自然妊娠、辅助生殖妊娠自然流产与流产组织染色体异常的关联

Association between spontaneous abortion and chromosomal abnormalities of products of conception from spontaneous and ART-conceived pregnancies

摘要

目的 染色体异常是发生自然流产(spontaneous abortion，SA)的最常见原因。本研究旨在分析SA与流产组织染色体异常的关联，并比较不同的妊娠方式和不同的流产次数对流产组织染色体异常的影响，以期为临床咨询提供参考。 方法 选择2019年1月至2023年12月于江南大学附属妇产医院(无锡市妇幼保健院)就诊的SA患者共1 345例。根据妊娠方式分2组：自然妊娠组(S组，n=1 242)、辅助生殖妊娠组(ART组，n=103)。按流产次数将S组的1 242例患者进一步分为自然妊娠偶发性流产组(S-1组，n=780)、自然妊娠复发性流产组(S-2组，n=462)，将ART组的103例患者进一步分为辅助生殖妊娠偶发性流产组(ART-1组，n=68)、辅助生殖妊娠复发性流产组(ART-2组，n=35)。采用染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技术对流产组织进行染色体分析。 结果 S-1组和S-2组染色体数目异常的发生率分别为56.79%(443/780)和52.38%(242/462)，染色体结构异常的发生率分别为4.36%(34/780)和7.36%(34/462)，染色体结构异常发生率组间差异有统计学意义(P<0.05)。在自然妊娠SA病例中，随着流产次数的增多，染色体数目异常的发生率逐渐降低，流产≥4次组的染色体数目异常发生率明显低于流产1次、2次组(均P<0.05)；流产1、2、3、≥4次组的染色体结构异常发生率分别为3.46%、5.65%、5.88%、4.35%，组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；致病性拷贝数变异(pathogenic copy number variants，pCNVs)+可能致病性拷贝数变异(likely pathogenic copy number variants，LP-CNVs)的发生率在流产次数1~3次组中逐渐升高，且1次组与2次组之间差异有统计学意义(P<0.05)。ART-1组和ART-2组染色体数目异常的发生率分别为47.06%(32/68)和37.14%(13/35)，染色体结构异常发生率分别为2.94%(2/68)和11.43%(4/35)，组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。S-1与ART-1组、S-2与ART-2组之间染色体数目异常发生率、染色体结构异常发生率的差异均无统计学意义(均P>0.05)。 结论 染色体数目异常和染色体结构异常在自然妊娠、辅助生殖妊娠SA患者中均有较高的发生率。在遗传学查因中应重视复发性流产患者。

Abstract

Objective Chromosomal abnormalities are the most common cause of spontaneous abortion (SA). This study aims to analyze the association between SA and chromosomal abnormalities in products of conception, and to compare the impact of different pregnancy modes and different numbers of previous abortions on chromosomal abnormalities, providing clinical consulting references. Methods A total of 1 345 SA patients treated at the Affiliated Women’s Hospital of Jiangnan University (Wuxi Maternity and Child Health Care Hospital) between January 2019 and December 2023 were enrolled. According to the mode of conception, patients were divided into 2 groups: a spontaneous pregnancy group (S group, n=1242) and an assisted reproductive technology (ART)-conceived group (ART group, n=103). Based on the number of miscarriages, the S group was further subdivided into a spontaneous sporadic abortion group (S-1 group, n=780) and a spontaneous recurrent abortion group (S-2 group, n=462); the ART group was subdivided into an ART sporadic abortion group (ART-1 group, n=68) and an ART recurrent abortion group (ART-2 group, n=35). Chromosomal microarray analysis (CMA) was performed on products of conception. Results The incidence of numerical chromosomal abnormalities was 56.79% (443/780) in the S-1 group and 52.38% (242/462) in the S-2 group, while the incidence of structural abnormalities was 4.36% (34/780) and 7.36% (34/462), respectively. There was a statistically significant difference in structural abnormalities between the 2 groups (P<0.05). Among the spontaneous pregnancy SA cases, the incidence of numerical abnormalities decreased with increasing numbers of miscarriages, and was significantly lower in the group with ≥4 miscarriages compared to those with 1 or 2 miscarriages (both P<0.05). The incidence of structural abnormalities in groups with 1, 2, 3, and ≥4 miscarriages was 3.46%, 5.65%, 5.88%, and 4.35%, respectively, with no statistically significant differences among groups (all P>0.05). The incidence of pathogenic copy number variants (pCNVs) plus likely pathogenic copy number variants (LP-CNVs) gradually increases in the group with 1-3 miscarriages, and there was a statistically significant difference between the group with 1 miscarriage and the group with 2 miscarriages (P<0.05). In the ART group, the incidence of numerical abnormalities was 47.06% (32/68) in ART-1 and 37.14% (13/35) in ART-2, while structural abnormalities occurred in 2.94% (2/68) and 11.43% (4/35), respectively, with no significant differences between the groups (both P>0.05). There were no statistically significant differences in the incidence of numerical or structural abnormalities between the S-1 and ART-1 groups, or between the S-2 and ART-2 groups (all P>0.05). Conclusion Chromosomal numerical and structural abnormalities are common in SA patients from both spontaneous and ART-conceived pregnancies. Attention should be paid to patients with recurrent miscarriage in genetic investigation.

关键词

自然流产 / 染色体异常 / 拷贝数变异 / 染色体微阵列分析 / 自然妊娠 / 辅助生殖妊娠

Key words

spontaneous abortion / chromosomal abnormalities / copy number variants / chromosomal microarray analysis / spontaneous pregnancy / assisted reproductive technology-conceived pregnancy

自然流产(spontaneous abortion，SA)指在妊娠28周之前，因自然(非医源性)因素导致在胚胎或胎儿具有生存能力以前终止妊娠^[1]。SA的发生率占所有妊娠的15%~20%^[2]，是常见的妊娠并发症。SA分偶发性流产(仅发生1次)和复发性流产(连续发生2次或2次以上)2类^[3]。引起流产的原因包括：女方的染色体或基因异常、解剖结构异常(包括先天性和获得性)、自身免疫性疾病、血栓前状态(prethrombotic state，PTS)、内分泌因素、感染性因素、心理因素，男方因素及环境因素等^[4]。染色体异常是SA最常见的原因，SA胚胎中染色体异常比例可达50%~60%^[5-6]。在染色体异常中，染色体数目异常占85%~90%，包括整倍体和非整倍体异常，以16/18/21三体和X染色体单体为主^[7]。目前，虽有一些关于SA次数与染色体异常关联的研究^[8-11]报道，但结论不一致。对于不同妊娠方式(自然妊娠和辅助生殖妊娠)下发生的SA与染色体异常的关联，更是鲜见报道。因此，本研究回顾性分析自然妊娠和辅助生殖妊娠下发生SA的病例资料，采用染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技术对流产组织进行染色体分析，旨在探讨SA次数与流产组织染色体数目和结构异常之间的关系，并比较2种妊娠方式流产组织的染色体异常发生率。

1 资料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得江南大学附属妇产医院(无锡市妇幼保健院)伦理委员会批准(审批号：2024-06-0515-16)，并且所有患者均签署知情同意书。

1.2 资料

选择2019年1月至2023年12月于江南大学附属妇产医院(无锡市妇幼保健院)就诊的SA(排除全身性感染、外力、负重等因素导致的SA)患者共1 345例。收集患者一般资料包括年龄、受孕方式、SA次数、流产时的孕周。根据妊娠方式分2组：自然妊娠组(S组，n=1 242)、辅助生殖妊娠组(ART组，n=103)。按流产次数将S组的1 242例患者进一步分为自然妊娠偶发性流产组(S-1组，n=780)、自然妊娠复发性流产组(S-2组，n=462)，将ART组的103例患者进一步分为辅助生殖妊娠偶发性流产组(ART-1组，n=68)、辅助生殖妊娠复发性流产组(ART-2组，n=35)。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集

采集SA后的流产组织(新鲜绒毛或胚胎组织)20 mg和静脉全血血液样本2 mL。

1.3.2 基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，按照试剂盒说明书对SA患者的静脉血及绒毛或胚胎组织分别进行基因组DNA的提取。检测DNA的浓度、纯度及完整性。

1.3.3 母源污染的检测

选取染色体2、4、5、7、8、10、11、12、13、15、16、18、X、Y上高杂合度的17个位点设计引物。采用天昊生物医药科技(苏州)有限公司生产的人类个体识别检测PCR试剂，对样本(绒毛或胚胎组织和SA患者血液)DNA进行多重荧光PCR扩增，用毛细管电泳分析17个多重荧光PCR产物。扩增区域内重复序列的重复次数不同导致短串联重复序列(short tandem repeat，STR)位点的等位基因分型差异，在电泳分离后，通过荧光检测可区分不同的基因型。排除被母血污染的绒毛或胚胎组织。

1.3.4 CMA

采用CMA技术对流产后的绒毛或胎儿组织进行染色体分析。应用香港中文大学设计，美国安捷伦公司生产的高分辨的CMA芯片8×60K(CGH+SNP)。所得原始数据均应用Agilent CytoGenomics分析软件进行分析。以≥100 kb(Marker≥50)的分辨率分析基因组拷贝数变异(copy number variations，CNVs)；以≥5 Mb (Marker≥50)的分辨率分析纯合区域(runs of homozygosity，ROH)。

染色体异常情况分析采用的数据库包括Pubmed、Database of Genomic Variants、DECIPHER、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)、ClinVar、ClinGen、UCSC Genome Browser等。

根据《染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用指南(2023)》^[12]和2019年美国医学遗传学与基因组组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)和ClinGen协作组对基因组拷贝数变异解读的共识^[13]，将拷贝数变异分为5类：致病性CNVs(pathogenic CNVs，pCNVs)、可能致病性CNVs(likely pathogenic CNVs，LP-CNVs)、临床意义不明CNVs(variants of unknown significance CNVs，VOUS-CNVs)、可能良性CNVs、良性CNVs。

1.4 统计学处理

使用Graphpad Prism(6.0版)软件对数据进行分析。服从正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较使用两独立样本t检验；计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ²检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组年龄、孕龄的比较

偶发性流产的S-1组的年龄明显小于复发性流产的S-2组[(30.21±0.15)岁 vs (31.37±0.21)岁，P<0.05]，自然妊娠的S-1组和S-2组的年龄均分别小于辅助妊娠的ART-1组、ART-2组(均P<0.05)；S-1组的孕周明显大于ART-1组[(70.05±0.58) d vs (65.50±1.83) d， P<0.05；附图1，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00022]。

在1 242例自然妊娠SA患者中，流产1、2、3、≥4次的患者分别有780、354、85、23例，流产次数越多的患者年龄越大，流产1次、2次患者的流产孕周均显著大于流产3次患者(均P<0.05；附图2，https://doi. org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00022)。

2.2 自然妊娠偶发性SA、复发性SA的染色体异常情况比较

1 242例自然妊娠SA患者流产组织CMA检测结果见表1。S-1组(偶发性流产)和S-2组(复发性流产)染色体数目异常的发生率分别为56.79%和52.38%，染色体结构异常的发生率分别为4.36%和7.36%，前者2组间的差异无统计学意义(P>0.05)，后者2组间的差异有统计学意义(P<0.05)。S-1组发生最多的染色体数目异常是常染色体三体，发生率为28.97%。S-2组发生率排列前3的染色体数目异常类型依次为常染色体三体(28.35%)、嵌合数目异常(10.17%)、三倍体(8.44%)。

S-1组的性染色体单体发生率均明显高于S-2组，但其CNVs重复发生率、pCNVs发生率均明显低于S-2组(均P<0.05，表1)。SA-1组pCNVs中CNVs片段大于10 Mb的占比(9/27，33.33%)明显低于SA-2组(16/26，61.54%)。

2.3 自然妊娠不同流产次数的染色体异常情况比较

在1 242例自然妊娠流产病例中，随着流产次数的增多，染色体数目异常发生率逐渐降低，流产4次及以上组的染色体数目异常发生率明显低于流产1次、2次组(均P<0.05，表2)。

在1 242例自然妊娠流产病例中，不同流产次数组之间染色体结构异常发生率的差异均无统计学意义(均P>0.05，表2)。

pCNVs+LP-CNVs发生率在流产次数1~3次组中逐渐升高，且1次组与2次组之间差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.4 辅助生殖妊娠偶发性SA、复发性SA的染色体异常情况比较

103例辅助生殖妊娠SA患者流产组织的CMA检测结果见表3。ART-1组(偶发性流产)和ART-2组(复发性流产)染色体数目异常的发生率分别为47.06%和37.14%，染色体结构异常的发生率分别为2.94%和11.43%，差异均无统计学意义(均P>0.05，表3)。2组之间pCNVs+LP-CNVs和VOUS的差异亦均无统计学意义(均P>0.05，表3)。

2.5 自然妊娠和辅助生殖妊娠SA的染色体异常情况比较

自然妊娠的S-1组与辅助生殖妊娠的ART-1组、自然妊娠的S-2组与辅助生殖妊娠的ART-2组之间在染色体数目异常和染色体结构异常发生率方面的差异均无统计学意义(均P>0.05，表4)。

3 讨 论

SA胚胎染色体异常率为50%~60%，不同研究因检测方法和纳入样本的不同结果略有差异^[14-15]。在本研究中，自然妊娠的偶发性流产与复发性流产相比，染色体数目异常发生率相近，染色体数目异常类型构成方面，除性染色体单体发生率SA-1组明显高于SA-2组外，其余类型的染色体数目异常如常染色体三体、嵌合数目异常等的发生率都相近，这与以往研究^[16]报道的结论相符。除染色体数目异常外，染色体结构异常也是SA的遗传学病因之一。本研究中的自然妊娠S-1、S-2组染色体结构异常发生率分别为4.36%、7.36%，2组之间的差异有统计学意义，与文献[17]报道的0~11%的范围接近。在染色体结构异常中，S-1组的CNVs重复发生率明显低于S-2组，同时，S-1组的CNVs缺失合并重复、单亲二倍体(uniparental disomy，UDP)发生率亦均低于S-2组，尽管差异无统计学意义。该现象可能与亲本之一有染色体平衡易位等结构异常有关^[18]。本研究中自然妊娠偶发性流产组的UPD发生率为0.38%，与Levy等^[19]研究的0.3%接近。目前普遍认为，UPD的发生与配子互补、单体复制及三体自救有关，其中三体自救是UPD发生的主要机制，约占19%^[20-21]。

对CNVs按ACMG指南进行致病性分类后，自然妊娠S-1组的pCNVs发生率明显低于S-2组，pCNVs中S-1组CNVs片段大于10 Mb的占比明显低于S-2组，提示染色体结构异常可能与夫妇一方有平衡易位导致胚胎染色体不平衡CNVs有关。在复发性流产中可能还存在其他未知因素影响pCNVs的发生，有待后续进一步探究。

在自然妊娠的病例中，随着流产次数的增加，染色体数目异常发生率呈下降趋势，流产≥4次组的染色体数目异常发生率明显低于流产1次、2次组，这与研究^[22-24]报道的结论相符。但本研究发现流产次数越多的孕妇年龄越大。研究^[25]认为染色体数目异常是导致胚胎早期发生SA的最主要原因。随着孕妇年龄的增长，胚胎染色体异常的发生率增加，这可能与染色体减数分裂阶段易发生错配、重组、纺锤体着丝粒异常，以及线粒体数量和功能异常有关^[26]。尽管年龄的增长会增加染色体异常的发生风险，但在复发性流产的病例中，往往还存在其他非胚胎染色体异常的因素。随着孕妇流产次数的增多和年龄的增长，病因更加复杂^[25]。本研究结果显示：流产1次、2次组的流产孕周均显著大于流产3次组。这与武彩云等^[27]的研究结论相符，提示多次人工流产或药物流产可能导致子宫内膜容受性降低，蜕膜面积减少，宫颈功能受损以及宫腔感染风险增加，从而增加胚胎早期丢失的风险。

在本研究的自然妊娠流产病例中，不同流产次数组之间染色体结构异常发生率的差异均无统计学意义；流产1次组的pCNVs+LP-CNVs发生率明显低于流产2次组。有研究^[28]报道低龄女性pCNVs的发生率明显高于高龄女性。但顾崇娟等^[29]通过对1 514例SA绒毛染色体进行CMA，发现不同SA次数的pCNVs发生率差异无统计学意义。对于SA次数与胚胎pCNVs的关系，研究结果不一致，尚有待积累更大样本量的多中心研究来证实。

本研究发现：自然妊娠的S-1组与辅助生殖妊娠的ART-1组、自然妊娠的S-2组与辅助生殖妊娠的ART-2组之间在染色体数目异常和染色体结构异常发生率方面的差异均无统计学意义。这与刘丽等^[30]报道的一致。荆霞等^[31]对164例自然妊娠和辅助妊娠流产绒毛组织染色体核型进行分析，发现自然妊娠和辅助生殖妊娠流产绒毛组织染色体核型异常发生率分别为53.93%和66.67%，差异无统计学意义。

在本研究的辅助生殖妊娠流产病例中，尽管ART-1组和ART-2组在染色体数目异常、染色体结构异常、pCNVs+LP-CNVs、VOUS发生率4个方面的差异均无统计学意义；但是，ART-1组染色体数目异常率高于ART-2组，而染色体结构异常发生率却低于ART-2。这与侯东霞等^[28]的研究结果相符。随着女性年龄的增长，其卵巢功能也逐渐减退，体内激素水平降低，内聚蛋白的凝聚力逐渐耗竭，导致染色体凝聚不稳定及纺锤体结构紊乱，有丝分裂染色体碱基对分离不完全或者不分离，进而增加非整倍体的风险^[32-33]。

本研究发现自然妊娠的S-1组和S-2组的年龄均分别小于辅助生殖妊娠的ART-1组、ART-2组。这可能与以下原因相关：接受辅助生殖技术治疗的患者主要为因不孕症女性，其中许多因职业、经济或婚姻原因推迟生育年龄，导致生殖功能(如卵巢储备功能)减退。经历了多次流产及不良孕产后的患者在尝试自然妊娠失败后，可能最终选择辅助生殖技术助孕，这使得这类患者的平均年龄偏高^[34]。在流产时的孕周方面，S-1组明显大于ART-1组，S-2组与ART-2组比较差异虽无统计学意义，但S-2组亦高于ART-2组。这可能因自然妊娠的胚胎常通过自然选择形成，胚胎质量较高，发育更符合生理条件，因此流产多发生在孕早期8周以后。相较之下，辅助妊娠的胚胎可能因技术干预(如取卵、体外培养、冷冻复苏)或患者自身原因(如高龄、子宫内膜容受性差、胚胎发育潜力不足等)更容易在早孕期6~8周出现发育停滞或流产^[35]。辅助生殖妊娠流产患者常通过动态监测早期人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)和B超确认妊娠，这使得早期流产(如生化妊娠)更容易被记录，而自然妊娠组中一些早期流产事件可能因未被发现或未纳入统计而被忽略。

该研究存在的局限性：首先，辅助生殖妊娠组招募的病例数较少，未能进一步评估不同流产次数的染色体异常发生率情况；其次，对于pCNVs和LP-CNVs，还需进一步评估基因型与表型的相关性；最后，对染色体数目、结构均正常的SA病例，要进一步分析内分泌功能、凝血功能、免疫功能、感染等相关因素。

综上，不论是自然妊娠，还是辅助生殖妊娠的SA患者，都有较高的胚胎染色体异常发生率，临床上应重视查找遗传学病因。

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基金资助

江苏省妇幼保健科研项目(F202205)

无锡市医学创新团队项目(CXTD2021016)

无锡市“双百”中青年医疗卫生拔尖人才项目(BJ2023082┫。This work was supported by the Maternal and Child Health Research Project of Jiangsu Province ┣F202205)

the Wuxi Medical Innovation Team Project(CXTD-2021016)

the Program of “Double Hundred” Young and Middle-aged Top Talents in Medical and Health Care of Wuxi(BJ2023082)

RIGHTS & PERMISSIONS

开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0)的方式，在任何媒介以任何形式复制、传播本作品(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。