超声快速处理方法对石蜡包埋组织蛋白质、DNA及RNA的影响

Effects of ultrasonic rapid processing method on the protein, DNA, and RNA in paraffin-embedded tissues

摘要

目的 石蜡包埋组织传统处理方法耗时长，而超声快速处理方法时间短，但其对组织蛋白质、DNA及RNA的影响尚未阐明。本研究拟通过苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、免疫组织化学染色和分子病理检测探讨超声快速处理方法对石蜡包埋组织蛋白质、DNA及RNA的影响。 方法 选取乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃印戒细胞癌、肝癌及其他术后组织标本，使用已完成常规病理取材且诊断明确的剩余标本，每例标本取材2块，直径为1~3 mm，分为对照组(传统处理方法)和实验组(超声快速处理方法)。采用HE染色、免疫组织化学染色、DNA质量片段分析、荧光原位杂交-HER2基因检测、二代测序-EGFR、ALK基因检测、实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)-乳腺癌预后检测等分析超声快速处理方法对石蜡包埋组织蛋白质、DNA及RNA的影响，并与传统组织处理方法进行比较。 结果 与对照组比较，实验组可以快速有效完成组织固定、脱水、透明、浸蜡过程，大幅度节约了病理诊断前处理标本需要的时间，且HE染色、免疫组织化学染色、DNA质量片段分析、荧光原位杂交-HER2基因检测、二代测序-EGFR、ALK基因检测、real-time RT-PCR-乳腺癌预后检测的结果与对照组完全一致。 结论 超声快速处理方法可以快速有效缩短病理诊断前标本处理的时间，且不影响标本的DNA、RNA和蛋白质，可满足HE染色、免疫组织化学及分子病理检测。

Abstract

Objective The traditional processing method for paraffin-embedded tissues is time-consuming, while the ultrasonic rapid processing method has a short processing time. However, its effects on tissue proteins, DNA, and RNA remain unclear. This study aims to evaluate the effects of the ultrasonic rapid processing method on proteins, DNA, and RNA in paraffin-embedded tissues through hematoxylin and eosin (HE) staining, immunohistochemical staining, and molecular pathological detection. Methods Surgical specimens from patients with breast cancer, colorectal cancer, lung cancer, signet-ring cell gastric cancer, liver cancer, and other tumors were selected. Two tissue blocks (1 to 3 mm in diameter) were obtained from each specimen (previously processed and diagnosed by routine pathology). One block was assigned to the control group (traditional processing method), and the other was the experimental group (ultrasonic rapid processing method). Via HE staining, immunohistochemical staining, DNA quality fragment analysis, fluorescent in situ hybrid for HER2 gene expression test, second-generation sequencing for EGFR and ALK gene mutation test, real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) for prognosis detection of breast cancer etc, the difference between 2 groups was compared, and further impact of the ultrasonic rapid processing method was analyzed. Results Compared with the control group, the ultrasound-assisted rapid method efficiently completed fixation, dehydration, clearing, and paraffin embedding, significantly reducing sample preparation time before pathological diagnosis. Results of HE staining, immunohistochemistry, DNA fragment analysis, fluorescence in situ hybridization for HER2 gene, next-generation sequencing for EGFR and ALK gene, and real-time RT-PCR for breast cancer prognosis were entirely consistent with those of the control group. Conclusion The ultrasonic rapid processing method can quickly and effectively shorten the time for specimen processing before pathological diagnosis, and will not affect the DNA, RNA and proteins of the specimens. It can meet the subsequent HE staining, immunohistochemistry and molecular pathological detection.

Graphical abstract

关键词

超声快速处理方法 / 苏木精-伊红染色 / 免疫组织化学染色 / DNA质量 / RNA质量 / 分子病理检测

Key words

ultrasonic rapid processing method / hematoxylin and eosin staining / immunohistochemistry staining / DNA quality / RNA quality / molecular pathological detection

近年来，超声快速处理方法处理的石蜡组织样本已经应用到临床病理工作中，与传统的组织样本前处理流程比较，它具有处理时间短、试剂环保等优点，能提高病理诊断报告的及时率和准确率。已有研究^[1-3]表明超声快速处理方法适用于常规苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色及免疫组织化学(以下简称“免疫组化”)染色、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、荧光定量PCR、一代测序及二代测序(the next-generation sequencing，NGS)技术。但从RNA的角度分析超声快速处理方法是否对组织样本质量造成影响的研究较少。本研究拟采用HE染色、免疫组化染色、DNA质量片段分析、FISH基因检测、NGS技术、实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)-乳腺癌预后检测等分析超声快速处理方法对石蜡包埋组织中蛋白质、DNA及RNA的影响，并与传统组织处理方法进行比较，以明确超声快速处理方法是否适用于石蜡组织样本HE染色、免疫组化及分子病理检测，从而应用于临床病理工作。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅二医院临床研究伦理委员会审查批准(审批号：LYEC2024-0281)。

1.2 病理组织样本的选取

选取乳腺、结肠、胃、肺、肝等不同脏器的组织标本，组织来源包括手术切除标本33例(结肠6例，胃3例，肝6例，子宫内膜3例，肉芽组织3例，淋巴结3例，乳腺6例，肺3例)。使用已完成常规病理取材且诊断明确的剩余标本，每例标本取材2块，直径为1~3 mm，分为对照组(传统处理方法)和实验组(超声快速处理方法)。

1.3 标本处理

对照组采用的TISSUE-TEK VIP6 AI全自动组织脱水机购自日本樱花科技株式会社有限公司，脱水试剂为固定液，购自北京九州柏林生物科技有限公司，纯无水乙醇购自上海振兴化工一厂，二甲苯购自上海化学试剂有限公司，常规石蜡为美国LYCRA公司颗粒状切片石蜡。实验组采用的HT-3150型快速病理诊断前处理设备购自山东骏腾医疗科技有限公司，按处理系统设置的自动程序进行标本处理。启动仪器，调整温度为56 ℃；一体化处理液(脱水、透明)处理20 min，2次；于65 ℃浸蜡30 min。相应的脱水试剂为该公司生产的专用“病理分析前处理试剂”，其组成成分为乙醇等醇类化合物、植物提取物及生物合成剂，为不含甲醛、苯类有害致癌物质的环保型试剂，并集组织固定、脱水、透明于一体。

对照组处理流程：10%中性甲醛固定液固定 120 min；75%乙醇45 min、85%乙醇45 min、95%乙醇90 min、100%乙醇90 min、二甲苯Ⅰ 30 min、二甲苯Ⅱ 30 min、石蜡Ⅰ于58 ℃处理60 min，石蜡Ⅱ于58 ℃处理60 min、石蜡Ⅲ于58 ℃处理60 min。实验组：采用HT-3150型快速病理诊断前处理设备进行石蜡包埋组织的前处理，使用10%中性甲醛于37 ℃固定45 min(如果已固定完全，可省略该步骤)，于37 ℃缓冲(上一次组织处理所用的快速处理试剂)20 min，于50 ℃处理(新换的快速组织处理试剂)40 min；于60 ℃、 10 Kpa浸蜡(石蜡)35 min。2组标本处理完成后，于65 ℃石蜡包埋，切片，厚度3~4 μm。

1.4 HE染色

通过HE染色观察2组结肠黏膜、胃印戒细胞癌、肝组织、子宫内膜、肉芽组织、淋巴结等组织染色情况。2组染色均采用全自动染色机(日本樱花科技株式会社有限公司)完成，常规石蜡切片，于70 ℃烤箱烤片15 min，进入全自动染色程序，耗时50 min左右。自动化染色流程：二甲苯5 min，连续3次；100%乙醇3 min，连续2次；95%乙醇3 min，连续2次；自来水洗2 min；苏木精染液(Harris)5 min；自来水洗3 min；0.5%盐酸乙醇 1 s；自来水洗3 min；伊红染液30 s；85%乙醇2 min；95%乙醇2 min；100%乙醇2 min，连续2次；二甲苯2 min，连续3次。程序结束后，采用自动封片机应用胶带封片。

1.5 免疫组化染色

使用EnVison二步法试剂盒，2组均采用免疫组化染色观察检测人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)、增殖指数Ki-67、雌激素受体(estrogen receptor，ER)等的着色情况。石蜡切片脱蜡至水；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗原修复，PBS冲洗3 min，重复3次；除去PBS，切片上滴加一抗，于室温下孵育60 min，PBS冲洗3次，每次 3 min；除去PBS，组织上滴加二抗，于室温下孵育15~20 min，PBS冲洗3 min，重复3次；除去PBS，组织上滴加新鲜配置的DAB显色剂显色，水洗，苏木精复染，封片。

1.6 FISH

采用乳腺癌HER2/neu(17q12)/TOP2A(17q21)/CSP17多色检测试剂盒(广州安必平医药科技股份有限公司)，通过FISH技术检测乳腺癌组织HER2基因表达情况。切片脱蜡至水，隔水煮片25 min，于37 ℃恒温加热平台消化，于室温下2×SSC(Saline-Sodium Chloride)终止消化3 min，吹干备用，滴加探针(85 ℃变性5 min，37 ℃过夜杂交)。去橡胶、揭片，于37 ℃条件下2×SSC处理10 min，0.1NP-40/2×SSC处理5 min，于室温加入70%、90%、100%乙醇梯度脱水各3 min。暗处吹干，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，封盖玻片。

1.7 DNA质量片段分析

采用基因重排检测试剂盒(美国Invivoscribe公司)，通过PCR+毛细管电泳片段分析法(ABI3500测序仪)检测DNA质量。首先用提取试剂盒提取DNA。每反应孔加入22.5 μL PCR反应液，0.13 μL AmpliTaq Gold DNA聚合酶，2 μL DNA混匀离心后，进行PCR扩增。扩增完毕后，取0.5 μL PCR产物，0.5 μL Liz500，9 μL Hi-Di Formamide混匀分别加入96孔板中。于95 ℃变性2 min，迅速置于冰上或4 ℃冰箱5 min，准备上机检测。检测体系处理完毕后，将96孔板安装到板架上，放置到测序仪中，设置运行程序为片段分析，运行程序进行检测。

1.8 NGS-EGFR、ALK基因检测

为验证实验组是否对DNA的质量及后续NGS检测产生影响，进一步采用泛癌种59基因检测试剂盒通过NGS技术检测2例肺腺癌标本的基因突变情况。选取2例肺腺癌标本，分别按实验组和对照组的脱水处理方法制作成组织蜡块。采用DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)从福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)肿瘤组织中提取基因组DNA。超微分光光度计OneDrop^TM用于测定DNA的含量和纯度(OD260/OD280)。采用Qubit 4.0荧光计(美国Life Technologies公司)和Qubit dsDNA HS(高灵敏度)测定试剂盒(美国Invitrogen公司)测量DNA浓度。

基于Nanodrop/Qubit(N/Q)比值对DNA片段降解程度进行分级，N/Q值1~3为A级、3~6为B级、>6为C级，比值越小，表明DNA质量越好。在文库构建之前，采用CovarisM220超声波DNA破碎仪(美国Covaris公司)将DNA片段化成200~300 bp的小片段。采用安捷伦2100生物分析仪和DNA HS试剂盒(美国Agilent Technologies公司)评估DNA和文库片段大小分布。采用基于捕获的突变热点的靶向深度测序panel(北京吉因加科技有限公司，包括59个基因)检测不同类型的基因组变异，包括点突变、长短片段插入/缺失、拷贝数变异、基因融合和重排。基于RNA-Seq技术，在RNA水平上检测555个与肿瘤发生和发展相关基因的融合变体。最后，在Gene⁺Seq-2000测序系统(北京吉因加科技有限公司)上进行DNA和RNA测序。

1.9 乳腺癌预后21基因检测

采用FFPE RNA提取试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)，选取实验组和对照组石蜡组织各10片(5 μm)抽提RNA，每组4个样本，Onedrop2000测定RNA的含量和OD260/OD280。采用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统(广州吉源生物科技有限公司)评估提取的RNA质量。通过计算DV200反映RNA质量，DV200表示大于200个核苷酸的RNA片段占所有RNA片段的百分比，其占比越低，代表RNA降解程度越高，占比越高，代表RNA质量越好。

采用乳腺癌预后21基因表达检测试剂(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)，通过real-time RT-PCR检测乳腺癌组织中21个基因的mRNA表达水平。21个基因分为5组，增殖组包括MKI67、AURKA、CCNB1、MYBL2、BIRC5；侵袭组包括CTSV、MMP11；HER2组：ERBB2/GRB7；雌激素组包括ESR1、PGR、BCL2、SCUBE2；其他组包括CD68/GSTM1/BAG1；内参组包括ACTB、RPLP0、GAPDH、TFRC、GUSB。结合这些基因的表达水平按照乳腺癌复发分数模型计算出复发风险(RS)评分，并根据复发分数结合肿瘤大小、HR和HER2蛋白表达情况、淋巴结转移情况、绝经史将复发风险分为低风险、中风险、高风险(具体分级标准请参考试剂盒说明书)。通过比较对照组和实验组之间的mRNA的提取含量、OD260/OD280比值、乳腺癌复发分数以及分级来比较2组之间RNA的质量。

1.10 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，2组比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 超声快速处理方法对HE染色的影响

HE染色结果显示：实验组的标本低倍镜下，细胞核被染成蓝色，细胞质被染成红色，纤维和肌肉等呈深浅不同的红色，核浆蓝红分明，对比清晰，透明度好，与对照组无明显差异(图1A~1P)。子宫内膜腺上皮细胞、淋巴细胞、子宫内膜间质细胞轮廓清晰可辨(图1J)；肉芽组织中的淋巴细胞和中性粒细胞轮廓清晰可辨(图1L)。与对照组比较，实验组HE染色无明显差异，达到优质HE染片的要求。

2.2 超声快速处理方法对免疫组化染色的影响

免疫组化染色结果显示：在同一乳腺浸润性导管癌中，2组Ki-67染色均显示染色定位清晰，强度高，染色效果无明显差异(图2A、2B)。在同一乳腺浸润性导管癌中，2组ER染色均显示染色定位清晰，强度一致(微弱)，2组间染色效果无差异(图2C、2D)。在HER2信号强度为3+的乳腺浸润性导管癌中，2组均显示强而完整的阳性，染色效果2组间无明显差异，均可记为HER2(3+)(图2E、2F)。在HER2信号强度为2+的乳腺浸润性导管癌中，2组均显示弱/中等强度的完整/不完整的阳性，染色效果2组间无明显差异，均可记为HER2(2+)(图2G、2H)。

2.3 超声快速处理方法对FISH的影响

FISH结果显示：细胞核轮廓清晰，HER2、CEP17基因杂交信号定位准确清晰，在HER2基因扩增的乳腺浸润性导管癌中，2组HER2/CEP17≥2.0，且HER2平均拷贝数≥4.0，均判读为HER2扩增阳性(图3A~3D)。在HER2无扩增的乳腺浸润性导管癌中，2组HER2/CEP17<2.0，且HER2平均拷贝数<4.0，均判读为HER2扩增阴性(图3E~3H)。

2.4 超声快速处理方法对DNA质量的影响

PCR和毛细管电泳片段分析显示实验组和对照组在400 bp的位置都出现了峰值，表明2组之间DNA质量无明显差异，且均可以满足后续的DNA测序或PCR检测分析。代表性DNA片段分析图见图4。

2.5 超声快速处理方法对NGS检测的影响

实验组和对照组的DNA总量均合格，DNA等级均达到Ａ级(表1)，2组的DNA均符合NGS检测的要求。与对照组相比，实验组的预文库总量、插入片段长度、平均有效测序深度、基因组比对率、碱基质量≥Q30占比均合格(表１)。2100生物分析仪的结果显示，实验组和对照组提取的DNA片段均较大，并出现明显主峰，主峰位置均大于5 000 bp(附图1，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00108)，说明DNA片段的完整性保存较好。

NGS检测结果显示实验组和对照组的基因突变位点一致(表2)。基于DNA的NGS在病例1中检出EML4-ALK(E21:A20)融合(图5A)、TP53 c.725G>A (p.C242Y)点突变和ALK-PNPT1(A19:P27)融合(表2)。基于RNA的NGS检测结果显示EML4-ALK(E21:A20)融合(图5B)。基于DNA的NGS在病例2中显示EGFR c.2573T>G(p.L858R)(图5C)和TP53 c.641A>G(p.H214R)突变(表2)。因此，超声快速处理方法的FFPE标本可以用于后续的NGS检测。

2.6 超声快速处理方法对RNA的影响

对照组RNA的含量为(16 50±58) ng，实验组RNA的含量为(1 678±38) ng，实验组OD260/OD280为2.01±0.05，对照组OD260/OD280为1.98±0.06，2组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。Qsep100全自动核酸蛋白分析系统的结果显示2组提取的RNA的DV200值均大于70%(附图1，https://doi.org/10.57760/sciencedb. xbyxb.00108)，表明RNA降解程度均较低，RNA质量均较好。实验组低风险为1例(RS值为7.14)，高风险为3例(RS值分别为43.29、55.55、40.12)，对照组低风险1例(RS值为13.83)，高风险为3例(RS值分别为44.33、59.76、37.91)，风险等级一致性为100%。代表性PCR扩增图见图6。

3 讨 论

精准的临床治疗离不开精准的临床病理诊断，为了让患者尽早得到精准临床诊断，缩短组织制片时间加快发出病理诊断报告，具有重要的临床意义^[4]。既能缩短组织制片时间又不影响后续的病理相关检测，如免疫组织化学染色、分子病理检测，一直是病理专业领域非常关注的问题。

超声快速处理方法工作原理如下：HT-3150型快速病理诊断前处理设备利用超声波原理，对试剂缸中试剂进行超声波处理，加快试剂缸中试剂运动速度，使得专用试剂在短时间内均匀且全方位渗透到组织块中。并且此专用试剂是集固定、脱水、透明3个程序为一体的特殊试剂，渗透组织完成即可同步完成脱水和透明等操作，是缩短标本制片的关键步骤。此外，试剂缸采用PID智能温控(比例P、积分I、微分D)，恒温控制可保证试剂渗透均匀，避免高温引起组织收缩、溶解及抗原丢失，有效解决了后续掉片问题^[5]。本研究通过HT-3150型快速病理诊断前处理设备采用超声快速处理方法对小组织进行前期处理，与传统的方法相比大幅度缩短了组织标本前期处理时间(仅3.5 h)，能有效缩短病理报告时间。

免疫组化是当代病理诊断中最经典的辅助检查之一，也是病理诊断中不可或缺的技术手段^[6-7]。免疫组化通过抗原抗体特异性结合来捕获并标记目标蛋白质，其应用非常广泛，最为人熟知的是标记细胞来源，用于病理诊断分类。免疫组化还可进行目标蛋白质的半定量分析，用于研究组织信号通路表达情况，例如检测乳腺癌Her-2表达情况，提示后续治疗用药^[8-9]。免疫组化染色成功与否，除操作过程是否得当以外，还与石蜡标本的抗原完整性密切相关。石蜡标本保存时间过长，标本固定不加、标本细胞自溶，标本脱水不全等，均可导致免疫组化染色失败，造成病理诊断困难。本研究证实超声快速处理方法对标本的处理完全满足免疫组化对标本的要求。与传统标准的石蜡包埋标本完成的免疫组化相比，超声快速处理方法标本亦可成功且无色差呈现目标蛋白质染色。超声快速处理方法标本抗原完整性的保留的原因可能为：1)超声快速处理方法仅应用于小活检标本，标本体积小，便于完全固定与试剂渗透，避免组织自溶；2)超声快速处理方法设备中的智能恒温保证试剂均匀渗透，有助于抗原保留； 3)超声快速处理方法设备为固定、脱水、透明三位一体，均在机器内操作，直接规避了传统方法不同步骤中人工切换标本切换试剂时可能造成的失误。由此可见，超声快速处理方法在免疫组化染色中可达到预期效果，在临床小活检标本的病理诊断中值得推广应用。

本研究采用DNA片段质量分析、FISH、NGS等来进行观察超声快速处理方法对处理后标本DNA相关检测有无影响。HER2-FISH实验中发现3例样本2组之间结果均一致，且2组细胞核轮廓清晰，HER2基因信号强度一致，背景干净无干扰信号，与之前的文献^[3]报道结果一致。DNA质量片段分析也发现2组之间的差异不明显，说明超声快速处理方法处理的样本DNA样本质量合格。本研究发现了超声处理与常规处理对小标本中的蛋白质、RNA和DNA影响的一致性，但这些一致性只是对于当下的影响，对长期保存标本的影响是否一致尚不清楚，需要进一步验证。

高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称NGS，是能够一次对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。NGS技术作为重要的分子病理检测领域，它的迅猛发展为疾病的精准诊断和精准治疗提供了有利条件，从而进一步促进精准医疗的发展^[10-12]。相比常规组织处理方法，超声快速石蜡组织标本可大大缩短制片时限，从而加快病理诊断报告周期，然而对组织标本用于后续NGS检测是否存在影响的报道较少。本研究评估了超声快速处理方法的组织标本所提取的DNA以及用于NGS检测的基因突变情况，发现超声快速石蜡的组织标本提取的DNA质量(总量、降解等级)及基因突变情况(变异位点、突变频率)与常规处理的组织标本均无差异。因此，超声快速处理方法不影响组织标本应用于后续的NGS检测，但仍需要积累更多的检测数据来验证此观点。

RNA自身的不稳定性以及FFPE组织在固定过程中RNA和蛋白质之间的交联会抑制总RNA的提取^[13]。另外由于RNA酶的裂解作用，RNA很容易发生降解，导致总RNA的提取浓度降低^[14-15]。因此，评估超声处理的FFPE样本是否可行RNA检测尤为重要，目前相关报道较少。本研究采用4例乳腺癌标本，通过定量PCR技术检测乳腺癌组织中21个基因的mRNA表达水平。结果显示对照组与实验组提取的RNA的含量无显著性差异。2组之间复发风险等级一致率为100%。同时基于RNA的NGS检测中也能成功检测EML4-ALK(E21:A20)融合，说明超声快速处理方法的石蜡包埋组织可行RNA相关检测。

然而，超声快速处理方法也有一定的局限性。其最大的局限性就是适用范围有限，主要适用于内镜、穿刺活检等小标本。因其快速超声处理原则，大的组织块和含钙高的硬组织块无法在较短的时间内通过超声震荡充分浸染试剂，故此方法不能直接应用于大标本或骨组织，无法在所有病理标本类型中推广。此外，此方法高度依赖特定仪器与试剂，且仪器需提前预热并专人操作，普通病理仪器与试剂无法替代。

综上所述，超声快速处理方法仪器配合新型环保超声组织处理试剂可以快速有效完成活检组织固定、脱水、透明、浸蜡过程，大幅度节约了病理诊断前处理标本需要的时间，而且对组织蛋白质、DNA及RNA无明显影响，可满足后续HE染色及相关分子病理检测。

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基金资助

国家自然科学基金(82200019)

湖南省自然科学基金(2024JJ547)

长沙市自然科学基金(kq2403083)

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