.87 （1H， s， H-6）， 3.28 （3H， s， H-7）， 2.32 （3H， d， J=1.18 Hz， -CH₃）， 2.07 （3H， d， J=1.0 Hz， -CH₃）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 169.7 （C-9）， 164.3 （C-2）， 158.6 （C-6）， 143.2 （C-7）， 141.3 （C-4）， 128.0 （C-3）， 120.3 （C-8）， 107.2 （C-5）， 16.7 （C-3）， 13.6 （C-7）. 以上数据和文献［13］数据一致. 故化合物9被确定为gibepyrone D.

化合物10：C₁₀H₁₁O₄， 米色结晶. ¹H NMR （CD₃OD， 600 MHz） δ_H 9.79 （1H， s， -CHO）， 7.65 （1H， d， J=3.38 Hz， H-3）， 6.84 （1H， d， J=3.37 Hz， H-4）， 5.14 （3H， s）， 4.87 （2H， s， -CH₂OH）. ¹³C NMR （CD₃OD， 150 MHz） δ_C 179.5 （-CHO）， 163.2 （C-5）， 153.9 （C-2）， 124.9 （C-3）， 110.9 （C-4）， 57.6 （-CH₂OH）. 以上数据和文献［14］数据一致. 故化合物10被确定为5-羟甲基-2-呋喃甲醛.

3 抗炎活性检测结果

对化合物1-10进行了抗炎活性测试，结果表明化合物8表现出一定的抗炎活性，其IC₅₀值为22.91 μM，略高于阳性对照药Pyrrolidinedithiocarbamate（IC₅₀=23.08 μM）.

4 结语

通过对湖北贝母内生真菌次生代谢产物的系统分离，得到了10个化合物单体，化合物类型涉及生物碱、氨基酸衍生物、蒽醌和酚酸类化合物. 其中化合物5是吲哚类生物碱，该类化合物文献报道具有一定的抗菌活性^［15］；化合物3是酚酸类化合物，有一定的细胞毒活性，对蛋白激酶有抑制能力^［16］. 化合物2、8是氨基酸衍生物，亲水性强，亲和性好，在抗体内具有特殊的生理性能. 化合物7是蒽醌类化合物，具有抗肿瘤，抗病原微生物，保护心脑血管等作用. 对分离得到的10个化合物单体进行抗炎活性研究，发现化合物8表现出一定的抗炎活性，其IC₅₀值为22.91 μM，略高于阳性对照药Pyrrolidinedithiocarbamate，为进一步研究和探索湖北贝母内生真菌中的次生代谢产物抗炎活性提供了重要帮助.

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基金资助

湖北省自然科学基金资助项目(2022CFB462)

植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室开放基金资助项目(P2022-KF03)