去铁胺对丙戊酸钠诱导药物性肝损伤的保护作用

Protective effect of deferoxamine on drug-induced liver injury induced by sodium valproate

摘要

丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）为临床常用抗癫痫药物，但因其引起药物性肝损伤（drug-induced liver injury， DILI）而限制了其应用，目前具体毒性机制尚不明确. 本研究探讨了VPA导致肝损伤的机制，并评估了去铁胺（deferoxamine，DFO）对VPA诱导DILI的体内外保护作用. 通过细胞活力检测、形态观察和增殖实验评价了AML-12细胞活力；同时检测了C57BL/6小鼠肝脏指数及肝功能指标，并观察了实验小鼠肝脏病理学变化；测定了肝细胞中总铁离子含量、SOD、GSH和MDA的活力或含量；通过免疫荧光、Q-PCR等技术检测了肝细胞内铁死亡标志蛋白铁重链（FTH）、铁轻链（FTL）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达水平. 结果表明：VPA呈剂量依赖性地上调肝功能转氨酶指标（ALT、AST）及造成肝脏组织病变，并导致氧化应激状态；VPA呈剂量依赖性地降低铁死亡标志蛋白GPX4、FTH和FTL的表达. 而DFO可以改善VPA诱导的肝功能指标异常和肝脏组织病变，减轻VPA引起的肝细胞氧化应激状态，改善VPA引起铁死亡相关标志蛋白表达水平的下降，这可能与DFO调控铁死亡具有密切的关联性.

Abstract

Sodium valproate （VPA） is a commonly used antiepileptic drug in clinical practice， but its application is limited due to its drug-induced liver injury （DILI）. The specific toxic mechanism is currently unclear. This study aims to explore the mechanism of VPA induced liver injury and evaluate the in vitro and in vivo protective effects of deferoxamine （DFO） on VPA induced DILI. AML-12 cell viability was evaluated through cell viability testing， morphological observation and proliferation experiments. Meanwhile， the liver index and liver function indicators of C57BL/6 mice were detected and pathological changes in the liver of experimental mice were observed； further measurements were taken on the total iron content， SOD， GSH and MDA activity or content in liver cells； the expression levels of ferroptosis marker proteins ferritin heavy chain （FTH）， ferritin light chain （FTL） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） in liver cells were detected by immunofluorescence， Q-PCR and other techniques. The results showed that VPA dose dependently upregulated liver function transaminase indicators （ALT， AST） and caused liver tissue lesions， leading to oxidative stress status； VPA dose dependently reduced the expression of ferroptosis marker proteins GPX4， FTH and FTL. DFO can improve the abnormal liver function indicators and liver tissue lesions induced by VPA， alleviate the oxidative stress state of liver cells caused by VPA and improve the decrease in the expression level of ferroptosis related marker proteins caused by VPA. This may be closely related to the regulation of ferroptosis by DFO.

Graphical abstract

关键词

丙戊酸钠 / 去铁胺 / 药物性肝损伤 / 铁死亡 / 氧化应激

Key words

sodium valproate / deferoxamine / DILI / ferroptosis / oxidative stress

近年来，我国各类肝脏疾病的发病率逐年上升^［1］. 其中，药物性肝损伤为最严重的肝脏疾病之一^［2］. 丙戊酸钠（sodium valproate， VPA）是临床上治疗癫痫病症的一线药物，有关其肝毒性报道越来越频繁，已成为引起急性药物性肝损伤最为常见的药物之一^［3］. 如果不及时干预，药物性肝损伤有可能发展为非酒精性脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌^［4］. VPA诱导的肝损伤机制复杂，可能涉及氧化应激和脂质代谢紊乱^［5］. 铁死亡作为一种铁依赖性的细胞死亡形式，也与氧化应激和脂质过氧化密切相关^［6］. 由于VPA诱导的肝损伤与铁坏死的某些特征存在重叠，因此，推测VPA可能通过触发铁死亡导致肝细胞损伤. 近年来，丙戊酸钠导致肝损伤的病例常有报道^［7］. 然而，铁死亡对VPA诱导肝损伤的影响尚未得到研究^［8］. 因此，寻找VPA导致肝损伤的潜在机制，可对长期服用VPA导致肝损伤的患者提供潜在治疗思路.

去铁胺（deferoxamine，DFO）是一种链球菌发酵液中提纯的有机分子，是目前公认的铁离子螯合剂，可以螯合铁蛋白和含铁血黄素中的铁离子，一定程度可以阻止细胞内铁死亡的发生. 临床上，DFO主要用于慢性铁负荷过重疾病，如反复输血引起的含铁血黄素沉重病、地中海贫血、铁粒幼细胞型贫血和自身免疫性溶血性贫血等慢性贫血病^［7］. 铁螯合剂在体内可将游离铁或活性铁络合成无毒的络合物由尿排出^［9］，它还能螯合铁蛋白中的氧化态铁离子，抑制铁从铁蛋白中的解离，并通过稳定细胞内铁贮库，减少铁离子的释放^［10-11］. 然而，DFO对VPA诱导肝细胞铁死亡通路研究较少，本文以AML12细胞和C57BL/6小鼠为实验对象，探究DFO对VPA诱导药物性肝损伤的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AML-12细胞（武汉普诺赛）；雄性SPF级小鼠C57BL/6共计64只（湖北省实验动物研究中心，实验方案由中南民族大学实验动物与生物医学伦理委员会审查和批准，批准号：SCUEC-AEC-014）.

丙戊酸钠（上海迈瑞尔）；枸橼酸铁胺（上海阿拉丁）；DMEM/F12基础培养基、胎牛血清（武汉普诺赛）；PBS缓冲液（武汉塞维尔）；胰蛋白酶（美国赛默飞）；去铁胺（纯度≥92%）、水飞蓟宾（上海源叶）；CCK8、MTT检测细胞毒性试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天）； Trizol裂解液（南京诺唯赞）；乳酸脱氢酶（LDH）、还原性谷胱甘肽（GSH）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成）；铁离子含量检测试剂盒（Iron）（北京普利莱）；FTH、FTL、GPX4、β-actin、HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG （H+L）抗体（武汉爱博泰克）.

倒置显微镜（CX27，上海蔡康）；细胞培养箱（MCO-15AC型，日本三洋）；全自动酶标仪（MuLTI-SKAN型，深圳菲特立）.

1.2 方法

1.2.1 细胞实验

AML-12细胞由实验室自传代储存. 细胞贴壁生长在DMEM/F12培养基中，其中含有10%的胎牛血清、40 μg/mL地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10 μg/mL胰岛素，在5% CO₂、37 ℃条件下培养.

分别取VPA、DFO粉末溶于0.9% NaCl溶液中，配成100 mmol/L母液，加入不完全培养基稀释成特定浓度后给药. 取对数生长期的AML-12细胞接种于96孔板中，每孔细胞密度为1×10⁵个，待细胞完全贴壁后，模型组中加入VPA刺激24 h，弃去给药组培养液，加入DFO刺激24 h后，进行后续实验.

1.2.2 细胞活力测试

参考文献［12］，取对数生长期的AML-12细胞接种于96孔板中，每孔细胞密度为1×10⁵个，待细胞完全贴壁后，进行细胞活力的CKK8以及MTT检测.

1.2.3 细胞形态学观察

细胞给药培养满24 h后，在倒置显微镜下观察AML-12细胞的形态并拍照记录^［13］.

1.2.4 Western Bolt检测细胞内蛋白的表达

参考文献方法^［14］，细胞给药24 h后，弃原培养基，提取总蛋白，BCA法测蛋白质浓度. 每泳道上样20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h. 4 ℃孵育一抗过夜，次日回收一抗，TBST洗3次，室温孵育二抗1 h，TBST洗3次，显影. Image J分析蛋白质条带灰度值，以β-Actin为内参计算目的蛋白相对表达水平.

1.2.5 免疫荧光检测

培养细胞并给药满24 h后，弃各孔中原培养基，加入免疫染色固定液固定20 min，5% BSA封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜， 次日回收一抗，TBST洗3次，避光室温孵育二抗1 h，TBST洗3次，按说明书进行荧光染色，在荧光显微镜下观察并拍照^［15］.

1.2.6 动物实验

（1）将24只C57BL/6小鼠随机分为3组（n=8）：1）空白组、2）低剂量模型组（250 mg/kg）、3）高剂量模型组（500 mg/kg）. 将VPA溶于0.9%的NaCl溶液中，每天灌胃给药一次，持续14 d，最后一次灌胃VPA 24 h后，处死小鼠，收集肝脏和血液.

（2）将40只C57BL/6小鼠随机分为5组（n=8）：1）空白组、2）VPA模型组（500 mg/kg）、3）DFO低剂量组（100 mg/kg）、4）DFO高剂量组（200 mg/kg）、5）水飞蓟宾阳性组（100 mg/kg）. 将VPA、DFO分别溶于0.9%的NaCl溶液中，VPA通过灌胃给药30 min后，DFO通过腹腔注射给药，每天给药一次，持续14 d. 最后一次给药24 h后，处死小鼠，收集肝脏和血液进行下一步实验^［8］.

1.2.7 肝组织病理分析

按照说明书，使用苏木精伊红染色观察小鼠肝脏的微观结构.

1.2.8 生化试剂盒测试

按照生化试剂盒检测说明书分别检测小鼠血清中ALT、AST水平，按照生化试剂盒说明书分别检测小鼠肝脏组织中MDA、SOD、GSH、铁的水平.

1.2.9 定量反转录 PCR（qRT-PCR）检测铁蛋白相关基因表达水平变化

使用Trizol试剂盒提取小鼠肝脏总RNA，然后按照说明书进行Q-PCR，扩增引物的序列如表1所示^［16］. Q-PCR的扩增次数为40个循环，实验结果通过2^-ΔΔCt 法计算得到.

1.2.10 统计学分析

实验结果均以均数±标准差（Mean±SE）表示，所有数据差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析，P<0.05被认为差异具有统计学意义.

2 结果和分析

2.1 VPA对细胞活力的影响

通过CCK8和MTT指标可看出（图1），与空白组相比，随着VPA给药浓度增加，AML-12细胞活力逐渐减弱，结果表明VPA会抑制AML-12细胞活力.

2.2 VPA对细胞增殖的影响

通过Edu检测判断细胞增殖情况，对比空白组，模型组中荧光信号显著减弱，AML-12细胞增殖减少，结果表明VPA能抑制AML-12细胞增殖（图2）.

2.3 VPA对AML-12细胞铁死亡标志蛋白的影响

GPX4、FTH、FTL为铁死亡标志蛋白，能反映细胞铁死亡程度. 模型组相比空白组GPX4、FTH、FTL荧光强度显著减弱（P<0.01）（图3（a））. VPA能下调FTH、FTL、GPX4蛋白的表达，而枸橼酸铁胺（ferric ammonium citrate，FAC）能加剧VPA下调FTH、FTL、GPX4蛋白（图3（b））.

2.4 DFO对VPA诱导的AML-12细胞活力和形态的影响

细胞形态观察结果表明（图4（a）），空白对照组细胞呈大小均一、边缘清晰的规则多角形，模型组细胞边缘模糊，细胞破碎明显，DFO给药浓度为30 μmol/L时，AML-12细胞部分恢复正常形态，DFO给药浓度为100 μmol/L时，AML-12细胞绝大多数恢复正常形态，细胞破碎情况明显减少. MTT法对AML-12细胞活力的检测结果表明，随着DFO给药浓度的增加，AML-12细胞活力基本不变. 图4（c）和图4（d）的结果表明，VPA给药后降低细胞活力，而DFO呈剂量依赖性上调细胞活力.

2.5 DFO对VPA诱导的AML-12细胞铁死亡标志蛋白的影响

免疫荧光结果如图5所示，模型组相比空白组GPX4、FTH、FTL表达显著减弱，而DFO给药组铁死亡标志蛋白呈明显上升趋势.

2.6 VPA对小鼠肝功能的影响

VPA会诱导C57BL/6小鼠肝损伤（图6），C57BL/6小鼠的正常肝脏表面红润有光泽，而在VPA刺激后，肝脏发生肿胀，颜色由红润变暗淡. HE染色结果显示，低剂量和高剂量模型组都呈现肝脏微观结构异常，肝细胞脂肪变性，胞质内含有微小的圆形空泡，为脂滴，多见炎性细胞灶性浸润，肝板细胞排列不规则. 小鼠肝脏指数和血清ALT、AST水平显示，VPA呈剂量依赖性地诱导了小鼠肝功能异常.

2.7 VPA对小鼠肝细胞铁死亡的影响

铁死亡与VPA诱导的肝损伤密切相关，如图7所示，在VPA诱导的小鼠肝损伤的过程中，小鼠肝脏表现出铁蓄积、脂质过氧化、氧化应激和铁死亡关键调节剂异常等铁死亡特征. 免疫组化的结果显示，在VPA的刺激下，肝脏组织内储铁蛋白FTH、FTL明显下调，伴有肝内铁死亡调节剂GPX4下调. 同样的，VPA还下调了FTH、FTL肝脏转录水平. 此外，与空白组相比，模型组中小鼠肝内总铁含量增加，MDA含量成剂量依赖性的上调，而GSH和SOD含量呈剂量依赖性的下调.

2.8 DFO对VPA诱导的小鼠肝损伤的影响

DFO对VPA诱导的C57BL/6小鼠肝损伤有一定的缓解作用. 如图8所示，与模型组对比，给药组呈剂量依赖性地缓解肝脏表观异常，且高剂量的DFO与阳性药组水飞蓟宾药效几乎一致. HE染色结果表明，DFO给药组和阳性药组都明显缓解肝细胞排列不规则，肝细胞破碎等情况，并且DFO对小鼠肝功能指标ALT、AST异常有一定的缓解作用.

2.9 DFO对VPA诱导的小鼠肝细胞铁死亡的影响

免疫组化如结果所示（图9），模型组中铁储存蛋白FTH、FTL下调，且铁死亡调节剂GPX4也呈下调趋势，而DFO给药组能显著提高FTH、FTL和GPX4的表达. 与此同时，模型肝脏组织中总铁含量和MDA含量均呈上调趋势，而DFO可以改善VPA诱导的总铁含量和MDA含量上调趋势.

3 讨论

本文采用VPA建立小鼠药物性肝损伤（drug-induced liver injury， DILI）模型，观察VPA对正常小鼠肝脏的影响. 谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）是判断肝损伤的重要指标^［17］. 研究结果显示，DILI模型构建成功，低剂量和高剂量的DFO能够显著降低VPA诱导的DILI小鼠体内的AST、ALT水平. HE染色结果显示，VPA组小鼠肝细胞大量坏死，伴随脂肪空泡，多有炎症细胞浸润，而DFO各剂量治疗组小鼠肝脏损伤出现一定好转.以AML-12细胞为对象的体外实验也表明低剂量和高剂量的DFO能够对VPA所致AML-12细胞损伤有缓解作用. 结合体内和体外实验结果观察，表明DFO对于VPA导致的药物性肝损伤具有治疗作用.

VPA诱导的肝损伤发病机制十分复杂，其中氧化应激是非常关键的步骤^［18-19］. 健康生物体内，氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态^［20］，但是由于多种因素导致体内的活性氧水平与抗氧化剂平衡失调，即产生氧化应激，其特征是产生自由基^［21］. SOD是机体内重要的抗氧化酶，具有清除自由基，减轻自由基对机体组织损伤的能力^［22］. GSH是生物体内绝大多数细胞中巯基的主要来源，是机体抗自由基的主要成分，在维持机体氧化还原平衡中发挥着十分重要的作用^［23-24］. MDA是生物体内自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化从而形成的产物，常用来评价机体的脂质过氧化和氧化损伤程度^［25］，体内MDA含量越高说明机体氧化损伤越严重^［26］. 本文结果显示，VPA会导致小鼠肝脏组织GSH含量和SOD活性下降，显著升高MDA含量，表明其可以导致氧化应激，从而导致药物性肝损伤. 本实验还研究了VPA对DILI铁死亡的影响. FTH和FTL是铁储存蛋白，GPX4是谷胱甘肽过氧化物酶，当细胞发生铁死亡时，GPX4活性下降，脂质过氧化物无法通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶被有效代谢，FTH和FTL使储存的Fe²⁺大量释放出来. 此时，Fe²⁺会催化更多的脂质转化为活性氧，最终导致细胞膜的破坏和细胞死亡. 此外，本文研究了FAC对VPA诱导DILI铁死亡的影响. 研究表明VPA能在体内外下调肝细胞中铁死亡相关蛋白FTH、FTL和GPX4的表达，导致肝细胞内Fe²⁺过载，并且FAC能够加重VPA对铁死亡相关蛋白的影响，而DFO可以上调FTH、FTL、GPX4的表达，缓解Fe²⁺过载，说明其可以缓解VPA所致肝细胞铁死亡.

综上所述，DFO能缓解VPA诱导的AML-12细胞和C57BL/6小鼠的药物性肝损伤. DFO能降低肝细胞Fe²⁺水平，降低细胞内氧化应激组分MDA水平，上调铁死亡信号通路水平. 本文的实验结果表明，VPA通过铁死亡通路诱导肝细胞损伤，而DFO对VPA诱导的DILI有保护作用.

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基金资助

湖北省自然科学基金资助项目(2025AFD508)

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(CZD19007)

口服头孢菌素母核生产过程关键技术及产业(HZY22045)

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