长叶格脉树乙醇提取部改善L6细胞葡萄糖摄取的作用机理

Mechanism of ethanol extract of Ochrocarpus longifolius improving glucose uptake in L6 cells

摘要

虽然藤黄科植物历来以其化学成分的多样性和药理活性的丰富性著称，但长叶格脉树植物化学成分研究进展不大，然而长叶格脉树作为铁力木的替代品早已进入药材市场，其潜在的药理活性不容小觑. 为研究长叶格脉树乙醇提取部（ethanol extract of Ochrocarpus longifolius，OLEE）的抗糖尿病活性，利用L6骨骼肌细胞为研究对象检验OLEE促进其葡萄糖摄取的能力，随后在稳定表达转染了myc表位标签的L6细胞的基础上利用激光共聚焦显微镜观察OLEE促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）与细胞质膜的融合能力，最后Western blot实验检测了OLEE作用下L6细胞中GLUT4以及相关信号通路的表达. 结果表明：L6细胞经过OLEE的刺激后增强了葡萄糖摄取能力，促进了GLUT4与细胞质膜的融合能力，在蛋白水平上OLEE增强了GLUT4的表达以及AMPK与PKC的磷酸化水平.该结果为OLEE未来成为抗糖尿病的新型药物提供了有力证据与基础.

Abstract

Garcinia species have historically been known for their diversity of chemical constituents and richness of pharmacological activities. The research progress on the chemical components of Ochrocarpus longifolius is extremely lacking in the market. Ochrocarpus longifolius has entered the medicinal market as a substitute for Mesua ferrea L.， and its potential pharmacological activity cannot be underestimated. To study the anti-diabetic activity of ethanol extract of Ochrocarpus longifolius （OLEE）， L6 cells were used to test the ability of OLEE to promote glucose uptake， and then L6 cells stably expressing myc epitope tag were used to observe the ability of OLEE to promote GLUT4 fusion with the plasma membrane by laser confocal microscopy. Finally， Western blot was used to detect the expression of GLUT4 and related signaling pathways in L6 cells under OLEE treatment. Test results indicate that OLEE stimulation enhanced glucose uptake and promoted the fusion of GLUT4 to the plasma membrane in L6 cells. At the protein level， OLEE enhanced the expression of GLUT4 and the phosphorylation levels of AMPK and PKC. These results provide strong evidence and basis for OLEE as a new anti-diabetes drug in the future.

Graphical abstract

关键词

长叶格脉树 / 2型糖尿病 / L6细胞 / 葡萄糖转运蛋白4

Key words

Ochrocarpus longifolius / type 2 diabetes Mellitus / L6 cells / GLUT4

在糖尿病患者中，2型糖尿病占90%以上，大多数T2DM患者至少有一种并发症，心血管并发症是这些患者发病和死亡的主要原因^［1］. T2DM是一种以胰岛素抵抗（insulin resistance， IR）和糖脂代谢受损为特征的疾病^［2］. 无控制的葡萄糖产生和葡萄糖摄取减少被认为是糖代谢受损的主要驱动因素^［3］. IR引发机体对胰岛素刺激的对抗或信号传递受阻致使摄糖量降低. 胰岛素抵抗发生在许多组织中，在骨骼肌、肝脏和心脏中最为重要. 其中，骨骼肌是最大的器官之一，占人体质量约40%，占基础代谢率的30%左右，在人体运动和全身代谢平衡中起着重要作用^［4］. 糖尿病目前只能通过有效的控制来达到对病情的管理.虽然临床上已经有很多可以用来治疗2型糖尿病的药物，如二甲双胍、阿卡波糖、罗格列酮等，但大部分为西药，副作用较多，病情易反复，而中药治疗糖尿病历史悠久、经验丰富、副作用低，也有着与西药媲美的治疗效果.

长叶格脉树（Ochrocarpos longifolius Benth. & Hook. f. ex T. Anderson）为藤黄科（Clusiaceae）格脉树属（Ochrocarpos Thou.）高大乔木^［5］，主要分布在印度西部的康坎、北卡纳拉、马拉巴尔和哥印拜陀地区^［6-7］，在梵语中被称为“Nagakesara”，在印地语中的名为“Nagkesar”^［8］，《印度阿育吠陀药典》^［9］和《尤纳尼药典》^［10］中记载长叶格脉树的花朵可入药，具有清热健胃，镇痛抗菌的功效，可用于治疗痔疮、消化不良、胃炎、头痛、白癜风等病症. 《印度药用植物》记载长叶格脉树花蕾与铁力木（Mesua ferrea L.）花蕾等同^［6］，在国内民间医药市场中，长叶格脉树的花朵常作为铁力木花的替代品被大量进口和使用^［11］. 在前期筛选实验中发现长叶格脉树乙醇提取物具有一定的降糖作用，且目前尚未有关长叶格脉树用于治疗2型糖尿病的相关报道. 因此本文以长叶格脉树乙醇提取部为材料研究其对L6细胞的中抗糖尿病的作用及机理.

1 材料与方法

1.1 实验与仪器

大鼠L6骨骼肌细胞以及myc-GLUT4-mOrange-L6细胞：稳定表达转染了myc表位标签的L6骨骼肌细胞.

样品于2018年8月购自巴基斯坦庞泽普邦拉合尔市场，经伊犁师范大学生物科学与技术学院庞克坚高级工程师鉴定为藤黄科格脉树属长叶格脉树Ochrocarpos longifolius Benth. & Hook. f. ex T. Anderson的花蕾. 标本存放于湖北省武汉市中南民族大学药学院植物标本库（No. SC0875）. 无水乙醇（湖北申事）；二甲基亚砜（Biosharp）；α-MEM培养基（武汉赛维尔）；胎牛血清（浙江天杭）；胰酶、Penicillin-Streptomycin Solution（美国Gibco）；胰岛素（武汉普诺赛）；二甲双胍（上海源叶）；佛波酯（美国Selleckchem）；葡萄糖氧化酶试剂盒（厦门英科兴创）；SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒（碧云天）；anti-GLUT4、anti-Akt、rabbit phospho-Akt、anti-AMPK α、rabbit-p-AMPKα、rabbit-p-PKC（Cell Signaling Technology）；β-actin（武汉普美克）；anti-c-myc（北京康为世纪）；FITC-goat-anti-mouse IgG（北京康为世纪）.

YB-2000A多功能粉碎机（永康运邦）；R-3001旋转蒸发仪（郑州长城）；LSM700激光共聚焦显微镜（德国Zeiss）；多功能酶标仪（瑞士TECAN）；细胞培养箱（日本松下）；化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad）.

1.2 实验方法

1.2.1 OLEE的制备

将长叶格脉树的干燥花蕾11 kg粉碎成粉末状后，使用体积分数为90％乙醇常温浸泡提取3次，每次使用20 L乙醇浸泡7 d，提取液真空抽滤去除滤渣后合并，滤液经旋转蒸发仪35 ℃减压浓缩直至不再有液体蒸出，得到乙醇提取浸膏3.8 kg.

1.2.2 L6细胞的传代以及分化培养

将复苏的L6细胞用10% FBS培养基于37 ℃、5% CO₂的培养箱中直到细胞生长状态良好. 传代前用灭菌的PBS洗两遍，再用常温化冻的胰酶进行消化，紧接着用含10% FBS的α-MEM培养基进行重悬，最后加5 mL含10% FBS的α-MEM培养基进行培养. 分化时使用含2% FBS的α-MEM培养基培养5~7 d，直至L6成肌细胞分化到多核肌管细胞.

1.2.3 L6细胞葡萄糖摄取实验

将L6细胞接种于96孔板中，每个实验组设置8个复孔，同时设置空白对照组，阳性对照组和药物组. 待细胞汇合到80%左右后，换成分化培养基分化5~7 d. 然后用不含血清的α-MEM培养基饥饿2 h，再分别加入100 μL无血清α-MEM基础培养基、DMSO、100 nM胰岛素（insulin）和3个浓度梯度药物组后，放入37 ℃，5% CO₂的培养箱中30 min，从原96孔板中对应取2 μL上清液加入到新板中，并另取一排加入2 μL葡萄糖标准液，再在每孔中加入200 μL葡萄糖氧化酶试剂，60 min内于505 nm处测吸光值. A=每个样品吸光度平均值 × 5.56/标准蛋白吸光度平均值，最后由空白对照组减去每一组的A值得到差值，再将得到的DMSO组的差值归一，所有组差值除以DMSO组即得到葡萄糖摄取的倍数.

1.2.4 免疫荧光实验

将myc-GLUT4-mOrange L6细胞接种到圆玻片上，待细胞密度适度后换用分化培养基分化5~7 d. 在无血清α-MEM培养基饥饿细胞2 h后用药物处理30 min，3%的多聚甲醛于摇床上固定爬片上细胞，然后用50 mmol/L甘氨酸孵育20 min以去除背景，再用含2% BSA的PBS封闭1 h. 之后在爬片上滴加anti-myc的一抗（1∶200稀释），湿盒中孵育1 h. 然后用2% BSA的PBS清洗5 min，重复3次. 接着再在爬片上滴加anti-mouse-FITC二抗（1∶200稀释），湿盒内避光1 h. 最后用2% BSA的PBS清洗爬片5 min，重复3次；PBS清洗5 min，重复2次.激光共聚焦显微镜观察细胞中FITC绿色荧光的响应反应GLUT4与膜融合的情况， ZEN软件分析.

1.2.5 总蛋白质的提取以及蛋白免疫印迹

将分化完成的L6细胞用无血清α-MEM基础培养基饥饿2 h后分别加入阳性对照和不同浓度的药物作用30 min. 之后置于冰上，弃去培养基. PBS洗涤细胞，每皿加入含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液100 μL，细胞收集于1.5 mL EP管中，全部操作必须保持在冰上完成. 用冷冻离心机于4 ℃，12000 r/min的条件下离心15 min，取上清液即为细胞总蛋白. 参考蛋白浓度测定试剂盒对样品进行蛋白浓度测定，并依据吸光值计算样品的蛋白浓度. 根据所得的蛋白浓度及体积，加入对应体积的5 × SDS-PAGE loading buffer，振荡后置于95 ℃金属加热器上变性10 min，-20 ℃保存备用.

根据试剂盒说明制备10% SDS-PAGE凝胶，120 V电泳. 后将凝胶放于加有转膜液的转膜槽中，以恒流300 mA的条件转膜90 min. 转完膜后，用1 ×TBST（含有0.1%吐温20的TBS）配制成5%的脱脂奶粉溶液封闭NC膜2 h. 孵育一抗，将一抗和1 ×TBST缓冲液按1∶1000的比例配制稀释，4 ℃摇床孵育过夜. 第二天用1 × TBST缓冲液于摇床上洗膜10 min，重复3次. 孵育二抗，室温下，将二抗和1 ×TBST缓冲液按1∶10000的比例稀释，摇床孵育约1 h之后用1 × TBST缓冲液于摇床洗膜10 min，重复3次.显影，使用化学凝胶成像系统进行化学发光检测. 使用Image Lab软件对条带进行统计分析.

1.2.6 统计学处理

所有数据都显示为平均值±标准偏差（mean±SEM）. GraphPadPrism 7.0软件进行统计分析. ns为P> 0.05表明没有显著性差异， *为P<0.05表明有显著性差异，**为P<0.01表明具有较大的显著性差异，***为P<0.001表明具有很强的显著性差异，****为P<0.0001表明具有极强的显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 OLEE处理加强了L6细胞对葡萄糖的摄取

分别使用100 nM的胰岛素以及50、75、100 μg/mL的长叶格脉树乙醇提取部位（OLEE）处理L6细胞后，葡萄糖摄取结果显示（图1），胰岛素处理组L6细胞葡萄糖摄取能力是空白对照组的2.45倍，50、75、100 μg/mL OLEE处理组的葡萄糖摄取能力分别是空白是对照组的1.17、1.50、1.63倍. 可见长叶格脉树乙醇提取部位具有一定促进L6细胞葡萄糖摄取能力，并呈浓度梯度递增.

2.2 OLEE促进 L6细胞中GLUT4与质膜的融合

结果如图2（a）所示，50 μg/mL OLEE和100 nM 胰岛素处理后，L6细胞质膜的FITC绿色荧光信号显著增强，均能促进L6细胞中GLUT4与质膜的融合，通过公式质膜融合率 = FITC绿色荧光细胞数/mOrange红色荧光细胞数，计算得到统计图2（b），各组GLUT4与细胞质膜融合率分别为17.5%（Control）、70.5%（Insulin）、48.4%（OLEE）. 可见，OLEE具有促进L6细胞中的GLUT4与质膜融合的效果.

2.3 OLEE促进L6细胞GLUT4的表达

经过GLUT4抗体孵育后结果如图3（a）所示，与阴性对照组相比，细胞经100 nM 胰岛素处理后，显著促进了GLUT4蛋白的表达，且OLEE在50 μg/mL的浓度时也同样促进了GLUT4表达. 图3（b）也直接证明了OLEE在50 μg/mL浓度时是空白对照组GLUT4蛋白表达量的1.23倍，具有一定促进GLUT4表达的能力，但是随着剂量的增加GLUT4的表达量随之降低.

2.4 OLEE不激活Akt信号通路的磷酸化

胰岛素作为Akt通路的阳性对照^［12］. 经Akt与p-Akt抗体孵育后（图4（a）），不同浓度的OLEE处理细胞后，Akt信号通路的磷酸化均未发生明显变化，且图4（b）统计图也表明了OLEE的刺激下Akt信号通路的表达与空白对照组相比均没有显著性差异.

2.5 OLEE能够促进AMPK信号通路的磷酸化

在OLEE与AMPK信号通路研究中，用100 μg/mL 二甲双胍（metformin）作为阳性对照^［13］，经AMPK与p-AMPK抗体孵育后，不同浓度的OLEE处理后均能促进AMPK信号通路的磷酸化（图5（a）），且不同浓度的OLEE组蛋白表达量分别是空白对照组的2.21倍（50 μg/mL），2.40倍（75 μg/mL），1.99倍（100 μg/mL）（图5（b）），都显著增加了AMPK信号通路的磷酸化.

2.6 OLEE能够促进PKC信号通路的磷酸化

PKC信号通路也与GLUT4的表达也密切相关，200 nM浓度的PMA作为PKC信号通路的阳性对照^［14］，p-PKC抗体孵育后（图6（a）），经过阳性药PMA与不同浓度的OLEE刺激后，其PKC信号通路的蛋白表达相比于空白对照组都有所增加，图6（b）证明OLEE组有显著增加蛋白表达量的趋势，分别是空白对照组的1.68倍（50 μg/mL）、1.80倍（75 μg/mL）以及1.96倍（100 μg/mL），且呈浓度梯度递增.

3 结语

T2DM的主要特征之一为胰岛素抵抗（IR），表现为组织或细胞对生理浓度的胰岛素的生物反应性不敏感或无反应，进而导致骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的利用紊乱. IR主要病理之一是脂肪细胞和骨骼肌细胞内胰岛素信号通路受损致葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）出现转位障碍^［15］. 胰岛素可通过促进GLUT4从细胞内部重新分配到质膜，增加肌肉和脂肪细胞对葡萄糖的摄取，而在小鼠中通过操纵GLUT4或GLUT4调节分子的表达来调控葡萄糖摄取对全身代谢的影响^［16］. 赵平等^［17］也证实了GLUT4对于葡萄糖转运在机体糖代谢中占有重要的地位.

前期研究表明OLEE具有促进L6细胞葡萄糖摄取能力，但有关它们促进糖摄取和糖代谢的潜在作用机理不明确. 本研究选用L6大鼠骨骼肌细胞作为研究材料，以GLUT4为靶点，研究OLEE在体外水平促进葡萄糖摄取的机理，结果表明OLEE具有改善L6细胞葡萄糖摄取的能力. 为了证明OLEE能促使L6细胞GLUT4与质膜融合从而促进葡萄糖摄取，选用带有myc标签的myc-GLUT4-mOrange的L6细胞，在激光共聚焦显微镜下观察到L6细胞经过insulin与OLEE刺激后显著促进细胞中FITC绿色荧光的强度，证明OLEE能够促进L6细胞中GLUT4与细胞质膜融合. Western blot实验表明OLEE对GLUT4三种相关通路Akt、AMPK、PKC磷酸化的影响，结果显示OLEE均能促进L6细胞中AMPK和PKC的磷酸化. 以上结果与文献［18］结果几乎一致，都是通过激活下游的AMPK和PKC信号通路来促进GLUT4的表达从而达到降糖的效果. 由于未通过反向实验使用AMPK通路抑制剂Compound C和PKC通路抑制剂Gö6983来验证OLEE是否特异性通过AMPK和PKC两种信号通路来促进GLUT4蛋白表达，继而深究OLEE的降糖作用是否跟脂质代谢或其他因素相关. 因此，初步认为OLEE主要通过AMPK和PKC两种信号通路来促进GLUT4的表达，且是通过激活其下游AMPK与PKC信号通路来起作用的.后期将进一步补充体内实验，来证明OLEE在动物水平上也具有改善糖尿病的作用.

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基金资助

上海合作组织科技伙伴计划及国际科技合作计划项目(2022E01010)

湖北省自然科学基金资助项目(2023AFC011)