理气活血滴丸通过抑制凋亡和坏死样凋亡通路缓解低氧诱导的人心脏微血管内皮细胞损伤

Li Qi Huo Xue Di Wan alleviates hypoxia-induced injury in human cardiac microvascular endothelial cells by inhibiting apoptosis and necroptosis pathways

摘要

目的 人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells，HCMEC)损伤会破坏心肌微循环功能，进一步诱发冠心病等重大心血管事件，严重威胁人类健康。因此探讨低氧诱导的HCMEC损伤机制具有重要意义。本研究探讨理气活血滴丸对低氧诱导的HCMEC损伤的作用及作用机制。 方法 将HCMEC低氧培养24 h建立细胞低氧损伤模型。将HCMEC分为正常对照组、低氧组、低氧+理气活血滴丸低剂量组、低氧+理气活血滴丸中剂量组、低氧+理气活血滴丸高剂量组和低氧+丹酚酸B(阳性对照)组。采用细胞增殖与毒性检测试剂3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]检测细胞活力；采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒检测细胞LDH释放率；采用丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒检测细胞MDA含量；采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8，caspase-8)试剂盒分别检测细胞SOD、CAT、caspase-3和caspase-8活性；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；采用蛋白质印迹法检测细胞坏死样凋亡相关蛋白质：受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting kinase 1，RIPK1)、磷酸化受体相互作用蛋白激酶1(phosphorylated receptor-interacting protein kinase 1，p-RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)、磷酸化受体相互作用蛋白激酶3(phosphorylated receptor-interacting protein kinase 3， p-RIPK3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)、磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein，p-MLKL)。 结果 与正常对照组比较，低氧组细胞活力显著降低(P<0.01)，细胞内MDA含量显著升高(P<0.05)，CAT、SOD活力均显著下降(均P<0.05)，细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL水平均增加(均P<0.05)。与低氧组比较，低氧+理气活血滴丸高剂量组细胞活力显著提升(P<0.01)，并且细胞内MDA含量显著降低(P<0.05)，细胞内CAT活性显著升高(P<0.05)，坏死样凋亡相关蛋白质水平显著降低(均P<0.05)。 结论 理气活血滴丸对低氧诱导的HCMEC损伤具有保护作用，其机制涉及减轻低氧诱导的氧化应激，进而减少HCMEC凋亡和坏死样凋亡。

Abstract

Objective Injury to human cardiac microvascular endothelial cells (HCMECs) compromises myocardial microcirculation and may contribute to major cardiovascular events such as coronary heart disease, posing a serious health threat. Understanding the mechanisms of hypoxia-induced HCMEC damage is thus of great clinical relevance. This study aims to investigate the protective effects and underlying mechanisms of Li Qi Huo Xue Di Wan against hypoxia-induced HCMEC injury. Methods HCMECs were cultured under hypoxic conditions for 24 hours to establish a cellular model of hypoxic injury. Cells were divided into six groups: normal control, hypoxia, hypoxia + low-dose Li Qi Huo Xue Di Wan, hypoxia + medium-dose, hypoxia + high-dose, and hypoxia + salvianolic acid B (positive control). Cell viability was assessed using the MTS assay. Lactate dehydrogenase (LDH) release and malondialdehyde (MDA) content were measured to evaluate cytotoxicity and oxidative stress. Activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), caspase-3, and caspase-8 were determined with corresponding assay kits. Apoptosis was analyzed by flow cytometry, and expression of necroptosis-related proteins, receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1) and its phosphorylated form (p-RIPK1), receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) and its phosphorylated form (p-RIPK3), mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) and its phosphorylated form (p-MLKL), was examined via Western blotting. Results Compared with the control group, hypoxia significantly decreased cell viability (P<0.01), increased MDA levels (P<0.05), and reduced CAT and SOD activity (P<0.05), accompanied by elevated apoptosis (P<0.01) and increased levels of p-RIPK1, p-RIPK3, and p-MLKL (P<0.05). High-dose Li Qi Huo Xue Di Wan significantly improved cell viability (P<0.01), reduced MDA content (P<0.05), increased CAT activity (P<0.05), and suppressed necroptosis-related protein expression (P<0.05) compared with the hypoxia group. Conclusion Li Qi Huo Xue Di Wan exerts a protective effect against hypoxia-induced injury in HCMECs. This effect is mediated by attenuation of oxidative stress, thereby reducing both apoptosis and necroptosis.

Graphical abstract

关键词

理气活血滴丸 / 人心脏微血管内皮细胞 / 低氧 / 氧化应激 / 凋亡 / 坏死样凋亡

Key words

Li Qi Huo Xue Di Wan / human cardiac microvascular endothelial cells / hypoxia / oxidative stress / apoptosis / necroptosis

冠状动脉急性持续性阻塞将造成心肌缺血缺氧，一方面直接导致心肌损伤，另一方面也会破坏血管内皮屏障的完整性，造成冠状动脉微血管损伤，引起冠状动脉微血管内皮细胞肿胀、血小板聚集进而促进微血管堵塞，进一步加重心肌损伤，严重影响受损心肌的恢复。在心肌缺血早期，冠状动脉微血管内皮细胞首先出现凋亡，随后释放促凋亡因子进一步诱发心肌细胞凋亡。凋亡是由caspase家族蛋白介导的程序性细胞死亡方式，表现为细胞皱缩、核固缩、DNA片段化和凋亡小体形成等^[1]。减轻心脏微血管损伤，修复心脏微血管内皮屏障功能是改善急性心肌梗死患者疗效和预后的有效途径^[2]。

除凋亡^[3]外，冠状动脉堵塞还会引起心脏微血管内皮细胞出现其他形式的死亡方式，如坏死样凋亡^[4]、焦亡^[5]、铁死亡^[6]等。近年来，随着对坏死样凋亡的深入研究，靶向抑制坏死样凋亡有望成为抗心肌缺血损伤的新策略。坏死样凋亡是一种兼具坏死形态与凋亡程序性调控特征的细胞死亡方式，涉及受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting kinase 1，RIPK1)/受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)/混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)信号轴激活，最终因MLKL寡聚化破坏细胞膜而导致细胞死亡，是心脏缺血性损伤的重要病理机制。据报道，从中药黄芩中提取的黄芩苷能通过抑制内皮细胞坏死样凋亡缓解心肌缺血损伤^[7]，提示抑制内皮细胞坏死样凋亡可能是治疗心肌梗死的新思路。在缺血缺氧诱导的冠状动脉微血管内皮细胞损伤中，氧化应激是触发细胞凋亡与坏死样凋亡的核心因素之一^[8]。由于传统中药普遍具有良好的抗氧化活性，因而从中药中寻找防治微血管内皮缺血损伤药物是一条理想途径。

理气活血滴丸是中国自主研发的特色民族中成药，主要成分为大果木姜子油、薤白、川芎、艾片，具有理气活血、行经止痛之功效^[9]。以往研究^[10]表明理气活血滴丸可通过抑制细胞凋亡抗动脉粥样硬化，但目前对于理气活血滴丸心血管保护作用的分子机制还了解甚少。本研究将以人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells，HCMEC)为研究对象，通过建立低氧诱导的细胞损伤模型，探讨理气活血滴丸对HCMEC的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

理气活血滴丸购自贵州民族药业股份有限公司；丹酚酸B购自成都植标化纯生物技术有限公司；HCMEC购自商城北纳创联生物科技有限公司；内皮细胞专用培养基(extra cellular matrix，ECM)购自美国ScienCell研究实验室；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自依科赛生物科技有限公司；无糖培养基购自美国Gibco公司；RIPK1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；p-RIPK1、MLKL抗体购自美国Cell Signaling Technology (CST)公司；RIPK3、p-RIPK3抗体购自武汉爱博泰克(ABclonal)生物科技有限公司；p-MLKL抗体购自美国Abcam公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所； 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]检测试剂盒购自北京普洛麦格生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒、caspase-3和caspase-8试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 药物溶液制备

由于理气活血滴丸属于复方中药，无法使用克分子浓度表示其浓度，参考其他复方中药细胞实验浓度计算方法^[11-12]，本研究采用μg/mL作为理气活血滴丸的浓度单位。取4颗理气活血滴丸(25 mg/丸)至10 mL超纯水中，超声使其充分溶解，再用0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，制成1 mg/mL的药物母液，4 ℃保存备用。同时称量7.2 mg丹酚酸B溶解于10 mL超纯水中，用0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，制成浓度为1 mmol/L的药物母液，4 ℃保存备用。使用时将药物母液按分组需求进行稀释，配制成含相应药物浓度的培养基。

1.2.2 细胞培养

将HCMEC接种于25 cm²培养瓶中，用含有10%胎牛血清的ECM培养基于37 ℃、5% CO₂培养箱内培养。每隔24 h进行换液，当细胞生长至80%~90%时，用含有0.25%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA)的胰蛋白酶进行消化传代。

1.2.3 低氧损伤模型制备

将HCMEC消化后制成单细胞悬液，将HCMEC以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，以6×10⁵个/孔的密度接种于直径为10 cm的细胞培养皿中。待孔中细胞长至80%左右进行造模，每个浓度组设置6个复孔，将完全培养基换成无糖培养基，于低氧CO₂培养箱(37 ℃，5% CO₂，1% O₂)中培养24 h。

1.2.4 实验分组

实验分为3部分。第1部分实验分为以下组别：正常对照组、不同剂量(5、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/mL)理气活血滴丸组、不同剂量(5、10、20、50、100、200、500和1 000 μmol/L)丹酚酸B组。常氧培养24 h，检测细胞活力。根据实验结果，选择理气活血滴丸和丹酚酸B(阳性药对照)合适剂量进行第2部分实验。

第2部分实验分为以下组别：正常对照组、低氧组、低氧+不同剂量理气活血滴丸组(0.5、1、5、10、20、50、100和200 μg/mL)、低氧+不同剂量丹酚酸B组(0.5、1、5、10、20、50、100和200 μmol/L)。正常对照组常氧培养24 h，其他组低氧培养24 h，检测细胞活力和LDH释放率。根据实验结果，选择理气活血滴丸和丹酚酸B合适剂量进行第3部分实验。

第3部分实验分为5组：正常对照组、低氧组、低氧+理气活血滴丸低剂量组(20 μg/mL)、低氧+理气活血滴丸高剂量组(100 μg/mL)、低氧+丹酚酸B组(100 μmol/L)。正常对照组常氧培养24 h，其他组低氧培养24 h，收集细胞进行生化、流式细胞术[为更全面体现药物的剂量依赖效应，增设了低氧+理气活血滴丸中剂量组(50 μg/mL)]和分子生物学等检测。

1.2.5 细胞活力检测

细胞活力检测按照试剂盒的操作步骤进行，简要介绍如下：低氧结束后，向培养细胞的96孔板中每孔加入10 μL MTS试剂，在37 ℃，5% CO₂的培养箱中孵育1 h，于490 nm波长处读取OD值。

1.2.6 LDH释放率测定

LDH释放率检测按照试剂盒的操作步骤进行，简要介绍如下：收集HCMEC低氧后的培养基120 µL，加入60 µL测定工作液，室温反应30 min，最后在490 nm波长处测定OD值。

1.2.7 蛋白质水平检测

蛋白质水平检测采用蛋白质印迹法，步骤如下：配制一定体积RIPA裂解液，RIPA裂解液与磷酸化蛋白酶抑制剂(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的比例为100꞉1。用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)测定蛋白质浓度，加入上样缓冲液后吹打混匀，在99 ℃下将蛋白质变性7 min。使用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离样品中的蛋白质，将蛋白质转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上。随后使用含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的Tris盐缓冲液(tris buffered saline with Tween 20，TBST)对转印完毕的PVDF膜进行封闭，用TBST洗涤3次后加入一抗，在4 ℃摇床上孵育过夜。p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、MLKL的一抗稀释比例均为1꞉1 000，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)稀释比例为1꞉10 000。一抗孵育结束后，取出PVDF膜，使用TBST洗去残留一抗，于室温中孵育对应的二抗1 h，二抗稀释比例为1꞉1 000。弃去二抗，并使用TBST洗去残留二抗，使用增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence，ECL)检测蛋白质表达，以GAPDH为内参对照。

1.2.8 细胞凋亡检测

细胞凋亡评估包括流式细胞分析以及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8，caspase-8)活性测定。

流式细胞分析：用不含EDTA的胰蛋白酶消化后于1 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min后收集细胞。用预冷的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤2次，每次洗涤完后在1 000 r/min、4 ℃下离心。吸弃PBS，加入100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞。随后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，轻轻混匀，避光，在37 ℃培养箱中反应15 min。混匀后置于冰盒中，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

Caspase-3活性检测：收集细胞后加入裂解液在冰上裂解，之后在12 000 r/min的条件下离心15 min，把上清液转移到预冷的离心管中，取少量样品用BCA法测定蛋白质浓度，按试剂盒标准加入Ac-DEVD-pNa、检测缓冲液、待测样品，待体系配置完成后，于37 ℃下孵育过夜，最后用酶标仪检测 405 nm波长下的OD值，计算caspase-3的活性。

Caspase-8活性检测：操作步骤与caspase-3检测类似，不同之处在于将Ac-DEVD-pNa换成Ac-IETD-pNa，并在405 nm波长下检测OD值，计算caspase-8的活性。

1.2.9 氧化应激水平和抗氧化能力检测

MDA是脂质过氧化物分解后形成的一种化合物，是检测氧化应激水平最常见的指标之一。SOD和CAT均是抗氧化酶，可以反映细胞内清除活性氧能力，间接反映氧化应激水平。

MDA含量检测按照试剂盒的操作步骤进行，简要介绍如下：收集细胞后加入裂解液在冰上裂解，之后在12 000 r/min条件下离心15 min，把上清液转移到预冷的离心管中，取少量样品用BCA法测定蛋白质浓度，按试剂盒标准依次加入待测样品和其他工作液，95 ℃水浴40 min，取出后冷却，4 000 r/min离心取上清，于532 nm波长处测量OD值，计算MDA含量。

SOD酶活性检测按照试剂盒的操作步骤进行，简要介绍如下：收集样本和蛋白质浓度测定同上述MDA操作步骤，按试剂盒提示依次加入待测样本和其他工作试剂，37 ℃孵育20 min，450 nm波长处测定OD值，计算SOD活性。

CAT酶活性检测按照试剂盒的操作步骤进行，简要介绍如下：收集样品步骤同上，依次加入待测样品及其他工作液，混匀后于405 nm波长处测定OD值，计算CAT活性。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准误表示。多组比较采用单因素方差分析和Tukey检验进行，2组比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 理气活血滴丸可减轻低氧诱导的HCMEC损伤

与正常对照组相比，5~1 000 μg/mL理气活血滴丸、5~1 000 μmol/L丹酚酸B均未对细胞活力产生明显影响(图1A)，提示二者细胞毒性较低。

与正常对照组比较，低氧组细胞活力显著下降 (P<0.001，图1B)，LDH释放显著增加(P<0.01，图1C)，表明细胞低氧损伤模型建立成功。在药物安全剂量范围内，本研究以较小的给药剂量(0.5 μg/mL)为起点，设置多组不同浓度的药物进行给药。MTS和LDH释放结果显示：与低氧组比较，理气活血滴丸从20至100 μg/mL，丹酚酸B从20至100 μmol/L以剂量依赖性方式提升HCMEC活力(P<0.01，图1B)，减少HCMEC的LDH释放(P<0.01，图1C)，提示理气活血滴丸可减轻HCMEC低氧损伤。根据正常条件和低氧条件下理气活血滴丸对细胞活力和损伤的量效实验结果，本研究选择20、50和100 μg/mL理气活血滴丸，100 μmol/L丹酚酸B进行后续实验。

2.2 理气活血滴丸可降低低氧诱导的HCMEC氧化 应激水平

与正常对照组比较，低氧组细胞MDA含量显著增加(P<0.05，图2A)，SOD和CAT活性显著降低(P<0.05，图2B、2C)，表明低氧可诱导HCMEC发生氧化应激。与低氧组比较，低氧+理气活血滴丸高剂量组细胞MDA含量显著降低(P<0.05，图2A)，而CAT活性显著增加(P<0.05，图2C)，表明理气活血滴丸可降低低氧诱导的HCMEC氧化应激水平。

2.3 理气活血滴丸可减少低氧诱导的HCMEC凋亡

与正常对照组比较，低氧组细胞凋亡指标Annexin-V阳性率(P<0.01，图3B)，caspase-3活性 (P<0.01，图3D)和caspase-8活性(P<0.01，图3E)显著增加，表明低氧可诱导HCMEC凋亡。与低氧组比较，低氧+理气活血滴丸高剂量组细胞Annexin-V阳性率(P<0.01，图3B)，caspase-3活性(P<0.05，图3D)明显降低，caspase-8(图3E)也降低但差异无统计学意义，提示理气活血滴丸可减少低氧诱导的HCMEC凋亡。

2.4 理气活血滴丸可减少低氧诱导的HCMEC坏死样凋亡

与正常对照组比较，低氧组细胞Annexin-V和PI双阳性率(P<0.01，图3C)、p-RIPK1(P<0.01，图4C)、p-RIPK3(P<0.01，图4E)和p-MLKL(P<0.01，图4G)蛋白质水平显著增加，表明低氧可诱导HCMEC发生坏死样凋亡。与低氧组比较，低氧+理气活血滴丸高剂量组细胞Annexin-V和PI双阳性率(P<0.01， 图3C)、p-RIPK1(P<0.05，图4C)、p-RIPK3(P<0.05，图4E)和p-MLKL(P<0.01，图4G)蛋白质水平均显著降低，提示理气活血滴丸可减少低氧诱导的HCMEC坏死样凋亡。

3 讨 论

利用HCMEC低氧模型，本研究发现：1)理气活血滴丸可降低低氧处理的HCMEC氧化应激水平； 2)理气活血滴丸可减少低氧诱导的HCMEC凋亡； 3)理气活血滴丸可减少低氧诱导HCMEC坏死样凋亡。本研究为理气活血滴丸治疗心肌梗死患者提供了新的实验依据。

心脏微血管内皮细胞是心脏血管中的主要细胞之一，对维持心脏正常生理功能至关重要。在心肌缺血早期，心脏微血管内皮细胞活性氧生成增多，而其抗氧化能力降低，导致细胞氧化应激水平升高。与文献[13]报道一致，本研究发现在低氧诱导的HCMEC中MDA含量显著升高，而抗氧化酶SOD和CAT活性显著下降，证明心脏微血管内皮细胞低氧损伤模型构建成功。研究^[14]表明理气活血滴丸治疗冠心病心绞痛患者效果显著，动物研究^[15]结果也证实理气活血滴丸可减轻小鼠心肌梗死损伤。基于传统中药普遍具有良好的抗氧化活性^[16-17]，理气活血滴丸可能通过降低氧化应激来减轻心脏微血管内皮细胞低氧损伤。本研究结果显示理气活血滴丸减少了低氧HCMEC中MDA含量，提高了其SOD和CAT活性，与预期吻合，表明理气活血滴丸可降低低氧处理的HCMEC细胞氧化应激水平。

氧化应激最终导致心脏微血管内皮细胞死亡。迄今为止，已发现多种细胞死亡方式参与缺血性心肌损伤，包括凋亡、坏死样凋亡和焦亡等，其中凋亡和坏死样凋亡的发生均与氧化应激密切相关^[18-19]。凋亡主要由外源性死亡受体途径^[20]和内源性线粒体途径^[21]介导，最终在执行阶段结束。然而，无论由哪种途径启动，都会诱导caspase-8(启动caspase)活化并激活caspase-3(效应caspase)，导致caspase活化的DNA酶(caspase-activated DNase，CAD)激活，裂解细胞核中的染色体DNA，引起染色质凝集，最终导致细胞凋亡^[22]。本研究发现在低氧孵育的HCMEC中，Annexin-V阳性率显著增加，伴随caspase-8和caspase-3活性显著升高，而理气活血滴丸组细胞Annexin-V阳性率、caspase-8和caspase-3活性均显著降低，表明理气活血滴丸能抑制低氧诱导的HCMEC凋亡，与上述文献报道一致。

基于理气活血滴丸的抗氧化作用，本研究推测理气活血滴丸还可抑制低氧诱导的HCMEC坏死样凋亡。坏死样凋亡由RIPK1/RIPK3/MLKL激酶级联反应介导，RIPK1通过一系列自身和反式磷酸化招募并激活RIPK3，激活的RIPK3随后磷酸化并激活MLKL，MLKL寡聚化并破坏细胞膜通透性，从而诱导坏死样凋亡^[23]。与预期相符，本研究发现理气活血滴丸可抑制低氧处理后HCMEC细胞p-RIPK1、 p-RIPK3和p-MLKL蛋白质水平的升高，进一步证实理气活血滴丸对心脏微血管内皮细胞低氧损伤的保护作用。阳性对照药丹酚酸B也获得了与理气活血滴丸同样的结果。作为活血化瘀中药丹参的主要活性成分，丹酚酸B可通过减少心脏血管内皮细胞氧化应激^[24]、凋亡和坏死样凋亡^[25]，促进心脏缺血区血管生成等，发挥抗心肌缺血作用。因此，本研究选择丹酚酸B作为阳性对照药。

综上所述，理气活血滴丸对HCMEC低氧损伤具有保护作用，其机制涉及抑制低氧诱导的氧化应激，进而减少HCMEC凋亡和坏死样凋亡。未来的研究将致力于解析理气活血滴丸发挥作用的关键活性成分及直接作用靶点，更深刻地理解其心脏微血管保护机制。

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基金资助

国家自然科学基金(82173815)

国家自然科学基金(81872873)

国家自然科学基金(81872873)

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