小鼠S100A9蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达及生物学活性分析

Expression and biological activity analysis of recombinant mouse S100A9 in Bacillus subtilis

摘要

钙结合蛋白S100A9与细胞炎症应答及肿瘤生长等密切相关，但对其生物学功能还不十分清楚.本研究构建了小鼠S100A9基因的枯草芽孢杆菌诱导表达载体， 以期获得具有生物活性的S100A9蛋白并探讨其功能.采用无缝克隆将小鼠S100A9基因编码区序列克隆至pHT43载体的Pgrac启动子区，并将重组载体pHT43-S100A9转化至芽孢杆菌WB800N菌株，经IPTG诱导S100A9蛋白表达.通过LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型检测了重组蛋白S100A9对炎症应答的调控作用. Western Blot证实了S100A9重组蛋白分泌表达，且在0.2 mmol/L的IPTG、30 ℃的发酵条件下其表达水平最佳. ELISA检测表明S100A9重组蛋白分泌表达量达到了15.47 ng/mL. 分别利用含有1.54、3.09、6.59 ng/mL三种不同浓度S100A9重组蛋白的发酵液上清作用于LPS诱导的RAW264.7细胞，与空载组比较，1.54 ng/mL的S100A9重组蛋白能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞促炎因子TNF-α及IL-6等的表达（P<0.05）.

Abstract

Calcium-binding protein S100A9 was associated with inflammatory response and growth of tumors， and the underlying functions remains further defined. To gain recombinant S100A9 protein with biological activity and explore its function， the mouse S100A9 coding sequence was amplified by PCR and cloned into the expression vector of pHT43 and fusion with Pgrac promoter. The recombinant plasmid pHT43-S100A9 was transferred to Bacillus subtilis WB800N and induced expression with IPTG. The expressed products were identified by Western Blot； the biological activity of recombined products were analyzed using LPS stimulated RAW264.7 cell. The recombinant bacteria WB800N/ pHT43-S100A9 was induced expression by IPTG. The optimized induction temperature was 30 ℃ with 0.2 mmol/L IPTG， and the secretory expression level of S100A9 is up to 15.47 ng/mL. To further analyzed the function of recombined protein， the LPS stimulated RAW264.7 cell was treated by the culture supernatants of the recombined Bacillus subtili with different concentration recombiner S100A9 protein （1.54， 3.09， 6.59 ng/mL）， and the results showed that the pro-inflammatory factors， including TNF-α and IL-6 were significantly inhibited comparing with the empty vector group.

Graphical abstract

关键词

S100A9蛋白 / 枯草芽孢杆菌 / 异源表达 / RAW264.7细胞 / 炎症因子

Key words

protein S100A9 / Bacillus subtilis / heterologous expression / RAW264.7 cell / inflammatory factor

S100A9 （S100 calcium binding protein A9）又名骨髓相关蛋白14（Myeloid-related protein 14， MRP14），是S100钙结合蛋白家族中重要的成员，主要在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达^［1］，在调控细胞免疫应答和疾病炎症中发挥重要作用. 研究表明S100A9在肠炎、类风湿关节炎、哮喘等炎症性疾病中的表达被显著上调^［2］. 来源于肥胖病人血液的巨噬细胞高表达S100A9且M₂巨噬细胞的分化被抑制，并导致炎症的持续及组织修复的受损^［3］. 截止目前，诸多炎症疾病临床主要采用抗炎和抗过敏药物治疗，但部分西药的副作用较大，病情易反复^［4］. 而重组S100A9蛋白的治疗性使用能抑制糖尿病小鼠的生糖作用并改善高血糖症，在抑制糖尿病及相关炎症发生中发挥重要的作用^［5］. 对呼吸系统疾病研究也表明在烟草赤星病菌引起的小鼠哮喘中S100A9蛋白通过调节适应性免疫应答防止Th2介导的小鼠过敏性气道炎症的发生^［6］；在OVA激发的大鼠哮喘中，外源S100A9蛋白能降低大鼠气道阻力，对哮喘发挥保护作用^［7］. 体外细胞实验也表明在巨噬细胞中过表达S100A9能导致细胞外活性氧（ROS）增强，并显著上调抗炎因子IL-10的表达^［8］.

有研究表明细胞内源性S100A9蛋白表达具有促进机体炎症发生和抑制组织损伤的修复，在机体免疫稳态调控中发挥作用^［9］，而外源性S100A9重组蛋白使用则能抑制细胞炎症的发生，但高效获得具有生物活性的S100A9重组蛋白是有待进一步解决的问题. 枯草芽孢杆菌是广泛使用的益生菌，具有耐热、抗干燥、便于存储等优点^［10］. 同时，枯草芽孢杆菌还具有较强的蛋白表达系统和胞外蛋白分泌能力，目前常被用作异源重组蛋白分泌生产的优势工程菌^［11-12］.本研究以枯草芽孢杆菌8种胞外酶缺失株Bacillus subtilis WB800N作为S100A9蛋白的异源表达宿主，利用过表达载体pHT43构建了一个稳定的枯草芽孢杆菌表达系统，并利用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症应答模型对其生物活性进行了初步分析，以期为获得高生物活性S100A9重组蛋白和开发具有免疫调节功能的S100A9基因工程菌提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 菌株、载体与细胞

大肠埃希氏杆菌感受态细胞DH5α购于武汉擎科；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800N与载体pHT43由华中农业大学农业微生物国家重点实验室张安定教授课题组馈赠；RAW264.7细胞为本实验室冻存细胞株.

1.2 主要试剂

限制性内切酶BamH 1（宝日医）；同源重组酶（擎科生物）；Taq DNA聚合酶（博迈德生物科技）； 2 × Hieff Canace^® Gold PCR Master Mix（上海翊圣）；DNA纯化回收试剂盒（南京诺唯赞）；质粒提取试剂盒（康为世纪）；0.22 μm滤膜、IPTG及2XYT培养基（碧云天）；TRIzo RNA提取试剂盒、逆转录cDNA合成试剂盒、蛋白Marker（上海翊圣）、DMEM基础培养基和磷酸缓冲液（美国Thermo Scientific）；胎牛血清（德国PAN-Biotech）；青霉素-链霉素双抗（北京索莱宝）；Escherichia coli 055：B5来源的脂多糖LPS（lipopolysaccharides，美国Sigma）；qRT-PCR SYBR Green Mix（上海翊圣）；兔源P-NF-κB（武汉爱博泰克）、兔源NF-κB和β-actin抗体（美国Cell Signaling Technology）；山羊抗兔IgG二抗和RIPA（强）裂解液（康为世纪）；SDS-PAGE快速凝胶试剂盒（碧云天）；小鼠S100钙结合蛋白A9（S100A9）ELISA试剂盒（酶联生物科技）.

1.3 重组质粒的构建

PrimerPrimer5.0软件设计小鼠S100A9基因cDNA全长序列（GenBank ID：NM_001281852.1）的引物. 在正向引物5'端添加pHT43载体含BamH Ⅰ酶切位点的上游同源臂序列AAAACATCAGCCGTAG GATCC，正向引物序列如下：5'-AAAACATCAGCC GTAGGATCCATGGCCAACAAAGCACCTTC-3'‍；在反向引物的5'端添加pHT43载体含BamH Ⅰ酶切位点的下游同源臂序列GACGTCGACTCTAGAGGA TCC，反向引物如下：5'-GACGTCGACTCTAGAGGA TCCTTACTTCCCACAGCCTTTGC-3'.扩增片断全长为384 bp. 提取小鼠脾脏组织总RNA反转录后获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR. PCR反应体系为：cDNA 5 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，高保真酶25 μL，ddH₂O 15 μL. PCR反应程序：98 ℃，5 min；98 ℃，10 s，72 ℃，30 s，72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃ 5 min. 反应结束后，PCR产物用胶回收试剂盒回收备用. 利用BamH Ⅰ单酶切pHT43载体，电泳后试剂盒回收. 随后按无缝克隆试剂盒说明书进行同源重组反应，体系为：含同源臂及S100A9基因CDS序列的PCR产物1.8 μL，线性化pHT43载体1.4 μL，同源重组酶5 μL，ddH₂O 1.8 μL，50 ℃反应15 min. 重组产物10 μL转化至感受态DH5α中，37 ℃摇菌培养1 h后，涂布于含氨苄的LB固体培养基过夜培养，挑取单菌落接种于含氨苄的液体LB培养基，37 ℃液体LB培养基摇菌培养12 h，PCR验证后，阳性菌提取重组质粒命名为pHT43-S100A9，并送至武汉擎科进行测序验证.

1.4 重组质粒转化Bacillus subtilis WB800N及诱导表达

将重组质粒pHT43-S100A9通过化学法转化至Bacillus subtilis WB800N感受态，构建重组菌株WB800N/pHT43-S100A9，并通过菌液PCR进行菌落鉴定. 将重组菌株WB800N/pHT43-S100A9和空载对照WB800N/pHT43分别接种到5 mL含氯霉素的LB培养基，37 ℃、220 r/min培养过夜后，按1∶100比例接种于培养基中扩大培养至OD₆₀₀值为0.4~0.5时，加入0.2 mmol/L IPTG分别在26、28、30、37 ℃时进行蛋白诱导表达. 分别取诱导发酵后的离心上清液和菌体沉淀，菌体通过超声破膜后离心进一步收集上清液和沉淀. 对收集的蛋白样品通过SDS-PAGE以及Western Blot分析其表达情况.

1.5 重组WB800N/pHT43-S100A9菌株DMEM上清液的制备

按1.4的培养方法过夜培养重组菌株及对照空载菌株后离心获得菌体（20 mL 2XYT液体培养基），PBS漂洗3遍. 收集的菌体用等体积的DMEM细胞培养基重悬后，加入0.2 mmol/L的IPTG，30 ℃、220 r/min诱导至OD₆₀₀值为0.8时（约4 h）停止. 离心收集上清液，调节pH值至7.0，用0.22 μm的滤膜过滤收集滤液. 对经离心得到的发酵液用DMEM细胞培养基进行倍比稀释，将其依次进行2.5、5、10倍稀释.经ELISA试剂盒测得发酵液原液中的重组蛋白S100A9含量达到15.47 ng/mL，经倍比稀释后的测得浓度依次为6.59、3.09、1.54 ng/mL. 枯草芽孢杆菌空载菌株离心得到的发酵液上清同重组菌株一样进行2.5、5、10倍稀释，处理与重组菌株保持一致.

1.6 QPCR检测重组蛋白对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症应答基因表达的影响

取对数生长期的细胞，以3 × 10⁵个/mL的密度接种于6孔板，分别设正常对照组（Control）、LPS阳性对照组和重组菌上清液低、中、高浓度处理组及空载对照菌上清液低、中、高浓度处理组. 待细胞贴壁后，处理组分别加入100 ng/mL LPS预处理3 h后，添加不同浓度的上清液预处理21 h后收集细胞. 其中，正常对照组不添加LPS，用同体积的DMEM代替，LPS各组均加入DMEM至等体积的DMEM. 分组依次命名为：Control组、LPS组、pHT43-L组、pHT43-M组、pHT43-H组、pHT43-S100A9-L组、pHT43-S100A9-M组和pHT43-S100A9-H组.

Trizol法提取各组细胞总RNA，并合成cDNA. 以β-actin为内参，使用qPCR SYBR Green试剂，通过相对定量方法检测低中高重组菌株上清液对RAW264.7细胞β-actin 、IL-6、TNF-α、IL-12 、IL-10和iNOS等基因表达的影响.用到的引物见表1.

１.7 数据统计分析

SPSS18.0软件进行统计分析，结果用 “平均值±标准差（\overline{X}\pm S）”表示，两组间差异显著性检验采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析. 所有的试验至少重复3次，P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 S100A9目的片断的扩增与pHT43-S100A9重组表达载体的构建与鉴定

以小鼠脾脏总RNA反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，产物回收纯化后获得大小为384 bp的片段（图1（a））. 将回收的PCR产物及单酶切线性化的pHT43质粒利用无缝克隆试剂盒进行连接并转化DH5α感受态，挑取单菌落过夜培养后，经菌液PCR检测，可见一384 bp的目的片段（图1（b））. 对菌液PCR鉴定为阳性的克隆提取重组质粒，经BamH 1单酶切鉴定，可见一384 bp的目的片段（图1（c））. 将阳性质粒进行测序分析，发现pHT43插入大小为384 bp片段，与GenBank中小鼠S100A9基因编码区进行序列比对，序列同一性为100%，表明重组质粒pHT43-S100A9构建成功.

2.2 重组蛋白S100A9诱导表达与表达条件优化

对S100A9重组芽孢杆菌的表达产物发酵上清液、芽胞杆菌细胞破膜上清及沉淀的Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示，相较于空载对照组，重组菌株WB800N/pHT43-S100A9在13 kDa大小附近有一条特异的蛋白条带. 进一步对其诱导表达条件进行优化，图2和图3的电泳结果表明：在0.2 mmol/L的IPTG诱导及26、28、30、37 ℃不同温度条件进行蛋白含量比较，在0.2 mmol/L的IPTG诱导及30 ℃的发酵条件下，重组蛋白的表达量最高. 进一步通过小鼠S100A9蛋白 ELISA检测试剂盒检测发酵液上清中分泌表达的S100A9的浓度. 结果表明，表达产物上清中S100A9浓度最高可达15.47 ng/mL. 同时，参考相关文献报道，本研究分别选择了1.54 ng/mL、3.09 ng/mL、6.59 ng/mL作为后续在细胞水平检测重组蛋白生物活性的剂量作为重组蛋白低、中、高剂量处理组.

2.3 Western Blot鉴定重组菌S100A9蛋白的表达

以重组空载芽孢杆菌为对照，检测重组蛋白S100A9表达. 结果表明，阳性重组菌株发酵液上清、菌体破膜上清及破膜沉淀蛋白均与S100A9抗体发生了特异性结合，显示S100A9蛋白在枯草孢杆菌中实现了表达，且在胞内表达最多（图4）.

2.4 S100A9重组蛋白对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响

为初步阐明S100A9重组蛋白表达及对细胞功能的调控作用，进一步制备了重组菌培养物上清，并探讨了其不同浓度添加对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症应答的影响. 结果表明：与正常对照组细胞相比，LPS可以显著增强IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS等基因mRNA的表达（P<0.05）并抑制相关抑炎基因IL-10基因mRNA的表达（P<0.05）；与LPS处理组相比，添加低浓度重组菌株培养物上清，能显著抑制IL-6、IL-12、TNF-α、iNOS等促炎相关基因mRNA的表达（P<0.05），并显著上调IL-10等抑炎基因 mRNA的水平（P<0.05）（图5）.

2.5 S100A9重组蛋白对LPS诱导的NF-κB通路影响

为进一步证明添加低浓度S100A9重组蛋白表达产物能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症，利用RT-QPCR、Western Blot方法检测了其对NF-κB信号通路的影响，结果如图6所示. 结果显示LPS刺激能显著提高p65磷酸化水平，而添加低剂量的S100A9重组蛋白表达产物能显著抑制LPS诱导的NF-κB通路.

3 讨论

S100A9蛋白广泛参与调控炎症反应^［13］. 研究表明，S100A9蛋白存在抗炎与促炎的双重作用，S100A9蛋白在局部炎症组织中表达增加能激活相应的炎症应答，并促进炎症发生；而低剂量外源S100A9蛋白的干预则能抑制炎症发生^［9］. 近年，有研究指出S100A9蛋白参与多种肿瘤的发生，是潜在的肿瘤标志物之一^［14］. 对S100A9蛋白调控机体免疫应答机制的研究表明S100A9蛋白可通过调节促炎介质的产生发挥炎症调控作用^［15］；同时，S100A9蛋白还能通过调控巨噬细胞的增殖和凋亡等过程抑制巨噬细胞的促炎活化^［16］. 因此，S100A9重组蛋白在调控机体免疫稳态和肿瘤标志物的检测等方面具有潜在应用价值. 但如何高效获取具有生物活性的S100A9重组蛋白，是以S100A9为靶点的炎症疾病治疗首要解决的问题. 本实验成功将小鼠S100A9基因在枯草芽孢杆菌WB800N中表达，且蛋白免疫印迹实验表明表达的重组蛋白具有反应原性；进一步将重组表达产物作用于LPS诱导的巨噬细胞炎症应答，发现S100A9蛋白能显著抑制炎症相关基因表达和NF-κB蛋白磷酸化水平，这为研究利用枯草芽孢杆菌表达体系高效获得具有生物活性的S100A9重组蛋白及基于S100A9为靶点的炎症疾病治疗奠定了研究基础.

枯草芽孢杆菌是一个具有能将外源蛋白产物分泌到胞外、不含内毒素、没有明显的密码子偏好性等突出优点的外源蛋白表达系统^［17］. 选择具有高表达活性的启动子是实现外源蛋白表达的关键，本研究选用具有高拷贝及诱导型表达的Pgrac启动子为目的基因S100A9的表达启动子，构建了小鼠S100A9基因的重组表达质粒，并实现了其在枯草芽孢杆菌WB800N中的诱导型分泌表达，且分泌表达量最高可达15.47 ng/mL.

维持重组蛋白的生物学活性是将其应用于疾病治疗或诊断的前提，研究结果显示重组蛋白S100A9处理巨噬细胞后，促炎相关因子的表达受到显著抑制，这表明重组蛋白在细胞炎症应答调控中发挥了重要的作用，这也与有关外源S100A9蛋白对炎症应答调控效应的报道一致^［18］.

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(31371307)

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(CZZ21005)