机器学习联合分子对接分析左归丸治疗肝癌作用机制

Machine learning algorithm combined with molecular docking to analyze the mechanism of Zuogui pills in the treatment of liver cancer

摘要

基于复杂网络及网络药理学方法揭示左归丸治疗肝癌的分子作用机制.通过TCMSP平台获取左归丸的活性成分及对应靶点，联合Louvain算法与CPM算法挖掘核心功能模块，利用肝癌差异表达基因筛选核心靶点，通过GO/KEGG富集分析和分子对接技术进一步验证.筛选得到左归丸潜在作用靶点345个，通过多阶段聚类算法，检测出5个PPI核心模块，筛选出CYP2E1、PPARG、MMP2、CASP8等19个核心靶点；GO富集分析显示，核心模块靶点主要富集在钾离子跨膜转运、乙醇氧化、基因表达的负调控及有丝分裂细胞周期G2/M转换等生物学过程；KEGG富集分析显示，核心靶点主要富集在酒精性肝病、TNF、P53、PI3K-Akt、AMPK等信号通路；分子对接结果显示，MMP2与β-谷甾醇的结合能最小，CASP8、CYP2E1、PPARG均与芝麻素的结合能最小. 进一步生存分析结果表明，PPARG、CYP2E1和CASP8的不同差异表达是肝癌预后影响因素. 结论 左归丸通过多成分、多通路、多靶点调控“肝再生”，有利于促进肝细胞修复与再生，减少肝组织损伤.

Abstract

Aimed to reveal the mechanism of Zuogui Pill in the treatment of liver cancer based on complex network and network pharmacology approaches； The active ingredients and corresponding targets of Zuogui Pills were obtained from TCMSP platform， the key functional modules were mined by the Louvain and CPM algorithms， and the core targets were screened by differentially expressed genes in liver cancer， and GO/KEGG enrichment analysis and molecular docking technology were used for further validation. A total of 345 potential targets of Zuogui Pill were screened， and 5 core modules were detected by the multi-stage clustering algorithm， 19 nodes from which were identified as key targets， such as CYP2E1， PPARG， MMP2， and CASP8. Results of GO enrichment analysis showed that the core modules were mainly enriched in biological processes like potassium ion transmembrane transport， ethanol oxidation， negative regulation of gene expression， and mitotic cell cycle G2/M transition. Based on the results of KEGG enrichment analysis， the key modules were mainly related to alcoholic liver disease， TNF， P53， PI3K-Akt and AMPK signaling pathways. The results of molecular docking showed that MMP2 had the smallest binding energy with β‍-sitosterol， and CASP8， CYP2E1， and PPARG respectively had the smallest one with Sesamin. Further survival analysis indicates that the differential expression of PPARG， CYP2E1， and CASP8 are prognostic factors influencing liver cancer outcomes. Conclusion Zuogui Pill regulated "liver regeneration" through multiple components， multiple pathways， and multiple targets， which was beneficial to promote the repair and regeneration of liver cells and reduce liver tissue damage.

Graphical abstract

关键词

肝癌 / 左归丸 / 多靶点 / 聚类算法 / 生物信息学

Key words

liver cancer / Zuogui Pill / multi-target / clustering algorithm / bioinformatics

肝癌是消化系统高发恶性肿瘤， 中医认为，肝气郁结，肝郁化火，痰浊凝结，瘀血阻络所致. 中医药疗法常以多味中药组成复方，遵循标本兼治的“整体观”原则，充分发挥有效成分间协同作用的整体调控效应^［1］. 左归丸出自《景岳全书》，是明代医家张景岳根据阴阳互根原理拟定的补肾方药，主要由熟地黄、枸杞子、山茱萸、菟丝子等中药组成，具有滋补肾阴，益精填髓的功效. 有人^［2］提出了“补肾生髓成肝”的治疗法则，并通过实验已验证左归丸能够促进骨髓干细胞转化肝细胞，参与肝组织再生修复，为左归丸治疗肝癌的临床推广提供了科学基础.

随着复杂网络方法在中医药网络药理学领域的深入应用，常用经典聚类算法划分生物学功能相近或相似的网络模块，以发现潜在的多个作用靶点^［3-4］. 本研究通过构建左归丸潜在靶点的PPI（Protein-Protein Interaction）网络，应用多阶段聚类算法检测潜在功能模块，结合生物学信息挖掘核心作用靶点，为进一步阐述左归丸多靶点、多通路协同作用调控“肝再生”的作用机制提供实验基础.

1 材料与方法

1.1 左归丸有效成分-靶点

中药活性成分查询源于TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）和药物相似性（DL）值作为筛选活性成分的标准，选择OB≥30%和DL≥0.18的活性成分. 通过活性成分查询对应蛋白质靶点，利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）将靶点名称转换为预测蛋白质库中的Swiss-Prot标识符.

1.2 PPI网络构建

将靶点导入STRING数据库平台（https：//string-db.org/），选择物种“Homo Sapiens”，获取靶点相互作用数据，将数据导入Cytoscape3.9.1构建左归丸靶点PPI网络，每个靶点视为网络节点，靶点间相互作用用边表示.

1.3 多阶段聚类算法

本研究主要基于Louvain与CPM（Clique Percolation Method）聚类算法，挖掘核心功能模块及潜在核心靶点，技术路线见图1. Louvain^［5］是基于层次聚类和模块度优化算法，CPM算法^［6］是基于K-Clique概念提出的社区检测算法. 第一阶段利用Louvain算法对PPI网络进行模块检测，将每个网络节点视为一个社区，将节点i划分到邻接节点所在社区，并计算模块度增量ΔQ. 若maxΔQ>0，则将节点i分配到△Q变化最大的邻接节点所在社区，否则保持不变. 遍历全部节点，直到节点所属社区不再发生改变. 不断迭代合并社区，当整个图的模块度不再变化时，输出第一阶段聚类结果. 其中，节点数量最多的前5个模块进入第二阶段. 第二阶段利用CPM算法进一步挖掘核心模块，在网络中挖掘K-Clique子图，迭代比较两个K-Clique，若共享K-1个节点则合并为一个社区，直到无法合并则停止，各个网络中K值最大团联合组成核心模块.

1.4 核心靶点筛选

GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检索肝癌基因表达数据，物种设置为“Homo sapiens”. 利用RStudio软件中limma包分析差异表达数据，获得肝癌差异表达基因. 当P≤0.05且|log2（Fold Change）|>1则认为存在显著性差异. 比较肝癌与左归丸靶点，对重叠靶点进行差异表达分析. 将肝癌差异表达基因与左归丸潜在核心靶点进行映射分析，重叠靶点视为左归丸治疗肝癌核心靶点.

1.5 结果验证

1.5.1 GO/KEGG富集分析

利用DAVID平台（https：//david.ncifcrf.gov/）对核心模块靶点进行GO和KEGG富集分析，设定P≤0.05有统计学意义. 筛选GO富集各生物学过程前10条目，前20条KEGG富集通路进行可视化.

1.5.2 分子对接技术

将核心靶点按介度中心性（BC）^［7-8］降序排序，利用AutoDock Vina软件对左归丸的核心靶点进行验证. Protein Database Bank （https：//www.rcsb.org//）数据库下载核心靶点蛋白结构. 在TCMSP数据库下载核心靶点对应活性成分三维结构，将检索结果导入AutoDock软件. 靶蛋白作为受体并去水分子添加非极性氢，活性成分作为配体，设置Gridbox坐标及大小，计算小分子与配体之间的结合自由能.

1.5.3 生存分析

为进一步验证核心靶点，本研究基于Kaplan-Meier Plotter数据库 （http：//kmplot.com/analysis/）进行生存分析，评估关键靶点表达水平与患者总体生存率之间的关系，并绘制Kaplan-Meier生存曲线. 设定P≤0.05具有统计学意义.

2 结果

2.1 左归丸活性成分-靶点筛选

TCMSP数据库检索左归丸活性成分，其中熟地黄2种、菟丝子11种、川牛膝4种、山药16种、山茱萸20种、枸杞子45种，去重后得到65种活性成分，主要活性成分有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、δ-胡萝卜素、芝麻素、苦参碱. 通过Uniprot数据库检索对应靶点名称，剔除重复靶点得到345个潜在作用靶点.

2.2 PPI网络拓扑结构

左归丸PPI网络图有345个靶点和5732条边，节点平均度值33.229，最大度值为161，5个节点的度值仅为1. 网络密度为0.097，网络中心性为0.374.

2.3 核心模块检测

第一阶段利用Louvain算法对PPI网络图进行模块检测，共得到14个模块，最大模块共包含95个靶点，聚类系数为0.499，节点平均接近中心性为0.456. 根据包含的靶点数排名，前5个模块进入第二阶段（靶点数目均≥20）. 第二阶段利用CPM算法挖掘模块中3-clique子图，并过滤出K值最大团（Maximal Clique）. 各类模块MC联合组成5个核心模块. 各核心模块的中心性指标均显著提升，如核心模块1的聚类系数为0.932，网络密集度为0.962，节点平均接近中心性为0.966，其他见表1. 包含5个核心模块的PPI网络如图2所示.

2.4 左归丸治疗肝癌核心靶点

在GEO数据库中检索肝癌基因表达数据集，将GSE124535芯片与345个左归丸药物靶点映射分析，对重叠靶点分析差异表达基因，获得47个DEGs（Differential Expression Genes），其中上调基因27个，下调基因20个. 对比以上5个核心模块包含的76个靶点，共获得19个重复靶点，即为左归丸治疗肝癌的核心靶点，见图3. 按BC值大小降序排序，前四位分别是PPARG、CYP2E1、MMP2、CASP8.

2.5 GO/KEGG富集分析

对核心模块靶点进行GO富集分析结果显示（图4），核心模块靶点富集在不同功能. 模块1全部靶点均富集在钾离子跨膜转运（GO：0071805）与调节离子跨膜转运（GO：0034765）方面. 模块2中超过70%的靶点富集在乙醇氧化（GO：0006069）和酒精代谢过程（GO：0006066）方面. 模块3中主要富集在基因表达的负调控（GO：0010629），模块4、模块5中靶点主要富集在有丝分裂细胞周期G2/M转换（GO：0000086），对乙醇的反应（GO：0045471）等方面.

KEGG通路富集共得到105条信号通路，其中100条信号通路具有统计学意义（P<0.05）. 根据富集的靶点数量大小降序排列，前20位的信号通路见图5. 核心靶点富集的信号通路主要有癌症信号通路（hsa04115）、酒精性肝病（hsa04936）、肝细胞癌信号通路（hsa05225）. 此外，p53（hsa04115）、PI3K-Akt（hsa04151）、AMPK（hsa04152）及TNF（hsa04668）等信号通路均有多个核心靶点富集，如CASP8、CCNB1等核心靶点参与p53信号通路，红色靶点为左归丸治疗肝癌的核心靶点，如图6所示.

2.6 分子对接验证

选排名前4的核心靶点PPARG（PDB ID： 6ms7）、CYP2E1（PDB ID： 3e6i）、MMP2（PDB ID： 4wk7）、CASP8（PDB ID： 4jj7）作为受体，以左归丸活性成分为配体进行分子对接. 结果显示4个核心靶点与槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、δ-胡萝卜素、芝麻素、苦参碱均有较强的亲和力（结合能小于0），其中MMP2与β-谷甾醇的结合能最小，CASP8、CYP2E1、PPARG与芝麻素结合能最小（图7，表2）.

2.7 靶点表达水平对患者生存率的影响

结合生存分析，分析核心靶点PPARG、MMP2、CYP2E1和CASP8对患者总体生存率的影响， 3个关键靶点PPARG、CYP2E1和CASP8的差异表达均具有统计学意义（P<0.05），其中PPARG、CASP8低表达，CYP2E1高表达是患者预后有利因素（图8）.

3 讨论

左归丸治疗肝癌遵从“从肾论治”法则，在生殖系统疾病及骨科疾病的治疗中有着广泛应用. 左归丸可促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化^［9］，在肝再生过程中具有维持平衡的双向调节作用. 中医辨证论治的整体观与网络药理学的系统观契合，基于网络药理学和复杂网络算法挖掘中医药治疗疾病的关键作用靶点和生物学通路^［10］，有利于进一步阐述中医药治疗复杂疾病的分子作用机制. 本研究提出的Louvain-CPM联合算法，充分利用Louvain算法模块度最优的方式划分模块，结合CPM算法过滤出最具中心性的核心模块. 此外，本研究利用肝癌差异表达基因进一步筛选左归丸核心靶点，充分体现了药物-靶点-疾病的相互作用机制，为左归丸治疗肝癌的临床应用提供了科学依据.

GO富集分析结果显示，5个核心模块内部富集了显著的功能相似性，不同模块之间的生物学功能又有显著差异，如模块1全部靶点分别富集在钾离子跨膜转运和离子跨膜转运的调控；模块2、模块3、模块4和模块5主要富集在乙醇氧化、基因表达的调控、有丝分裂细胞周期G2/M转换和对乙醇的反应等生物学过程，提示左归丸可能通过干预肝细胞增殖和迁移、调节相关生物功能从而治疗肝癌. 根据KEGG富集分析结果，19个核心靶点富集在肝细胞癌、酒精性肝病、p53、TNF、AMPK、PI3K-Akt等多条癌症相关的信号通路，表明左归丸药物靶点多通路的协同作用机制. 如CYP2E1、ADH4、ADH1A、ADH1B、ADH1C等多个核心靶点参与酒精性肝病信号通路，酒精性肝病与肝癌密切相关已被证实^［11］. CYP2E1^［12］可通过调控WNT/Dvl2/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖、迁移和转移. CCNB1，CASP8参与p53信号通路，细胞DNA受损时p53信号通路诱导细胞凋亡或修复，诱导p53信号通路介导的细胞周期停滞，抑制肝癌细胞的增殖^［13］. VCAM1，ICAM1参与TNF信号通道，TNF-α是肝细胞癌进展的关键介质，可参与氧化应激，介导细胞凋亡. PPARG参与AMPK信号通路，激活AMPK/mTOR信号通路可抑制糖酵解，从而抑制肝细胞恶化^［14］. CCND1参与PI3K-Akt信号通路，调节PI3K-Akt信号通路可抑制肝细胞癌进展^［15］. 以上研究可进一步验证左归丸可能通过肝癌相关信号通路的核心靶蛋白，动态调节肝组织细胞增殖与凋亡，以减少肝组织损伤，达到治疗肝癌的目的.

分子对接显示，左归丸主要是通过β-谷甾醇、芝麻素、苦参碱等作用于肝癌. β-谷甾醇由于其抗氧化活性，对肝细胞癌具有改善作用，能阻滞肝癌细胞周期促进细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖^［16-17］. 芝麻素属木脂类化合物，具有抗氧化、抗衰老的功效，可显著促进肝癌细胞凋亡^［18］.苦参碱通过多个途径抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡，抑制肿瘤生长^［19］. β-谷甾醇、芝麻素、苦参碱等活性成分主要包含在熟地黄、菟丝子与山茱萸中. 左归丸方中熟地黄为君药，也称“至阴之药”，归肝、肾经，具有补血滋阴、益精填髓的功效^［20］. 菟丝子与山茱萸均有养肝滋肾，补肾益精之效^［21］. 诸药配伍合用，可滋阴补肾、填精益髓，体现“补肾生髓成肝”法则.

综上所述，左归丸通过“多靶点，多通路，多成分”相互作用机制，基于“补肾生髓成肝”动态调节肝功能，促进肝细胞修复与再生，达到治疗肝癌目的. 本研究基于复杂网络算法的拓扑中心性特征，融合药物靶点的生物学功能，挖掘左归丸治疗肝癌的潜在作用靶点及功能模块，为进一步揭示左归丸治疗肝癌作用机制提供实验基础.

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(81603484)

湖北省中医药管理局科研项目(ZY2023M070)