鄂西南地区稻瘟病菌群体交配型和育性分析

Analysis of mating type and fertility of Magnaporthe oryzae population in Southwest Hubei

摘要

稻瘟病是武陵山区水稻产量与品质的主要制约因素，前期研究表明该地区稻瘟病群体的交配型和育性是导致其致病性强的潜在原因. 本研究对2017—2018年鄂西南地区分离的237株稻瘟病菌进行了交配型基因分子标记鉴定、高分辨率熔解曲线分析、致病性鉴定以及育性分析. 结果表明，武陵山区稻瘟病群体同时存在两种交配型，两年间两种交配型的比率发生了改变. 2017年交配型MAT1-1占据优势， 2018年菌株交配型则以MAT1-2为主； 2017年MAT1-1菌株成功侵染的数量相较于MAT1-2菌株较多， 2018年MAT1-2菌株成功侵染的数量相较于MAT1-1菌株较多. 两年间两种交配型的比率发生了改变，该变化趋势与不同交配型的侵染成功率一致，推测该地区稻瘟病菌的毒力与其交配型相关. 上述分离的稻瘟病菌对峙培养结果仅3株产生有性结构，但两两组合杂交分析未检测到之间存在育性. 研究为进一步通过该地区稻瘟病菌群体结构特点预测稻瘟病菌群体的流行演替奠定了基础.

Abstract

Rice blast disease is the main limiting factor of rice yield and quality in the Wuling Moutain region. Previous studies have shown that the mating type and fertility of Magnaporthe oryzae（M. oryzae） population in this region are the potential causes of its strong pathogenicity. In this experiment， 237 isolates of M. oryzae， collected from Southwest Hubei Province in 2017-2018， were characterized using molecular markers of mating type genes， evaluated for pathogenicity， high resolution melting analysis and analyzed for fertility. The results revealed that there were two mating types in M. oryzae population in Wuling Mountain area， with the ratio of these types shifting over the course of two years. The mating type MAT1-1 was dominant in 2017， while MAT1-2 was the main mating type of isolates in 2018. The number of successful infection of MAT1-1 isolates was more than that of MAT1-2 isolates in 2017， while MAT1-2 isolates had a higher rate of successful infections in 2018. A shift in the ratio of two mating types over the two-year period， which was consistent with the success rate of infection associated with different mating types. This suggests that the pathogenicity of M. oryzae in this region was related to its mating type. The results of confrontation culture of the above isolates showed that only 3 isolates produced sexual structure. However， no fertility was detected between them by the pairwise combination cross analysis. This study laid a foundation for further predicting the epidemic succession of M. oryzae population through the population structural characteristics in this region.

Graphical abstract

关键词

稻瘟病菌 / 交配型 / 育性

Key words

Magnaporthe oryzae / mating type / fertility

水稻是全球一半以上人口的粮食来源，研究表明水稻产量每年须以3%的速度增长才能满足人类对其需求^［1］. 稻瘟病是导致全球水稻产量减少和品质下降的最主要因素，每年可导致10%～35% 的减产，当植株发病严重时甚至会引起绝收^［2］. 病原菌稻瘟病菌是一种可以在水稻各个发育期对水稻全株进行侵染的真菌，其无性态属于无性态类梨孢属真菌，称为稻梨孢（Pyricularia oryzae），有性态属于子囊菌门巨座壳属真菌，称为稻巨座壳菌（Magnaporthe oryzae）.

稻瘟病菌作为异宗配合的子囊真菌，其交配型由单个交配型基因MAT（mating type）位点上的两个等位基因即MAT1-1和MAT1-2调控. 在对峙培养条件下，两种不同交配型的具有育性的菌株可以诱导产生有性态. 然而，关于稻瘟病菌在自然条件下是否发生有性生殖，目前还没有确切的结论^［3］.

由于稻瘟病菌具有有性繁殖潜力，其交配类型被认为是预测遗传多样性和毒力程度的有用标准，而交配类型分布在世界范围内具有明显的多样性. 如PARK^［4］、URAK^［5］和李文强^［6］等分别在韩国、美国加利福尼亚州中北部和宁夏稻瘟病菌只检测出一种交配型MAT1-1；而SIRISATHAWORN等^［7］研究结果表明泰国稻瘟病菌遗传多样性水平较低，仅表现出一种交配型MAT1-2. IMAM等^［8］在印度检测到了MAT1-1和MAT1-2两种交配型.

在之前的研究中，一般采用MAT分子标记扩增的方式对交配型进行研究^［4-8］. 尽管这种方法可行，但它存在一些缺点，例如无法区分显性纯合子和杂合子基因型，以及提供的信息不完整.

武陵山区稻田多分布在沟、漕及峡谷中，水稻生长期间多湿寡照，导致稻瘟病发病范围广，病原菌种群数量大，生理小种变异频繁. 由于其独特的自然条件，是我国稻瘟病防治的重点地区，也是调查和研究稻瘟病病原菌的理想地区. 为了保存并研究武陵山区稻瘟病菌的天然资源库，本研究团队从2010年起在鄂西南建立了10个不同生态环境的稻瘟病观测采样基地，构建了武陵山区稻瘟病菌生理小种文库，为研究武陵山区稻瘟病菌流行演替规律打下了坚实的材料基础^［9-13］. 在前期研究中在武陵山区稻瘟病菌菌株中发现了两种交配型的存在，推断有性重组是该区稻瘟病菌群体丰富遗传多样性的潜在机制^［14］. 本研究进一步对2017—2018年分离的稻瘟病菌株开展交配型基因分子标记鉴定以及育性分析，并结合致病性鉴定的结果，对该地区稻瘟病菌的致病性与交配型之间的关系进行了分析.

1 材料和方法

1.1 稻瘟病菌样品

菌株：实验室2017—2018年从鄂西南地区采集的感穗颈瘟稻杆上分离的稻瘟病菌. 分离、活化保藏步骤参考论文［15］. 其中2017年的分离保存稻瘟病菌菌株104个，2018年的分离保存稻瘟病菌菌株 133 个，共计237株.

1.2 稻瘟病菌致病性鉴定

稻瘟病菌采用燕麦培养基，致病性鉴定采用三个标准水稻鉴别品系的组合，其中包含日本水稻鉴别品种12个，中国鉴定品种7个，单基因系鉴别品种21个. 将稻瘟病菌孢子悬浮液（浓度为3×10⁵个/mL）吹打至生长至三叶或四叶期的鉴定品种叶片表面，在95%湿度、25 ℃的环境下暗光静置1 d. 取出后保持环境湿度在50%以上，于16 h光照/8 h暗光的条件下培养6 d. 根据国际水稻所调查标准对植株的感（S）及抗（R）的类型进行统计.具体方法和步骤详见本实验室论文^［14］.

1.3 交配型基因扩增

稻瘟病菌基因组DNA的提取采用CTAB法，具体方法和步骤如文献所示^［16］. 交配型基因PCR扩增的程序及引物序列详见参考文献^［17］.

1.4 HRM（high resolution melting）分析

根据NCBI数据库中交配型基因序列设计了MAT基因进行HRM分析的qPCR引物（表1）. 熔解曲线的分析程序：95 ℃变性15 s，60 ℃退火10 s， 72 ℃延伸30 s，以1.6 ℃/s的速率升温. 并采用 QuantStudio^TM Design & Analysis Software 软件对结果进行HRM分析.

1.5 育性分析

两株交配型不同的高可育亲本对分离自鄂西南地区2年共237株稻瘟病菌在实验室条件下的对峙培养及育性分析，对产生育性的菌株在同样的实验条件下进行两两组合进行杂交，对是否有育性进行鉴定和分析，具体方法和步骤详见参考文献［17］.

2 结果与讨论

2.1 交配型基因频率

为了判断不同菌株相同交配型基因是否具有差异，选取3株毒性具有差异且都具有MAT1-1的菌株进行HRM分析. 通过qPCR图像可知，不同的菌株间Tm值存在显著差异（图1）. 说明它们的MAT1-1基因序列有差异. 采用生物信息学工具 Clustal Omega 对测序结果进行比对分析，分析结果如图2所示.菌株X-52-3在MAT1-1的50位处由碱基C突变为了碱基T，菌株X-60-4在MAT1-1的270位处由碱基A突变为了碱基G. qPCR结果与测序结果相吻合，可用于检测基因突变，为基因分型提供了新的解决思路.

根据交配型基因扩增的结果，2017年菌株的交配型以MAT1-2为主，占据了53.85%的比例，而MAT1-1占据了46.15%. 相比之下，2018年的交配型分布发生了变化，MAT1-1占据了优势地位，达到了62.41%，而MAT1-2则占据了40.6%. 值得注意的是，有4株菌株同时表现出两种交配型（图3）.

进一步对不同地区的稻瘟病菌群体交配型分析发现，鹤峰地区两年间只检测到了MAT1-2一种交配型，来凤和柏杨地区两年间都以MAT1-1为主，咸丰和建始两地由2017年交配型以MAT1-1为主转变为2018年以MAT1-2为主，且建始地区2018年并未检测到交配型MAT1-1. 2017和2018年的菌株交配型分布存在差异，这可能意味着菌群遗传结构正在发生变化. 通过有性生殖，新的突变可能产生，从而导致相应的抗性水稻品种失去抗性. 除了鹤峰地区外，其他地区都存在两种交配型同时存在的现象（建始地区在2018年仅存在MAT1-2，表2）. 以上结果表明，武陵山区稻瘟病群体同时存在两种交配型，是该地区菌群致病性变异的潜在原因.

2.2 致病性鉴定

对MAT型数据进行分组探究不同交配型的侵染率. 40个鉴定品种中，24个鉴定品种在两年间均表现为MAT1-2型菌株成功侵染的数量多于MAT1-1型菌株. 其余的16个鉴定品种中，15个鉴定品种在2017年时MAT1-1型侵染成功数量多，到2018年则变为MAT1-2型侵染数量多. 仅有一个鉴定品种（关东51）在2017年时MAT1-2型侵染成功数量多，到2018年变为MAT1-1型侵染数量多（图4）. 两年间MAT1-2型菌株侵染成功的比例增大，且整体上MAT1-2型侵染成功的数量多于MAT1-1型. 推测鄂西南地区稻瘟病菌群体是由于部分MAT1-2型菌株毒性高于MAT1-1型菌株，导致群体致病性发生了变化.

2.3 育性分析

对上述237株稻瘟病菌在实验室条件下进行对峙培养及分析，发现仅3株稻瘟病菌可与两亲本之一在交界处形成子囊壳带结构（图5（a））. 而剩余的的稻瘟病菌无法与亲本产生有性结构，在其接触边缘只能观察到气生菌丝的存在（图5（b））. 将3株产生育性的菌株在同样的实验条件下进行两两组合进行杂交，但在20 d之后并未发现子囊壳带结构的存在，说明在分离的稻瘟病菌间没有检测到育性.

3 结论

传统的交配型检测方法，如PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，既耗时又费力，难以进行大规模检测. 而本实验中，稻瘟病菌的交配型基因通过熔解曲线检测，其结果与测序结果相一致，印证了HRM分析技术能够快速、准确地鉴别交配型基因分型. 这一方法显著缩短了检测时间，并可应用于大规模的交配型检测. 此外，该方法不仅适用于异宗配合的子囊真菌交配型的检测，还有望在丝状真菌交配型检测领域进行推广^［18］. 这对于研究真菌遗传变异具有重要意义.

通过对鄂西南地区2017—2018年收集到的病菌进行交配型基因的MAT标记及致病性鉴定，发现致病性与交配型基因存在一定联系. 实验结果推测鄂西南地区不同交配型的稻瘟病菌之间的毒力具有一定区别，鄂西南地区稻瘟病菌群体可能是由于部分MAT1-2型菌株毒性高于MAT1-1型菌株，导致群体交配型基因频率发生变化. 董丽英等^［19］对云南省分离的99个稻瘟病菌交配型测定发现MAT1-1和MAT1-2菌株分别占60.9%和39.1%. 张晓玉等^［20］对黑龙江省稻瘟病菌交配型进行测定发现黑龙江省稻瘟病菌群体中同时存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型，主要以交配型MAT1-1占优势，出现频率为58.92%. 稻瘟病交配型地区上的差异明显，致病性上没有明显差异，说明不同交配型的稻瘟病菌之间的毒力或许无明显区别. 稻瘟病菌起源于云南、老挝等地区，张晓玉等^［20］在黑龙江等地也检测到了双交配型菌株以及育性菌株的存在，这一方面说明了稻瘟病菌在我国分布较广，同时有性菌株的存在可能会造成群体的遗传物质更容易发生新的变异，导致部分前期抗病数据在后续作用较低. 汪文娟等^［21］虽然在广东省也检测到了1株双交配型植株，但绝大部分还是只检测到了MAT1-2型，说明稻瘟病菌在田间还是以无性繁殖为主. 稻瘟病菌交配型与致病性之间的关系有待于进一步的研究.

2018年在鄂西南地区稻瘟病菌群体中出现了同时具有两种交配型菌株的存在，可能这期间是鄂西南地区群体刚开始少量进行有性生殖的时间点^［14］. 尽管鄂西南地区的稻瘟病菌在与云南农科院的高可育菌株在培养基上相遇后可以产生子囊壳带结构以及有性后代，但是鄂西南地区的菌株之间没有产生有性结构. 王宝华等^［17］对福建地区277个稻瘟病菌菌株育性进行检测，其中184株菌株为可育菌株. 李文强等^［6］对宁夏地区460个稻瘟病菌菌株育性进行检测，其中363株菌株为可育菌株. 推测鄂西南地区2017—2018年采集的稻瘟病菌未出现有性结构可能是由于该地区稻瘟病菌在实验室条件下育性较低.

本研究结果表明武陵山区稻瘟病菌2017—2018年存在MAT1-1基因比例下降，MAT1-2基因比例上升的趋势，且该变化趋势与不同交配型的侵染成功率一致. 2017—2018年群体结构的剧烈改变推测是由于在自然条件下其通过有性生殖产生有性后代从而导致稻瘟病菌遗传多样性增加导致，同时双交配型菌株及无交配型菌株的出现暗示着其在自然条件下存在着一定有性生殖的可能.本研究对鄂西南地区稻瘟病菌群体的交配型、致病力及育性之间的关系进行了分析，为预测该地区稻瘟病菌群体的流行演替规律奠定了基础.

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(30971563)

湖北省自然科学基金资助项目(2018CFB476)

湖北省自然科学重点项目（滚动创新群体）(2015CFA015)