GNE基因p.V543M纯合错义突变对细胞表型的影响及其机制

Effects of a homozygous missense mutation in the GNE gene p.V543M on cell phenotype and its mechanisms

摘要

目的 UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(uridine diphospho-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase，GNE)肌病是一种进行性神经退行性变性疾病，与GNE基因的纯合或复合杂合错义突变有关。本研究旨在探讨GNE p.V543M纯合错义突变对细胞表型的影响并进行相关机制探索。 方法 基于人胚肾细胞株(human embryonic kidney 293 cell，HEK 293T)构建GNE基因野生型(WT-GNE组)和GNE p.V543M突变型(MUT-GNE组)的过表达模型。分别采用蛋白质印迹法和免疫荧光法检测GNE蛋白的表达水平和亚细胞定位。分别采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)法和结晶紫染色实验、CCK-8法、流式细胞术和Hoechst 33342/碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色、四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE)染色，评估GNE p.V543M突变对细胞黏附、增殖、凋亡、线粒体膜电位的影响。检测唾液酸合成水平及GNE双功能酶活性。采用实时聚合酶链反应检测唾液酸合成相关酶的mRNA转录水平。 结果 蛋白质印迹法结果表明过表达GNE的细胞模型建立成功。免疫荧光染色结果显示MUT-GNE组的GNE蛋白与golgin-97的共定位程度显著低于WT-GNE组(Pearson相关系数：0.65±0.08 vs 0.83±0.06，P<0.05)。与WT-GNE组相比，MUT-GNE组细胞黏附能力增强、细胞增殖能力及线粒体膜电位降低(均P<0.05)。2组细胞凋亡情况无明显差异。与WT-GNE组相比，MUT-GNE组唾液酸合成量减少，激酶活性显著降低，唾液酸生物合成相关酶的转录水平下调，差异均有统计学意义(均P<0.001)。 结论 GNE p.V543M突变可通过降低GNE酶活性及唾液酸生物合成相关酶的mRNA转录水平，影响唾液酸的合成，导致细胞表型发生改变。

Abstract

Objective Uridine diphospho-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE) myopathy is a progressive neurodegenerative disease associated with homozygous or compound heterozygous missense mutations in the GNE gene. This study aims to explore the impact of the homozygous p.V543M mutation in on cell phenotype and to gain preliminary insights into the underlying mechanisms. Methods Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells were used to construct wild-type (WT-GNE) and mutant (MUT-GNE) GNE overexpression models. Western blotting and immunofluorescence were used to assess GNE protein expression levels and subcellular localization. Cell adhesion, proliferation, apoptosis, and mitochondrial membrane potential were evaluated using the cell counting kit-8 (CCK-8) assay, crystal violet staining, flow cytometry, Hoechst 33342/propidium iodide (PI) staining, and tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) staining. Sialic acid synthesis levels and GNE enzymatic activity were measured, and the mRNA expression of sialic acid biosynthesis-related enzymes was quantified by real-time PCR. Results Western blotting confirmed successful establishment of GNE overexpression models. Immunofluorescence showed significantly reduced co-localization of GNE protein with Golgin-97 in the MUT-GNE group compared to WT-GNE (Pearson’s correlation coefficient: 0.65±0.08 vs 0.83±0.06, P<0.05). Compared with WT-GNE, cells in the MUT-GNE group exhibited increased adhesion, decreased proliferation, and reduced mitochondrial membrane potential (P<0.05). No significant differences in apoptosis were observed between groups. The MUT-GNE group showed reduced sialic acid production, significantly decreased kinase activity, and downregulated transcription of sialic acid biosynthesis-related enzymes compared to WT-GNE (P<0.001). Conclusion The p.V543M mutation in the GNE gene alters cellular phenotype by reducing GNE enzymatic activity and the transcription of sialic acid biosynthesis enzymes, ultimately impairing sialic acid production.

Graphical abstract

关键词

GNE肌病 / UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶 / p.V543M突变 / 唾液酸 / 细胞表型 / 线粒体

Key words

GNE myopathy / uridine diphospho-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase / p.V543M mutation / sialic acid / cellular phenotype / mitochondria

UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(uridine diphospho-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase，GNE)肌病是一种罕见的、在青少年晚期或成年早期起病的常染色体隐性遗传性肌病，主要特征是肌肉组织中可见无边界空泡，进行性远端肌肉无力，以及非炎性肌病表现，患者最终可能发展为严重的运动功能障碍^[1-3]。该病由9号染色体p13.3位置的GNE基因突变引起，患病率为1/100万~9/100万^[4]，目前已经发现300多种GNE致病性突变，包括错义突变、无义突变、剪接位点突变以及框移突变等^[5-7]。

GNE是唾液酸生物合成途径中的关键限速酶，在唾液酸的生成中发挥双重作用，包括将UDP-N-乙酰葡糖胺(uridine diphospho-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)转化为N-乙酰甘露糖胺(N-acetyl-mannosamine，ManNAc)的差向异构酶功能，以及将 ManNAc磷酸化为N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸(ManNAc-6-phosphate，ManNAc-6-P)的激酶功能^[8]。唾液酸是一类由神经氨酸衍生而来的9碳糖，常常以末端糖基的形式修饰细胞表面糖缀合物，其作为重要的生物信息传递分子，在许多生物过程(如细胞间相互作用、抗原决定簇的识别和信号转导)中发挥重要作用^[9-11]。GNE是唾液酸代谢途径的核心功能酶，因此GNE基因突变可导致唾液酸生成不足，进而引发GNE肌病等疾病^[12]。

笔者前期的研究^[13]在GNE肌病的1个中国汉族3代家系中，利用靶向测序、高通量测序和桑格测序，鉴定出1个GNE基因c.1627G>A(p.V543M)的纯合错义突变，且该突变与家系的疾病表型共分离；该家系中有2位成员患病，皆为女性，分别在26岁和24岁左右开始出现胫骨前肌无力，最开始表现为爬楼梯费力，下肢无力，走路呈鸭步，后期出现走路困难，起身困难，翻身困难。这是首次在GNE肌病患者中鉴定出GNE基因p.V543M的纯合错义突变，目前国内外并无针对该突变导致GNE肌病的细胞功能学实验的相关报道。本研究拟构建体外细胞模型，探究GNE p.V543M纯合错义突变对细胞表型的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞株(human embryonic kidney 293 cell，HEK 293T)获赠于中南大学湘雅三医院医学实验中心邓昊课题组，用含10%胎牛血清及100 μg/mL的青霉素、庆大霉素和链霉素的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM；江苏凯基生物技术股份有限公司)培养。

包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G获赠于中南大学湘雅三医院血液内科赵锴课题组。GNE基因的野生型(wild type，WT)和c.G1627A(p.V543M)突变型(mutant，MUT)过表达元件的穿梭质粒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-PuroR由上海优宝生物医药集团有限公司构建[GNE基因互补脱氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)序列：NM_001128227.3]。WT-GNE穿梭质粒为GNE PCDH-GFP+PURO-3xFlag-N，MUT-GNE穿梭质粒为GNE c.G1627A(p.V543M)PCDH-GFP+PURO-3xFlag-N。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒的构建和包装

将HEK 293T细胞传代到10 cm的培养皿中，生长至约80%的融合时进行转染。配制转染工作液：1 500 μL Optimem减血清培养基(苏州新赛美生物科技有限公司)中加入混合质粒(质粒比例为psPAX2꞉pMD2.G꞉WT-GNE/MUT-GNE穿梭质粒=3꞉1꞉4)共20 g、转染试剂Lipo8000(1 μg/μL；上海碧云天生物技术股份有限公司)40 g，混匀。往培养皿中加入转染工作液后将其放入含5% CO₂的37 ℃培养箱中培养过夜，隔日更换培养液。在转染完成后的48 h和72 h，分别用5×PEG-8000(德国BioFroxx公司)收集上清液。上清液在4 ℃下放置过夜，然后以12 000 r/min(4 ℃)离心20 min，得到的白色沉淀即为病毒颗粒。

1.2.2 稳定转染细胞株的筛选和GNE过表达模型的构建

应用不同浓度(0~5 μg/mL，梯度间隔为0.5 μg/mL)的嘌呤霉素(北京兰杰柯科技有限公司)筛选HEK 293T细胞，隔天更换1次含嘌呤霉素的培养基，3~5 d后，导致所有细胞死亡的嘌呤霉素最低有效浓度为最佳嘌呤霉素浓度。

采用“1/2体积感染法”，用携带FLAG标签的WT-GNE基因(WT-GNE组)和MUT-GNE基因(MUT-GNE组)的慢病毒载体分别感染24孔板中的HEK 293T细胞，构建GNE过表达细胞模型。同时，设置未携带目的基因的慢病毒感染HEK 293T作为阴性对照组(NC组)。在感染72 h后，按照筛选好的最佳嘌呤霉素浓度加入嘌呤霉素，筛选阳性细胞。48~72 h后，当荧光阳性细胞超过90%时，降低嘌呤霉素浓度至初始筛选浓度的1/2~1/4。加入含有适量嘌呤霉素的新鲜培养液，维持筛选3~7 d，当未感染慢病毒的对照组细胞全部死亡，存活下来的感染慢病毒的细胞即为阳性细胞。不断稀释阳性细胞悬液使96孔板中的每个孔内细胞数量为0~1，继续培养得到的细胞团即阳性细胞的单细胞克隆，在倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)下观察，选取有荧光的单细胞克隆扩大培养。连续培养2~3周，每天观察荧光，每间隔2 d更换1次含嘌呤霉素的培养液。完成筛选后，冻存细胞前再次采用蛋白质印迹法检测GNE的表达，确保筛选得到的单克隆细胞符合要求。

1.2.3 蛋白质印迹法

将细胞接种到6孔板上，于37 ℃，5%CO₂培养箱中培养24 h后弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次。每孔加入100 μL的放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(含1%通用型蛋白酶抑制剂；北京索莱宝科技有限公司)，用细胞刮刀刮取细胞得到细胞悬液，离心(12 000 g)10 min提取细胞的总蛋白质。在6孔板中加入含0.5% NP40(上海碧云天生物技术股份有限公司)的PBS 100 μL，用细胞刮刀刮取细胞得到细胞悬液，取出一部分放入新的试管中作为全细胞蛋白质样品；离心(8 000 g)10 s，将上清液转移到新的试管作为细胞质蛋白质样品；用冰冷的含0.1% NP40的PBS重悬沉淀，离心(8 000 g)10 s，弃上清保留沉淀，加入1×Laemmli样品缓冲液(上海碧云天生物技术股份有限公司)，用超声波破碎仪提取细胞悬液中的细胞核蛋白质样品^[14]。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒测定蛋白质浓度。取适量蛋白质溶液，于100 ℃下煮沸5 min，对蛋白质进行变性处理，随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1~2 h，加入一抗，在4 ℃下孵育过夜，用TBST缓冲液洗涤3次，然后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗，在37 ℃下孵育1 h，洗膜后加入增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显影液，避光显影后用Chem Studio显影仪系统对蛋白质条带进行成像，采用ImageJ软件进行定量分析。抗体稀释比为GNE兔抗体(1꞉3 000)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗体(1꞉30 000)、FLAG鼠抗体(1꞉10 000)、Histon H3兔抗体(1꞉20 000)、HRP二抗(1꞉10 000)。除GNE兔抗体购自英国 Biorbyt公司外，其余均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2.4 免疫荧光法

采用免疫荧光法分析GNE蛋白与高尔基体的标志性蛋白质golgin-97的共定位情况。将消化后的细胞接种到共聚焦培养皿内，在37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养24 h后，加入4%多聚甲醛溶液1 mL，于室温下固定细胞15 min，用PBS浸洗5 min，重复3次。向皿内加入1 mL 0.5% Triton X-100溶液，在室温下通透10~15 min，用PBS浸洗3次后，加5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，在室温下封闭2 h，加入一抗(用5% BSA稀释)，在4 ℃下湿盒内孵育过夜，用含0.1% Tween-20的PBST缓冲液浸洗3次。加入二抗(用PBS稀释)，在室温下避光孵育1 h，吸去二抗，用PBST浸洗3次。加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，避光孵育5~10 min，用PBST浸洗3次。加入抗荧光淬灭封片液后，通过激光共聚焦显微镜观察和采集荧光图^[15]。一抗FLAG鼠抗体(稀释比为1꞉500)和golgin-97兔抗体(稀释比为1꞉200)均购自武汉三鹰生物技术有限公司，Alexa Fluor-594羊抗兔二抗(稀释比为1꞉200)、Alexa Fluor-647羊抗鼠二抗(稀释比为1꞉200)分别购自上海百赛生物技术股份有限公司、艾比玛特医药科技(上海)有限公司。

1.2.5 细胞黏附实验

采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)法和结晶紫染色实验检测细胞黏附情况。用10 µg/mL鱼皮明胶在室温下包被96孔板1 h，向孔内加入200 μL高温高压处理的1%BSA溶液，在37 ℃下孵育1 h，将重悬的3.5×10⁴个细胞铺板在预处理过的96孔板中，在37 ℃、5% CO₂下培养过夜。用PBS轻柔洗去未黏附的细胞，重复3次。一半的实验孔每孔加入含10 μL CCK-8(美国APExBIO公司)溶液的PBS，将培养板置于培养箱内孵育1 h，用酶标仪检测450 nm波长处细胞的吸光度值，按如下公式计算细胞黏附率：细胞黏附率=(OD_黏附细胞-OD_空白对照)/(OD_总细胞- OD_空白对照)。另一半的实验孔进行结晶紫染色，用甲醇在冰上固定细胞15 min，0.1%结晶紫染液(上海国药集团)染色10~30 min，多次洗涤后干燥5~10 min，期间拍照记录。加入95%乙醇以溶解染料，将溶解后的待测样品转移至新96孔板内，在570 nm波长处测定各孔的吸光度值^[16]。

1.2.6 细胞增殖实验

将HEK 293T细胞(2 000个/孔)接种在4块不同的96孔板中，分别标记为0、1、2和3 d，将培养板放置在培养箱(37 ℃、5% CO₂)中培养。以24 h后细胞贴壁开始，继续培养细胞0~3 d，采用CCK-8法^[16-17]检测细胞增殖情况，分别测定0、1、2和3 d时在450 nm波长处的吸光度值。

1.2.7 流式细胞术

采用流式细胞术检测细胞凋亡。按照APC-Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒(上海百赛生物技术股份有限公司)说明书步骤，取1×10⁵个细胞重悬于PBS中，离心(1 000 rpm) 5 min后弃上清，收集细胞。用100 μL结合缓冲液重悬细胞，随后加入Annexin V-APC及PI染料各5 μL，温和混匀，在室温下避光孵育10~15 min。加入400 μL结合缓冲液重悬细胞，立即使用BD FACS Canto流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)检测^[18]。Annexin V-APC染料：激发光波长为633 nm，用Comp-APC-A通道检测荧光信号。PI染料：激发光波长为488 nm，用Comp-PerCP-Cy5-5-A通道检测荧光信号。

1.2.8 Hoechst 33342/PI染色

制备细胞爬片，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，固定10 min。洗涤3次后，加入混合染液[由1 mL Hoechst 33342染料(1꞉1 000)和1 mL PI染料(0.5 mg/mL)组成]，染色5 min。PBS浸泡洗涤3遍，封片后在倒置荧光显微镜下检测并拍照。

1.2.9 实时聚合酶链反应

用TRIzol提取总RNA，用微量分光光度计Nanodrop 2000(美国Thermo公司)测定RNA的浓度和纯度，按照HiScript II Q RT SuperMix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书将RNA反转录为cDNA(50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min)，按照SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书步骤进行操作，PCR扩增反应条件：预变性95 ℃ 30 s；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环，分析熔解曲线。引物序列见表1。全自动医用PCR分析仪SLAN-96P购自上海宏石医疗科技公司。以β-actin为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的表达水平^[19]。

1.2.10 线粒体膜电位检测

采用四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE)染色检测线粒体膜电位。TMRE是一种膜渗透性的阳离子荧光探针，能够特异性识别线粒体膜电位，从而富集在线粒体中，并产生明亮红橙色荧光^[20]。当线粒体膜电位下降时，TMRE聚集减少，荧光信号变弱甚至消失。用PBS洗涤6孔板中的细胞，用含Hoechst 33342染料(1꞉1 000)和TMRE工作染液(终浓度为100 nmol/L；上海百赛生物技术股份有限公司)在室温下孵育30 min，用PBS洗涤细胞2次，再次加入适量PBS，立即置于倒置荧光显微镜下观察荧光^[21]。

1.2.11 唾液酸检测

接种1×10⁶个细胞于6孔板孔内，每孔加入2 mL DMEM完全培养基。贴壁后分别更换为无血清培养基、无血清培养基+5 mmol/L唾液酸、无血清培养基+ 5 mmol/L ManNAc(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，在37 ℃、5% CO₂的条件下培养24 h后收集培养基，采用全自动生化分析仪7600(日本日立公司)及唾液酸检测试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)检测唾液酸含量。

1.2.12 GNE双功能酶活性测定

UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶活性测定。将样本与45 mmol/L Na₂HPO₄、10 mmol/L MgCl₂、 1 mmol/L UDP-GlcNAc(西安齐岳生物科技有限公司)混合，终体积为40 μL，pH值为7.5，在37 ℃下反应30 min，沸水煮1 min终止反应^[22]。加入30 μL与6 μL 0.8 mol/L硼酸盐混合，pH值为9.1，煮沸3 min；加入160 μL Ehrlich试剂(北京索莱宝科技有限公司)，继续在37 ℃孵育30 min，在578 nm波长处测定吸光度值，以确定生成的ManNAc含量。1个酶活性单位即每毫克蛋白质每分钟产生的ManNAc量(μmol)。

N-乙酰甘露糖胺激酶活性测定。100 μL的反应体系包含：60 mmol/L Tris-HCl (pH=8.1)、10 mmol/L MgCl₂、5 mmol/L ManNAc、10 mmol/L ATP、 1 mmol/L NADH、2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸、1 U丙酮酸激酶、1 U乳酸脱氢酶，以及待测样本 5~25 μg^[22]。在37 ℃下孵育20 min，加入400 μL 10 mmol/L EDTA终止反应，在340 nm波长处检测NADH的消耗量以评估酶活性。1个酶活性单位为每毫克蛋白质每分钟催化氧化1 μmol NADH。

1.3 统计学处理

所有实验均独立重复3次。数据用均数±标准差表示。采用GraphPad Prism软件9.5版本进行数据分析。采用非配对t检验比较2组间差异；采用单因素方差分析(one-factor analysis of variance，ANOVA)比较多组间差异；采用Pearson相关性分析评估2个变量的线性关系。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 GNE 过表达模型的验证及GNE的蛋白质定位

2.1.1 GNE p.V543M突变不影响GNE的蛋白质表达

蛋白质印迹法结果显示：WT-GNE组和MUT-GNE组在约80 kD位置均出现明显的蛋白质条带(GNE蛋白质分子量为79 kD)，且2组的蛋白质表达水平均显著高于NC组(均P<0.01，图1A)；NC组没有FLAG抗体标记条带，而WT组和MUT组在80 kD附近显示明显的FLAG抗体标记条带(图1B)；WT-GNE组和MUT-GNE组GNE的蛋白质表达水平差异无统计学意义(P>0.05，图1A)。这表明过表达WT-GNE和p.V543M MUT-GNE的细胞模型构建成功，GNE p.V543M突变不改变细胞内GNE的蛋白质表达水平。

2.1.2 GNE p.V543M突变影响GNE蛋白在高尔基体的分布

蛋白质印迹法结果(图2)显示：各组细胞质中GNE的蛋白质表达水平均高于细胞核。细胞质、细胞核GNE的蛋白质水平在2组(WT-GNE组与MUT-GNE组)之间的差异均无统计学差异(均P>0.05)。这提示GNE p.V543M突变不改变GNE蛋白在细胞质和细胞核中的分布。

免疫荧光法实验结果显示：WT-GNE组的GNE蛋白(绿色荧光)在细胞质中均匀分布，与golgin-97(红色荧光)存在共定位(图3A)。Pearson相关性分析结果显示MUT-GNE组的GNE蛋白与golgin-97的共定位程度显著低于WT-GNE组(Pearson相关系数：0.65±0.08 vs 0.83±0.06，P<0.05；图3B)。这提示GNE p.V543M突变可减少GNE蛋白在高尔基体的驻留。

2.2 GNEp.V543M突变对细胞表型的影响

2.2.1 GNE p.V543M突变增强细胞黏附

CCK-8法和结晶紫染色实验结果(图4)均显示：NC组与WT-GNE组之间细胞黏附能力差异无统计学意义(均P>0.05)；MUT-GNE组细胞的黏附能力显著高于WT-GNE组和NC组(均P<0.05)。

2.2.2 GNE p.V543M突变抑制细胞增殖

细胞增殖实验结果(图5)显示：MUT-GNE组细胞增殖能力显著低于NC组和WT-GNE组(均P<0.001)。

2.2.3 GNE p.V543M突变不影响细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示3组间凋亡细胞的比例无明显差别(图6A)。Hoechst 33342/PI染色结果显示WT-GNE组和MUT-GNE组间细胞凋亡情况相似(图6B)。实时聚合酶链反应结果显示：WT-GNE组和MUT-GNE组间细胞凋亡相关蛋白质caspase 3和caspase 9的mRNA水平差异均无统计学意义(均P>0.05，图6C)。

2.2.4 GNE p.V543M突变降低线粒体膜电位

TMRE染色结果(图7)显示：与NC组相比，WT-GNE组和MUT-GNE组的荧光强度均显著升高(均P<0.001)，而MUT-GNE组的荧光强度低于WT-GNE组(P<0.05)。这提示过表达GNE可增加细胞的线粒体膜电位，而GNE p.V543M突变可部分拮抗该效应。

2.3 GNEp.V543M突变影响细胞功能的机制

2.3.1 GNE p.V543M突变导致分泌型唾液酸水平降低

唾液酸检测结果显示：WT-GNE组的唾液酸水平显著高于NC组(P<0.01)，而MUT-GNE组的唾液酸水平显著低于WT-GNE组和NC组(均P<0.01，图8A)。这表明过表达WT-GNE可增加唾液酸水平，而过表达MUT-GNE则导致唾液酸水平降低。

当分别添加5 mmol/L唾液酸和5 mmol/L ManNAc干预后，MUT-GNE组原本下降的唾液酸水平回升(图8B、8C)。这表明外源性唾液酸和ManNAc的补充均能有效弥补由于GNE p.V543M突变导致的唾液酸合成不足。

2.3.2 GNE p.V543M突变导致GNE激酶活性下降

通过美国国家生物技术信息中心数据库查询GNE双功能酶氨基酸序列并绘制其结构域示意图，GNE p.V543M纯合错义突变位于GNE蛋白激酶结构域(图9)。为深入探究该突变对GNE蛋白功能的影响，进一步检测GNE双功能酶活性。就差向异构酶活性而言，WT-GNE组与NC组、MUT-GNE组与NC组之间差异均无统计学意义(均P>0.05，图10A)。与NC组相比，WT-GNE组的激酶活性显著升高(P<0.001)；与WT-GNE组相比，MUT-GNE组的激酶活性显著降低(P<0.001，图10B)。这提示过表达WT-GNE可增加激酶活性，而GNE p.V543M突变可降低GNE激酶活性。

2.3.3 GNE p.V543M突变影响唾液酸生物合成相关酶的转录水平

实时聚合酶链反应结果(图11)显示：与WT-GNE组相比，MUT-GNE组的唾液酸生物合成相关酶UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶1(uridine diphospho-N-acetylglucosamine phosphorylase 1，UAP1)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶1样1(uridine diphospho-N-acetylglucosamine phosphorylase 1-like 1，UAP1L1)、肾素结合蛋白(renin binding protein，RENBP)和N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶(N-acetylneuraminic acid pyruvate lyase，NPL)的mRNA水平均显著降低(均P<0.001)。这提示GNE p.V543M突变可能通过干扰唾液酸生物合成相关酶mRNA的转录，进一步抑制唾液酸的合成。

3 讨 论

GNE蛋白在不同组织中的分布呈现差异，骨骼肌中含量最为丰富，其次是肝组织和肾组织^[23]。由于GNE肌病患者十分罕见，原代肌细胞传代受限且转染难度大，本研究选择高转染效率的HEK 293T细胞进行GNE p.V543M突变的研究。GNE蛋白通常定位于细胞质、高尔基体及细胞核中，尤其在细胞质中高度表达，主要执行酶活性功能，即将UDP-GlcNAc转化为唾液酸合成的前体物质^{[15, 24]}。本研究发现 p.V543M MUT-GNE蛋白与高尔基体特异性驻留蛋白golgin-97的共定位显著减少，突变的GNE蛋白可能因错误折叠而丧失高尔基体驻留能力。高尔基体作为糖链末端唾液酸化的主要场所^[25]，可能因为 p.V543M MUT-GNE蛋白在高尔基体的驻留减少，从而影响唾液酸的合成和功能。

唾液酸不仅是细胞表面的重要修饰成分，其多样化的生物学功能在免疫调控、细胞黏附、信号转导和病原体感染中均具有重要作用^[26]。唾液酸代谢异常与多种疾病(如GNE肌病、癌症及感染性疾病)密切相关，是潜在的治疗靶点^[27-28]。本研究结果发现：GNE p.V543M突变不影响GNE差向异构酶活性，但显著降低GNE激酶活性，从而减少分泌型唾液酸的合成。这与Grover等^[29]的研究结果一致。此外，本研究发现补充外源性唾液酸和外源性ManNAc均有利于纠正唾液酸的下降，这提示补充唾液酸或唾液酸前体ManNAc 可预防或延缓由GNE p.V543M突变导致的GNE肌病表型的发展。

唾液酸通过修饰细胞表面的糖蛋白和糖脂，影响细胞黏附分子(如整合素、选择素等)的功能，从而调控细胞间的黏附和细胞-基质的相互作用^[30]。已有研究^[29]表明GNE突变会导致细胞膜和细胞质蛋白质的低唾液酸化。当低唾液酸化的关键细胞表面膜蛋白整合素β1受纤连蛋白(整合素β1受体配体)刺激时，其发生构象变化，迁移到细胞膜并与纤连蛋白结合，进而诱导黏着斑的形成并激活下游信号级联反应，最终导致细胞黏附能力增强^[29]。本研究结果同样发现，GNE p.V543M突变导致细胞黏附增加，证明GNE p.V543M突变可能因低唾液酸化而影响了细胞的黏附能力。除此之外，唾液酸通过多种机制影响细胞增殖，其生物学作用主要涉及细胞表面分子的修饰、信号转导及生长因子活性的调节。例如唾液酸可通过修饰表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，增加EGF的稳定性，提高其与受体的结合效率，从而增强信号转导，刺激细胞增殖^[31]。唾液酸过表达(超唾液酸化)与生长信号的过度激活相关^{[30, 32]}。本研究发现GNE p.V543M突变细胞的增殖能力显著降低，这可能是由于低唾液酸化下调了生长因子活性进而导致细胞增殖减缓。对一些神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病及肌萎缩侧索硬化症)而言，线粒体的改变和功能障碍是重要的病理特征^[33]。本研究发现，GNE p.V543M突变显著降低了细胞线粒体膜电位。这与既往研究^{[16, 34]}中GNE突变会使特异性肌细胞发生线粒体损伤的发现一致。尽管有报道^[34-35]称GNE突变会诱导细胞凋亡，但本研究发现GNE p.V543M突变并不会显著增加细胞的凋亡。唾液酸可通过平衡促细胞凋亡信号和抗细胞凋亡信号，维持细胞的动态稳态，低唾液酸水平有可能诱导细胞凋亡增加，但细胞凋亡的调控是十分复杂的，不同的GNE突变蛋白诱导的细胞凋亡途径存在差异。研究^[35-36]表明GNE p.R193C突变和GNE p.V727M突变会诱导内质网应激和未折叠蛋白反应相关的蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)激活，进而导致细胞凋亡。

综上所述，GNE p.V543M突变会降低GNE激酶活性，从而直接影响唾液酸的合成。低唾液酸水平可能会进一步导致细胞表型改变，如细胞黏附增加、细胞增殖减慢及线粒体膜电位下降。以上发现有助于揭示GNE肌病的病理机制，也为GNE肌病的诊断和治疗提供了新的思路。此外，本研究存在一定的局限性，如缺乏动物层面的实验支持，未来的研究需要进一步阐释GNE p.V543M纯合错义突变是否会导致动物的神经退行性病变。

实验操作，数据采集与分析，论文撰写与修改；吴娉芸、杨琪、宛雪婷 数据采集与分析，论文修改；吴苑 实验设计与指导，论文修改。所有作者阅读并同意最终的文本。

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