大花地不容生物碱成分研究

Alkaloids from Stephania macrantha

摘要

采用正、反相硅胶柱层析、半制备HPLC等各种色谱技术，对大花地不容（Stephania macrantha）总生物碱进行分离纯化，得到6个生物碱，其结构分别通过各种1D、2D NMR技术、高分辨质谱、圆二色谱、量子化学计算以及酸水解的方法来确定. 6个生物碱分别鉴定为isothebaine-1-O-β-D-glucopyranoside（1）、异紫堇定（2）、斯蒂芬灵碱（3）、乌药碱（4）、瑞枯灵（5）和青风藤碱（6），其中化合物1为新的生物碱糖苷. 通过CCK-8方法评价了所分离的生物碱对四种肿瘤细胞（人肝癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、人咽鳞癌细胞和人胃癌细胞）的抗增殖活性，结果表明异紫堇定（2）对人胃癌细胞生长有明显抑制作用，其IC₅₀的值为17.02 µM.

Abstract

Various chromatographic techniques， including normal and reversed-phase silica gel column chromatography as well as semi-preparative HPLC， were employed to separate and purify the total alkaloids from Stephania macrantha， resulting in the isolation of six alkaloids. Their structures were elucidated using a combination of 1D and 2D NMR techniques， high-resolution mass spectrometry， circular dichroism spectroscopy， quantum chemical calculations， and acid hydrolysis methods. The six alkaloids were identified as isothebaine-1-O-β-D-glucopyranoside （1）， isocorydine （2）， stepharine （3）， coclaurine （4）， reticuline （5）， and coclaurine （6）， with compound 1 being a novel alkaloid glycoside. The anti-proliferative activity of the isolated alkaloids against four tumor cell lines （Hep G2， A549， FaDu， HGC-27） was assessed using the CCK-8 method. The results demonstrated that isocorydine （2） exhibited significant inhibitory effects on the growth of HGC-27 tumor cells， with IC₅₀ values of 17.02 µM.

Graphical abstract

关键词

千金藤属 / 大花地不容 / 生物碱 / 抗增殖活性

Key words

Stephania / Stephania macrantha / alkaloids / anti-proliferative activity

大花地不容（Stephania macrantha Lo et M. Yang），隶属防己科（Menispermaceae）千金藤属（Stephania），其块根作为“地不容”入药，《滇南本草》记载地不容味苦、性温且具毒性，能疗诸般疟疾. 大花地不容的主要有效成分为生物碱，并以异喹啉类生物碱为主，涵盖苄基四氢异喹啉型、阿朴啡型、青藤碱型、小檗碱型以及原小檗碱型等多种类型^［1-3］. 前期文献报道大花地不容块根的总生物碱和青藤碱都有抑制人非小细胞肺癌细胞A549生长的活性^［3］. 此外，该植物中部分已知生物碱如异紫堇定^［4-5］、荷包牡丹碱 ^［6-8］和延胡索乙素^［9］均被报道对多种肿瘤细胞有抗增殖的活性. 大花地不容作为有潜在抗肿瘤活性的药用植物极具开发价值，但目前对其化学成分和相关药理活性报道较少，为进一步发现大花地不容中新颖的生物碱，促进该药用植物资源的开发，对大花地不容生物碱及其抗增殖活性进行了研究. 通过正、反相硅胶柱层析，半制备HPLC及重结晶等方法从大花地不容中分离与鉴定了6种生物碱（图1），其结构分别为isothebaine-1-O-β-D-glucopyranoside（1）、异紫堇定（2）、斯蒂芬灵碱（3）、乌药碱（4）、瑞枯灵（5）和青风藤碱（6），其中化合物1为新的生物碱糖苷. 体外抗增殖活性研究表明化合物2对HGC-27细胞有明显抑制作用，IC₅₀为17.02 µM.

1 仪器与材料

核磁共振波谱仪（AM-500，600型，德国Bruker），半制备型高效液相色谱仪（武汉睿和），紫外分析仪（ZF1-II型，上海嘉鹏），紫外可见分光光度计（UH5300型，日本日立），全自动数字旋光仪（AutopolIV-T型，美国鲁道夫），圆二色谱仪（Chirascan Plus型，英国应用光物理公司），高分辨质谱仪（Q Exactive型，美国赛默飞），旋转蒸发仪（RE2000A型，上海亚荣），循环水式真空泵（SHB-D （Ш）型，上海贝茵），二氧化碳培养箱（MCP-170H型，安徽中科都菱），洁净工作台（SW-CJ-2FDG型，苏州安泰），低速离心机（DM0412型，大龙兴创公司），数显二孔恒温水浴锅（HH-S2型，常州市金坛大地自动化仪器厂），显微镜（ASV0870-HK830型，深圳奥斯）. 半制备型色谱柱YMC-Pack ODS-A （250 mm × 10 mm， 5 μm）、ODS 硅胶50 μm（日本 YMC 公司），正相硅胶200-300目、薄层硅胶板G板（青岛海洋化工厂），无水乙醇、乙酸乙酯、二乙胺（上海泰坦），盐酸、氢氧化钠、三乙胺（国药集团），色谱纯乙腈（湖北弗顿），人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞Hep G2、人胃癌细胞HGC-27、人咽鳞癌细胞FaDu、人咽鳞癌细胞专用培养基、人胃癌细胞专用培养基、肺癌人类肺泡基底上皮细胞专用培养基（武汉普诺赛），0.25%胰酶、磷酸盐缓冲液、MEM培养基（美国赛默飞），胎牛血清（浙江天杭），青霉素-链霉素-两性霉素B添加剂（武汉塞维尔），二甲亚砜（北京索莱宝），CCK-8试剂盒（上海碧云天），顺铂、D-葡萄糖、L-葡萄糖、邻甲苯异硫氰酸酯（上海源叶），三氟乙酸、L-半胱氨酸甲酯盐酸盐（上海阿拉丁），吡啶（上海化学试剂公司）.

大花地不容块根，2023 年6月购自云南保山，经中南民族大学药学院刘新桥教授鉴定为防己科千金藤属植物大花地不容（Stephania macrantha Lo et M. Yang）的块根.

2 实验部分

2.1 提取与分离

将4.8 kg大花地不容块根粉碎，用30 L 80%乙醇浸泡24 h，抽滤，共重复三次，将滤液合并浓缩，得到浸膏0.81 kg. 浸膏加2 L水溶解，用5%盐酸溶液调pH为3，用乙酸乙酯萃取4次，每次600 mL，取水层用5%氢氧化钠溶液调pH为10，此时大部分生物碱析出. 抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取4次，每次600 mL，将乙酸乙酯相与析出的生物碱合并浓缩，干燥后共得大花地不容总生物碱320 g. 称取280 g生物碱进行正相柱层析（200-300目），以二氯甲烷-甲醇（50∶1，30∶1，10∶1，8∶2，7∶3，1∶1）为洗脱剂进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩，薄层色谱检测，以石油醚-乙酸乙酯-二乙胺为展开剂，改良碘化铋钾溶液为显色剂，按照TLC检测结果，将洗脱液浓缩合并为9个组分（Fr. A- Fr. Ⅰ）. 将Fr. H和Fr. Ⅰ合并得到的8.68 g生物碱进行反相ODS柱层析，以甲醇-水（1∶9-1∶0）为洗脱剂进行梯度洗脱，TLC检测合并为7个组分（Fr. A- Fr. g）. 将Fr. c（2.24 g）进行正相柱层析（200-300目），以石油醚-二乙胺（15∶1-0∶1）为洗脱剂进行梯度洗脱，TLC检测合并分为10个组分（Fr. c-1-Fr. c-10）. 将Fr. c-7通过半制备HPLC的方法纯化（乙腈-水=25∶75，流速：3 mL/min）得到化合物1（2.1 mg，t_R=25.2 min）. 将Fr. c-4通过半制备HPLC的方法纯化（乙腈-水=50∶50，流速：3 mL/min）得到化合物5（32.9 mg，t_R=7.2 min）. 将Fr. a（3.3 g）进行正相柱层析（200-300目），以石油醚-二乙胺（13∶1-0∶1）为洗脱剂进行梯度洗脱，TLC检测合并为21个部分（Fr. a-1-Fr. a-21）. 将Fr. a-9通过半制备HPLC的方法纯化（乙腈-水=25∶75，流速：3 mL/min）得到化合物3（4.8 mg，t_R=20.6 min）. 将Fr. a-12通过半制备HPLC的方法纯化（乙腈-水=18∶82，流速：3 mL/min）得到和化合物4（5.0 mg，t_R=12.6 min）. 从Fr. B和Fr. F分别通过甲醇重结晶，得到化合物2（6.24 g）和6（399.05 mg）.

2.2 酸水解实验^［10］

取化合物1 1.0 mg溶于2 mL CF₃COOH（4 mol/L）溶液中，在95 ℃水浴锅中反应3 h，冷却至室温，用等体积（2 mL）的CH₂Cl₂萃取3次，将水层合并后浓缩即得水解后的样品.

以D-葡萄糖和L-葡萄糖为标准品，称取各标准品1 mg，在标准品和水解样品中加入无水吡啶0.5 mL和L-半胱氨酸甲酯盐酸盐1.0 mg于60 ℃水浴锅中反应1 h，反应液冷却后加入5 μL邻甲苯异硫氰酸酯，于60 ℃水浴锅中继续反应1 h，将反应后的溶液冷却至室温，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得标准品溶液和水解样品溶液.

分别取标准品溶液和水解样品溶液各5 μL经HPLC（乙腈-水=25∶75，流速：0.8 mL/min，检测波长为250 nm，分析柱为YMC-Pack QDS-A色谱柱4.6 ×250 mm，粒径5 μm）进行色谱分析. D-葡萄糖和L-葡萄糖的衍生物的保留时间分别为25.04 min和22.43 min，水解样品衍生物的保留时间为25.02 min，因而确定葡萄糖的绝对构型为D型.

2.3 抗增殖活性测试

采用CCK-8法^［11］检测分离到的生物碱1-6对HepG-2、A549、FaDu、HGC-27的抗增值活性. 以化合物1-6为实验组，以顺铂为阳性对照药，同时设置对照组（含细胞不含药物的等体积无血清培养基）和空白组（不含细胞和药物的等体积含10% CCK-8的培养基）. 取对数生长期的细胞以1×10⁵ 个/孔的密度接种于96孔板培养至细胞贴壁后给药，每孔加入浓度为20 μM的受试化合物100 μL于37 ℃、5% CO₂的培养箱中继续培养24 h，然后弃上清液，每孔加入100 μL含10% CCK-8工作液的培养基，于37 ℃、5% CO₂中继续培养1 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 处的吸光度（A）值. 重复实验3次，各组分别设定3个复孔. 根据测得的A值计算抑制率. 对抑制率达到45%及以上的化合物设置浓度梯度（0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、30 μM），计算其相应的IC₅₀值.

抑制率＝［（A_对照－A_实验）/（A_对照－A_空白）］×100%.

3 结果与分析

3.1 结构鉴定

化合物1：黄色无定形粉末，碘化铋钾显橘红色，推断该化合物可能为生物碱. HR-ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z 474.2119［M+H］⁺ C₂₅H₃₂NO₈ 计算值：（474.2122），故推测化合物1的分子式为C₂₅H₃₁NO₈，不饱和度为11. NMR数据给出了一个葡萄糖端基质子的信号［δ_H 4.32（1H， d， J=7.0 Hz）］和一组葡萄糖碳的信号［δ_C 105.7（d），75.9（d），77.6（d），71.2（d），76.9（d），62.7（t）］，推测该化合物可能含有一个葡萄糖. 将化合物1进行酸水解，并对水解产物进行硫代氨基甲酰基噻唑烷衍生化反应. HPLC分析表明酸水解产物的衍生物同D-葡萄糖的衍生物有相同的保留时间，说明化合物1中含有D-葡萄糖，结合端基质子的偶合常数（J=7.0 Hz），可以确定化合物1中所含的糖为β-D型葡萄糖. 除去葡萄糖上的NMR信号外，化合物1的¹H NMR（500 MHz，CD₃OD）谱中显示有1个孤立的芳香质子信号［δ_H 6.85（1H，s）］和1个1，2，3-三取代的苯环信号［δ_H 6.94（1H，d，J=7.0 Hz），6.98（1H，d，J=8.5 Hz），7.25（1H，dd，J=7.5，8.5 Hz）］，2个甲氧基信号［δ_H 3.89（3H，s），3.88（3H，s）］和1个连氮甲基信号［δ_H 2.71（3H，s）］. ¹³C NMR（125 MHz， CD₃OD）和DEPT谱上的显示有8个sp²杂化的非质子化的碳［δ_C 158.8（s），153.0（s），143.4（s），138.2（s），129.3（s），128.9（s），127.7（s），123.4（s）］，1个连氮甲基［δ_C 43.2（q）］，2个甲氧基［δ_C 56.5（q），56.2（q）］，4个sp²杂化次甲基［δ_C 111.9（d），120.5（d），129.7（d），112.2（d）］和3个亚甲基［28.6（t），53.9（t），35.8（t）］. 综合以上NMR的数据，推测该化合物为阿朴啡型生物碱. 将化合物1苷元的NMR数据与异紫堇定的NMR数据^［11］进行比较，发现两个化合物的NMR数据基本一致，其结构主要差别在于B环上取代模式的不一样，异紫堇定B环中出现一对苯环邻位偶合的质子［δ_H 6.76（1H，dd，J=8.0，1.0 Hz），6.79（1H，d，J=8.0 Hz）］，而在化合物1中出现一组苯环的1，2，3-三取代的信号，结合HMBC图谱显示H-8（δ_H 6.94）与C-7（δ_C 35.8）相关，确定了B环的取代模式为1，2，3-三取代. HMBC图谱显示H-10（δ_H 6.98）与C-11（δ_C 158.8）相关（图2，表1），甲氧基（δ_H 3.88）与C-11（δ_C 158.8）相关，表明B环上甲氧基连接在C-11，而ROESY图谱的H-10（δ_H 6.98）与甲氧基（δ_H 3.88）相关也进一步证实了上述推断. ROESY图谱上还显示H-3（δ_H 6.85）与另一个甲氧基（δ_H 3.89）相关，表明了这个甲氧基连接在C-2上，HMBC图谱显示的葡萄糖上的端基质子H-1΄（δ_H 4.32）与C-1（δ_C 143.4）相关，说明葡萄糖通过苷键连接在C-1位. 通过密度泛函理论（DFT）对该化合物的CD图谱进行计算拟合，结果如图3所示，发现S构型的计算ECD光谱与实验ECD光谱一致，表明该化合物的C-6a的绝对构型为S.

化合物2：黄色棱晶，碘化铋钾显橘红色. ¹H NMR（CDCl₃，600 MHz）δ_H：6.70（1H，s，H-3），2.70（1H，dd，J=16.8，3.6 Hz，H-4），3.20（1H，m，H-4），2.50（1H，m，H-5）， 3.05（1H，dd，J=13.2，3.6 Hz，H-5），2.90（1H，m，H-6a），2.47（1H，m，H-7），3.05（1H，dd，J=13.2，3.6 Hz，H-7），6.82（1H，d，J=7.8 Hz，H-8），6.85（1H，d，J=8.4 Hz，H-9），2.55（1H，s，N-CH₃），8.83（1H，s，OH），3.70（3H，s，OCH₃-1），3.90（3H，s，OCH₃-2），3.91（3H，s，OCH₃-10）. ¹³C NMR（CDCl₃，150 MHz）δ_C：142.3（C-1），151.5（C-2），111.1（C-3），129.1（C-3a），130.1（C-3b），29.3（C-4），52.9（C-5），63.0（C-6a），35.9（C-7），130.0（C-7a），119.2（C-8），111.2（C-9），149.6（C-10），144.1（C-11），120.3（C-11a），126.1（C-11b），44.0（N-CH₃），62.2（OCH₃-1），56.0（OCH₃-2），56.3（OCH₃-10）. 以上NMR数据与文献报道^［12］的异紫堇定（isocorydine）一致，故鉴定该化合物为异紫堇定.

化合物3：红棕色无定形粉末，碘化铋钾显橘红色. ¹H NMR（CDCl₃，500 MHz）δ_H：6.64（1H，s，H-3），2.77（2H，m，H-4），3.47（1H，m，H-5），3.15（1H，m，H-5），4.32（1H，dd，J=10.5，6.5 Hz，H-6a），2.40（1H，dd，J=12.0，6.5 Hz，H-7），2.28（1H，dd，J=10.5，10.5 Hz，H-7），6.90（1H，dd，J=9.5，2.5 Hz，H-8），6.42（1H，dd，J=10.0，2.0 Hz，H-9），6.30（1H，dd，J=10.0，2.0 Hz，H-11），7.02（1H，dd，J=10.0，3.0 Hz，H-12），3.81（3H，s，OCH₃-1），3.51（3H，s，OCH₃-2）. ¹³C NMR（CDCl₃，125 MHz）δ_C：153.5（C-1），144.6（C-2），112.3（C-3），128.1（C-3a），132.8（C-3b），45.0（C-4），48.1（C-5），57.7（C-6a），26.1（C-7），51.3（C-7a），134.7（C-7b），149.9（C-8），128.5（C-9），186.5（C-10），128.5（C-11），149.9（C-12），56.5（OCH₃-1），61.2（OCH₃-2）. 上述NMR数据与文献报道［3］的斯帝酚灵碱（stepharine）一致，故鉴定该化合物为斯帝酚灵碱.

化合物4：黄色无定形粉末，碘化铋钾显橘红色. ¹H NMR（CD₃OD，500 MHz）δ_H：4.08（1H，m，H-1），3.21（1H，m，H-3），3.14（1H，m，H-3），2.78（1H，m，H-4），2.74（1H，m，H-4），6.68（1H，s，H-5），6.66（1H，s，H-8），2.86（1H，m，H-9），2.81（1H，m，H-9），7.09（1H，d，J=8.0 Hz，H-2΄），6.77（1H，d，J=8.5 Hz，H-3΄），6.77（1H，d，J=8.5 Hz，H-5΄），7.09（1H，d，J=8.0 Hz，H-6΄），3.82（3H，s，OCH₃-6）. ¹³C NMR（CD₃OD，125 MHz）δ_C：58.0（C-1），41.4（C-3），29.1（C-4），126.4（C-4a），116.5（C-5），148.0（C-6），145.8（C-7），112.8（C-8），130.5（C-8a），41.9（C-9），130.5（C-1΄），131.4（C-2΄），114.1（C-3΄），157.4（C-4΄），116.5（C-5΄），131.4（C-6΄），56.3（OCH₃-6）. 上述NMR数据与文献报道的乌药碱^［13］（coclaurine）一致，故鉴定该化合物为乌药碱.

化合物5：棕色油状物，碘化铋钾显橘红色. ¹H NMR（CDCl₃，500 MHz）δ_H：3.66（1H，t，J=6.0 Hz，H-1），2.71-2.83（1H，m，H-3），3.16（1H，ddd，J=4.5，8.5，13.5 Hz，H-3），2.54（1H，dt，J=5.5，15.5 Hz，H-4），2.71-2.83（1H，m，H-4），6.53（1H， s， H-5），6.40（1H， s， H-8），2.71-2.83（1H，m，H-9），3.02（1H，dd，J=14.0，6.5 Hz，H-9），6.78（1H，d，J=2.5 Hz，H-2΄），6.73（1H，d，J=8.5 Hz，H-5΄），6.60（1H，dd，J=8.5，2.5 Hz，H-6΄），2.44（1H，s，N-CH₃），3.85（3H，s，OCH₃-6），3.84（3H，s，OCH₃-4΄）. ¹³C NMR（CDCl₃，125 MHz）δ_C：64.6（C-1），46.9（C-3），25.2（C-4），130.6（C-4a），110.5（C-5），145.1（C-6），143.4（C-7），113.8（C-8），125.5（C-8a），41.1（C-9），133.4（C-1΄），115.7（C-2΄），145.2（C-3΄），145.4（C-4΄），110.7（C-5΄），121.0（C-6΄），42.6（N-CH₃），56.0（OCH₃-6），56.0（OCH₃-4΄）. 以上NMR数据与文献报道^［14］的瑞枯灵（reticuline）一致，故鉴定该化合物为瑞枯灵.

化合物6：黄色棱晶，碘化铋钾显橘红色. ¹H NMR（CDCl₃，600 MHz）δ_H：6.66（1H，d，J=7.8 Hz，H-1），6.75（1H，d，J=8.4 Hz，H-2），7.54（1H，s，H-5），6.33（1H，s，H-8），3.71（1H，d，J=5.4 Hz，H-9），2.98（1H，dd，J=17.4，5.4 Hz，H-10），3.33（1H，d，J=16.8 Hz，H-10），1.77（1H，ddd，J=12.6，12.6，4.8 Hz，H-15），2.37（1H，ddd，J=13.2，3.6，1.8 Hz，H-15），2.49（1H，m，H-16），2.61（1H，dd，J=11.4，3.6 Hz，H-16），6.33（1H，OH），2.46（1H，s，N-CH₃），3.89（3H，s，OCH₃-3），3.75（3H，s，OCH₃-6）. ¹³C NMR（CDCl₃，150 MHz）δ_C：119.0（C-1），109.6（C-2），145.5（C-3），143.4（C-4），120.4（C-5），151.2（C-6），181.5（C-7），122.5（C-8），61.2（C-9），32.8（C-10），129.8（C-11），124.0（C-12），43.7（C-13），161.4（C-14），37.7（C-15），47.2（C-16），41.8（N-CH₃），56.4（OCH₃-3），55.0（OCH₃-6）. 以上NMR数据与文献报道［15］的青风藤碱（sinoactine）一致，故鉴定该化合物为青风藤碱.

3.2 抗增殖活性测试结果

采用CCK-8法，以顺铂为阳性药，评价分离到的生物碱1-6对四种肿瘤细胞（人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞Hep G2、人胃癌细胞HGC-27、人咽鳞癌细胞FaDu）的抗增值活性. 结果表明在20 μM的浓度下，化合物1-6对不同的肿瘤细胞呈现不同程度的抑制作用，其抑制率小于50%，仅化合物2对HGC-27细胞生长的抑制率大于50%，设置浓度梯度，测的该化合物的IC₅₀值为17.02 μM（表2）.

4 结语

从大花地不容中共分离鉴定出6个生物碱，涵盖阿朴啡型、原阿朴啡型、苄基四氢异喹啉型和青藤碱型生物碱，其中新化合物isothebaine-1-O-β-D-glucopyranoside为首次从大花地不容中分离出的生物碱糖苷. 对分离到的生物碱进行体外抗肿瘤细胞增殖活性测试，结果表明这6个生物碱对四种肿瘤细胞（Hep G2、A549、FaDu 、HGC-27）生长有不同程度的抑制作用，其中化合物2对HGC-27细胞有较好的抗增殖效果，IC₅₀为17.02 µM，化合物2作为大花地不容的主要生物碱之一，具有量丰且易获取的显著优势，能够作为先导化合物，进行结构修饰，以期发现高效低毒的活性化合物，为后续进一步深入开发和利用大花地不容提供了科学依据.

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基金资助

国家重点研发项目(2022YFC3502200)