UMOD基因变异所致常染色体显性肾小管间质性肾病的遗传学分析

Genetic analysis of UMOD gene mutation in autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease

摘要

常染色体显性肾小管间质性肾病(autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease，ADTKD)是一种罕见的常染色体显性小管间质性遗传性疾病，表现为高尿酸血症、痛风、尿浓缩功能受损和进行性肾衰竭。该病主要由尿调素(uromodulin，UMOD)基因变异引起。本文报告1个ADTKD家系，全外显子测序和Sanger测序鉴定先证者及其他患病亲属均携带UMOD基因错义变异c.761A>C(p.H254P)。美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)变异致病性分级评估该变异为疑似致病。该变异导致编码蛋白质的氨基酸序列发生改变，可能导致UMOD蛋白错误折叠和细胞内运输受损。UMOD变异与ADTKD相关，基因检测可为ADTKD早期临床诊断和治疗提供依据，在诊断罕见肾病中具有重要意义。

Abstract

Autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease (ADTKD) is a rare autosomal dominant hereditary disorder characterized by hyperuricemia, gout, impaired urinary concentration, and progressive renal failure. It is primarily caused by mutations in uromodulin (UMOD) gene. This study reports a family with ADTKD in which whole-exome sequencing and Sanger sequencing identified a missense mutation in the UMOD gene, c.761A>C (p.H254P), present in both the proband and affected relatives. According to American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) guidelines, this variant is classified as likely pathogenic. The mutation results in an amino acid substitution that may impair UMOD protein folding and intracellular trafficking. UMOD gene mutations are associated with ADTKD, and genetic testing plays a vital role in the early diagnosis and treatment of this condition, highlighting its importance in the diagnosis of rare kidney diseases.

Graphical abstract

关键词

常染色体显性肾小管间质性肾病 / UMOD基因 / 全外显子测序 / 错义变异 / 遗传学分析

Key words

autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease / UMOD gene / whole-exome sequencing / missense mutation / genetic analysis

常染色体显性肾小管间质性肾病(autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease，ADTKD)是一种罕见的常染色体显性肾小管间质性遗传性疾病^[1]。目前该病诊断主要依赖于阳性的家族史和基因测序，患病率难以准确计算。此疾病的特征为进行性肾小管间质损害、肾小管萎缩、尿浓缩功能受损、高尿酸血症和进行性肾衰竭，可不伴蛋白尿或合并微量蛋白尿^[2-3]。这些临床表现大多是非特异性的，因此ADTKD在临床中常被误诊、漏诊。由于该病的罕见性以及高漏诊率，目前针对不同国家、地理位置、种族人群及性别之间ADTKD患病率是否存在差异的报道较少。目前已鉴定出6种与ADTKD致病相关的变异基因：尿调素(uromodulin，UMOD)、肾素(renin，REN)、肝细胞核因子1B(hepatocyte nuclear factor 1-beta，HNF1B)、黏蛋白-1(mucin-1，MUC1)和另外2种罕见的致病变异，即蛋白质转运蛋白Sec61亚基α亚型1(protein transport protein Sec61 subunit alpha isoform 1，SEC61A1)和DnaJ同源亚家族B成员11(DnaJ homolog subfamily B member 11，DNAJB11)^[4-5]。UMOD蛋白，又称为Tamm-Horsfall蛋白，简称T-H蛋白，此蛋白质仅在肾中产生，在生理状态下，是尿液中含量最多的蛋白质。UMOD蛋白在肾中的作用可能为通过与蛋白激酶相互作用调节细胞黏附和信号转导，通过抑制草酸钙晶体聚集防御尿路感染和调节尿浓缩能力。ADTKD-UMOD患者通常会有高尿酸血症和痛风的临床症状，多数患者最终会发展为终末期肾病^[6]。本文对1例ADTKD患者进行疾病分析，探讨其临床表现、诊断方法以及遗传致病原因与特点的相关研究进展，以期为ADTKD早期临床诊断和治疗提供借鉴。

1 病例资料

1.1 病史资料

先证者为34岁男性(图1A，Ⅱ-1)，因“全身乏力半年，头晕3月，加重1周”于中南大学湘雅三医院住院治疗。患者有10余年乙型肝炎病史，规律服用恩替卡韦片0.5 mg(每日1次)，痛风史10余年，间断使用非布司他片进行降尿酸治疗。否认高血压、糖尿病病史，否认手术史、外伤史、输血史、药物和食物过敏史。入院时血压为116/86 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，慢性病容，心肺无特殊，全腹无压痛及反跳痛，双肾区无叩痛，双下肢无水肿。红细胞为3.04×10¹²/L、红细胞压积为28.9%、血红蛋白为95 g/L、C反应蛋白测定<5.0 mg/L、白细胞为7.3×10⁹/L。尿沉渣测定、大便常规+隐血试验未见异常。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)-DNA<10 U/mL。凝血常规和血浆D-二聚体测定结果示纤维蛋白原浓度为4.27 g/L。肝肾功能+肌酶学结果示：尿素为 17.94 mmol/L，肌酐为251 μmol，尿酸为510 mmol/L，天门冬氨酸氨基转移酶为54 U/L，球蛋白为24.9 g/L，二氧化碳结合力为18.3 mmol/L。结缔组织全套阴性。24 h总尿量为1 750 mL、24 h总蛋白为472.5 mg。肾小管功能测定结果示：尿κ-轻链为0.71 mg/L、尿λ轻链为2.61 mg/L。肾小球功能结果示：胱抑素C为2.09 mg/L，α1微球蛋白为69.6 mg/L，β2-微球蛋白为5.92 mg/L，血清前白蛋白为581 mg/L。尿渗透压为379 mOsm/kg。24 h尿酸为0.297 mmol。腹部彩色多普勒超声(以下简称“彩超”)示左肾80 mm×31 mm，右肾74 mm×36 mm，双肾实质回声增强，双肾血流信号减少。家族史显示患者父兄均有痛风病史和痛风肾病，其父已进展为尿毒症，其兄也出现肾功能不全。

1.2 遗传学分析方法

使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒提取受试者外周血基因组DNA。为寻找出患者的致病原因并对疾病进行分型，对先证者外周血基因组DNA进行全外显子组测序(whole-exome sequencing，WES)。WES由成都市贝瑞和康基因技术股份有限公司进行，包括外显子组捕获、高通量测序、普通过滤和变异注释。

保留基因组综合数据库(Genome Aggregation Database，GnomAD)显示频率小于0.001的变异。利用MutationTaster、SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)软件、CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)工具和MUpro工具对变异的致病性进行预测，当至少3个预测结果为“致病”时，保留该变异。MetaDome预测该位点对遗传变异的功能改变是否耐受。对于符合上述条件的变异，使用在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)对基因的遗传模式和临床表型进行注释，并使用美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南对其致病性等级进行分级。

UMOD参考序列和转录序列(NM_ 0033361)从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站获取。用于验证UMOD变异的引物对(UMOD正向为5'- CTCGGGCTTCAATGACAGAG-3'，反向为5'-GGTA-GAGGGTGTTGCTGTAAG-3'，退火温度为56.4 ℃)由美国IDT(Integrated DNA Technologies)公司设计。使用Biometra TOne 96G 仪器(德国Analytik Jena公司)进行聚合酶链式反应，相关产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3 遗传学分析结果

WES获得10.12 Gb数据，目标区域覆盖率为99.8%，98.9%的目标区域覆盖率在10倍以上，排除GnomAD频率超过0.001的变异或者通过MutationTaster、SIFT、CADD和MUpro预测为良性的变异。针对肾小管间质性肾病相关基因筛选其余的变异。然后，对ADTKD相关基因进行遗传学分析，以过滤患者剩余的210个变异，并鉴定出6个基因中的6个变异。结果显示了1个UMOD变异c.761A>C(p.H254P)，即UMOD基因编码序列的第761位的腺嘌呤变异为胞嘧啶，该单核苷酸的替换导致氨基酸序列发生改变，可能影响UMOD蛋白的结构与功能。对该患者的家系进一步分析，Sanger测序在先证体 (Ⅱ-1)中验证了UMOD变异，并检测了其他家族成员的基因型(图1B)。

根据ACMG的标准和指南，将UMOD变异c.761A>C(p.H254P)分类为“可能致病”(表1)。证据如下：1)UMOD变异c.761A>C变异会导致编码蛋白质第254位的组氨酸变异为脯氨酸，既往未见文献报道该变异位于热点结构域且位于已知无良性变异的关键功能域(PM1)；2)该变异并且未在GnomAD正常人数据库检出(PM2)；3)该变异在家系中多个患者检测到此变异(PP1)；4)多个生物信息学软件如SIFT、CADD、MUpro均预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响(PP3)。因此，推断UMOD变异c.761A>C(p.H254P)是先证者的遗传致病因素。

对多种物种UMOD蛋白氨基酸序列进行比对发现，该氨基酸位点由组氨酸变异为脯氨酸，且该UMOD变异位点在进化上相对保守(图1C)。MetaDome预测该位点对遗传变异的功能改变不耐受(图2)。基于UMOD蛋白模型，p.H254苯环可以与 p.S251相互作用，组氨酸被脯氨酸取代影响了与 p.S251的离子键，并可能改变相邻区域的空间结构(图3)。以上结果提示，UMOD变异c.761A>C(p.H254P)会改变UMOD蛋白的结构，可能会影响UMOD蛋白的功能，具有致病性，最终影响肾的结构与功能，导致ADTKD疾病的发生。

2 讨 论

ADTKD以肾小管间质纤维化和肾功能减退为特征，临床表现为尿浓缩功能受损、肾功能进行性减退等，患病情况严重者发展为终末期肾病。超声显示肾体积正常或偏小，无或轻微蛋白尿，伴或不伴有高血压。病理表现为肾小管基底膜增厚、间质纤维化伴肾小管萎缩等^[7]。髓质囊肿在早发性肾小管间质病变中较常见，在老年性肾小管间质病变通常不会出现。

此先证者具有小管间质性肾病的临床表现，遗传学筛查检测到1个UMOD基因变异，NM_0033361：c.761A>C(p.H254P)，ACMG分级为“可能致病”，因而诊断为ADTKD。全球已经报道了近70例ADTKD-UMOD患者，该类患者发生终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的年龄通常在20~80岁之间，男性进展为ESRD的风险较女性显著升高。目前为止，查询HGMD数据库共发现UMOD变异123种，包括110种错义变异及无义变异(少量为无义变异，4%)。在这些报告的变异中，63%的错义变异为直接改变二硫键连接性(正常UMOD蛋白中共有24个二硫键)，是通过替换48个保守的半胱氨酸残基中的1个或引入1个新的半胱氨酸残基实现的，这可能会破坏蛋白质的正常结构和稳定性。其余37%的错义变异则影响非半胱氨酸的残基。本研究中鉴定到的UMOD变异c.761A>C(p.H254P)是1个新的错义变异，蛋白质3D模型显示组氨酸被脯氨酸取代，影响了其与p.S251的离子键，这可能会改变相关区域的空间结构；Mupro则预测该变异可能会降低UMOD蛋白的稳定性。因此，此变异可能通过影响蛋白质结构和稳定性来诱导疾病的发生，但具体机制有待进一步研究。

已报道6种ADTKD致病变异基因：UMOD、REN、HNF1B、MUC1、SEC61A1和DNAJB11。最常见的变异是UMOD和MUC1。UMOD由11个外显子组成，编码UMOD蛋白，是一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，由640个氨基酸组成，包括48个半胱氨酸残基。UMOD蛋白含有1个N端信号肽，该肽包含3个表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样结构域、1个在不同物种UMOD蛋白同源物中高度保守的富含8个半胱氨酸的结构、1个透明带样结构域(zona pellucid，ZP)和1个C端区域的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定片段^[8]。大部分变异位于编码3个EGF样结构域的外显子3和4，或者位于富含半胱氨酸的位置。UMOD蛋白主要表达于髓袢升支粗段，少量表达于远曲小管起始部分的上皮细胞中，是正常生理状态下尿液中含量最多的蛋白质，主要存在于透明带结构域介导的高分子量聚合物中，在降压、预防肾结石和尿路感染以及先天免疫中发挥保护作用^{[3, 9]}。UMOD变异会通过破坏半胱氨酸残基或降低钙结合亲和力(提供结构稳定性)来阻碍二硫键的形成，使UMOD蛋白错误折叠和细胞内运输受损，从而影响UMOD蛋白的结构与功能。肾活检标本中UMOD蛋白定位的分析^[10-11]显示：髓袢升支粗段上皮细胞的细胞膜表面典型的蛋白质信号消失，并在细胞内积累成大型聚集体，这些聚集体与内质网标志物葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD，GRP78)存在共定位。电子显微镜分析结果一致表明在增多的内质网堆积中存在纤维状物质，这可能是由变异型UMOD蛋白聚集组成并提示此疾病为内质网储存疾病^[12-13]。错误折叠UMOD蛋白保留和沉积在内质网，诱导内质网应激和未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR受3条途径调控：肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)剪接X-box结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)，蛋白激酶样ER激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)靶向激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，以及激活转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)裂解为活性ATF6。研究^[14]发现：ADTKD-UMOD小鼠的ATF6通路被激活，而其他2支UPR通路未参与，且自噬相关基因受到显著抑制，错误折叠蛋白的自噬降解受损。可以推测内质网应激和UPR被激活并促进小管细胞死亡和局部炎症。ADTKD-UMOD患者血液和尿液中变异型UMOD蛋白水平显著降低，反映了变异型UMOD蛋白在细胞内的积聚，提示UMOD变异导致疾病的原因可能与UMOD蛋白折叠、成熟、运输障碍导致功能失调相关，而非缺乏UMOD蛋白所致。变异型UMOD蛋白的积累损害了肾小管上行段，导致上皮细胞的坏死或凋亡，造成尿液浓缩缺陷和肾功能的逐步丧失。

本研究中先证者前期临床表现为尿酸排泄减少，高尿酸血症，逐渐进展为痛风、痛风肾病。这一临床改变的病理生理机制可能为UMOD蛋白增加钠氯协同转运蛋白(Na⁺-Cl^- cotransporter，NCC)和钠钾氯共转运蛋白(Na⁺-K⁺-Cl^- cotransporter，NKCC)的活性和钠吸收的能力^{[3, 15-16]}。ADTKD-UMOD患者UMOD蛋白水平降低，导致钠氯协同转运蛋白和钠钾氯共转运蛋白减少，从而使钠吸收减少。轻度钠尿会导致肾小管钠及尿酸重吸收增多，导致尿酸盐的排泄分数降低，引发高尿酸血症^[17]。同时，ADTKD-UMOD患者晨尿渗透压与尿酸排泄水平呈负相关，这表明髓袢升支粗段上皮细胞功能缺陷，导致血浆体积收缩和近端小管代偿，发生尿酸重吸收增多和高尿酸血症。ADTKD-UMOD患者血清肌酐水平升高，多数患者存在高尿酸血症，通常先于肾小管间质性肾病发生。当有高尿酸血症时，应该使用别嘌呤醇或非布司他抑制尿酸生成，辅助适当的低嘌呤饮食或低钠饮食。

基因检测对单纯由基因变异所致疾病确诊具有决定性的意义，可以避免单基因遗传病ADTKD的漏诊、误诊。ADTKD及时诊断、干预治疗、长期随访，更有利于患者代谢干预调节及延缓肾功能进展的不良预后。本研究发现的UMOD，NM_0033361:c.761A>C(p.H254P)，为新错义变异，拓展了UMOD的致病变异图谱，进一步证实UMOD变异与ADTKD的相关性，有助于加深对UMOD致病性与ADTKD发病机制的理解。

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