单次和双次富血小板血浆治疗卵巢储备功能减退的疗效

Efficacy of single and double platelet-rich plasma treatment for diminished ovarian reserve

摘要

目的 研究报道富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)治疗能改善女性卵巢功能，但其使用剂量和频次与治疗效果的关系尚不明确。本研究旨在评估单次和双次PRP治疗卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve，DOR)的疗效。 方法 选取2020年9月至2022年10月湘潭市中心医院生殖中心收治的DOR患者65例，随机分为4组：单次PRP治疗组(21例，PRP治疗1次)、双次PRP治疗组(15例，PRP连续治疗2次)、空白对照组(15例)、人工周期对照组(14例，雌孕激素治疗)。比较4组患者治疗前后基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平、窦卵泡数(antral follicle count，AFC)、卵巢体积，行单精子卵细胞质内注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期前后的获卵数、MII卵母细胞数、优质胚胎数及妊娠情况的差异。 结果 与治疗前相比，单次和双次PRP治疗组的FSH水平均显著降低，AFC、卵巢体积、获卵数和MII卵母细胞数均显著增加(均P<0.05)；与空白对照组相比，单次和双次PRP注射组治疗后的FSH水平降低，AFC、获卵数及MII卵母细胞数均增加(均P<0.05)，单次和双次PRP注射组的优胚率、临床妊娠率和活产率均大于空白对照组及人工周期对照组，但差异均无统计学意义(均P>0.05)；与单次PRP注射组相比，双次PRP注射组的FSH水平更低，AFC更多，但差异均无统计学意义(均P>0.05)。 结论 单次和双次PRP卵巢注射均能有效改善DOR患者的卵巢储备功能，提高卵巢反应性；与单次PRP卵巢注射相比，双次PRP卵巢注射在改善卵巢储备功能方面有取得更好效果的趋势。

Abstract

Objective Platelet-rich plasma (PRP) treatment has been reported to improve ovarian function in women, but the relationship between the dose and frequency of PRP treatment and its therapeutic effect remains unclear. This study aims to evaluate the efficacy of single and double PRP treatments for diminished ovarian reserve (DOR). Methods A total of 65 patients treated at the Reproductive Center of Xiangtan Central Hospital from September 2020 to October 2022 were randomly divided into 4 groups: A single PRP treatment group (21 patients, PRP treatment once), a double PRP treatment group (15 patients, PRP treatment twice), a blank control group (15 patients), and an artificial cycle control group (14 patients, treated with estrogen and progesterone). The differences in baseline follicle-stimulating hormone (FSH), antral follicle count (AFC), ovarian volume, number of oocytes retrieved, number of good quality embryos, and pregnancy outcomes before and after treatment were compared among the 4 groups. Results Compared to before treatment, both single and double PRP treatment groups showed a significant reduction in FSH, and an increase in AFC, ovarian volume, numbers of oocytes retrieved, and number of MII oocytes (all P<0.05). Compared to the blank control group, the single and double PRP groups showed a decrease in FSH, with an increase in AFC, number of oocytes retrieved, and number of MII oocytes (all P<0.05). The rates of good quality embryos, clinical pregnancy rate, and live birth rate in the single and double PRP groups were higher than those in the blank control group and artificial cycle control groups, but the differences were not statistically significant (all P>0.05). Compared to the single PRP treatment group, the double PRP group had lower FSH and higher AFC, but the differences were not statistically significant (both P>0.05). Conclusion Both single and double PRP ovarian injections can effectively improve ovarian reserve function in DOR patients and enhance ovarian response. Compared to single PRP ovarian injection, double PRP ovarian injection shows a trend of better improvement in ovarian reserve function.

关键词

卵巢储备功能减退 / 富血小板血浆 / 卵巢储备 / 性激素 / 单精子卵细胞质内注射

Key words

diminished ovarian reserve / platelet-rich plasma / ovarian reserve / sex hormones / intracytoplasmic sperm injection

卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve，DOR)又称卵巢储备功能不良或卵巢储备功能低下，是指由于卵巢内库存卵泡的数量减少和/或质量下降，导致卵巢功能不足，引起抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)水平降低、窦卵泡数(antral follicle count，AFC)减少、基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平升高等卵巢储备功能指标变化，使生育力下降^[1]。DOR患者在不孕女性中占10%。随着社会发展，女性受教育程度、职场地位和压力的升高，越来越多的女性推迟婚育时间；同时伴随二胎、三胎政策的开放，高龄女性的生育需求增加，女性生殖高龄化成为趋势。在这部分女性中，DOR的发病率更高，DOR的治疗已成为生殖领域亟待解决的重大课题。在辅助生殖中，DOR的治疗重点在于提高生育力及改善妊娠结局。常用的治疗方法有脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)、辅酶Q10、维生素C和维生素E等抗氧化治疗及雌孕激素替代疗法，然而DOR患者仍存在周期取消率高、获卵数少、胚胎质量差、可移植胚胎少、需进行多个促排卵周期、妊娠结局不良等后果^[2-4]。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是由新鲜血液离心后制备的血小板浓度高于正常血浆5~10倍的血小板浓缩物，血小板中的α颗粒激活后会释放大量细胞因子，包括血小板衍生因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等^[5-6]。PRP通过释放这些细胞因子在伤口愈合、组织再生修复、促血管生成和抗细胞凋亡方面发挥重要作用^[2]。Roy等^[7]在猪缺血创面模型中证明PRP能通过释放VEGF激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)途径，参与内皮细胞有丝分裂，促进创面血管生成；Qian等^[8]通过2型糖尿病大鼠模型和大鼠皮肤缺损模型，证明PRP凝胶能增强间充质干细胞的趋化性，并能通过加速胶原沉积、血管生成和神经修复来促进伤口愈合；Patel等^[9]在豚鼠膝骨关节炎模型中证明PRP的多次注射可以通过其抗凋亡作用和增加细胞外基质中蛋白聚糖含量而发挥软骨保护作用^[7-9]。还有研究^[10-13]报道卵巢内注射PRP可改善低生育力女性的卵巢功能及辅助生殖技术妊娠结局，但关于PRP的使用剂量和频次与治疗效果的关系尚未明确。本研究旨在探讨单次和双次PRP治疗DOR的疗效，为PRP治疗DOR的临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得湘潭市中心医院生殖医学伦理委员会批准(审批号：Sz-20220203)，所有患者治疗前均已签署知情同意书。

1.2 一般资料

选取2020年9月至2022年10月湘潭市中心医院生殖中心收治的65例DOR患者，随机分为4组：单次PRP治疗组(21例，PRP治疗1次)、双次PRP治疗组(15例，PRP连续治疗2次)、空白对照组(15例)、人工周期对照组(14例，雌孕激素治疗)。纳入标准：年龄25~45岁；卵巢储备功能检查示AFC<7且AMH<1.10 ng/mL；有生育要求者。排除标准：FSH>25 U/L者；卵巢切除者；合并性腺发育不全、严重宫腔粘连者；合并严重肝、肾、心脑血管、血液系统疾病或有传染性疾病者；严重子宫内膜异位症患者；染色体结构异常者；内分泌功能障碍患者；自身免疫性疾病患者；配偶存在男性不育因素的患者等。4组患者年龄、体重指数(body mass index，BMI)、AMH水平、FSH水平、AFC及卵巢体积差异均无统计学意义(均P<0.05，表1)。

1.3 治疗方法

4组患者在诊断为DOR后均接受辅酶Q10、DHEA、维生素E、护卵汤等辅助用药。单次PRP治疗组患者于月经干净后第3~7天行双侧卵巢PRP注射术，将1.5 mL PRP与100 μL激活剂混匀后，在阴道B超引导下向双侧卵巢内各注射1.5 mL，具体为穿刺针进入卵巢皮质最深处边注射边退针，进行三点注射，术后平卧30 min。双次PRP治疗组患者注射方法同单次PRP治疗组，连续治疗2个月经周期。空白对照组患者不予其他治疗。人工周期对照组患者给予补佳乐2 mg口服，每天2次，服用21 d，之后予醋酸甲羟孕酮片10 mg口服，每天1次，共10 d；4周为1个疗程，连续治疗2个疗程。

PRP的制备：用2支均加了3 mL抗凝枸橼酸葡萄糖溶液(anticoagulant citrate-dextrose，ACD)的20 mL注射器抽取患者肘静脉血至20 mL，采用二次离心法制备自体PRP。第1次以300 g离心10 min，分为3层(从上至下分别为血浆层、白细胞血小板层及红细胞层)，抽取上中层至新离心管中，第2次以700 g离心10 min，分为上层(血清)、下层(PRP)，用1 mL移液器共抽取下层1.5 mL PRP备用。另用2个1 mL注射器各抽取100 μL PRP激活剂备用。

1.4 观察指标

观察4组患者治疗前和治疗后1个月的基础FSH水平、卵巢体积(卵巢体积=长径×左右径×前后径×0.523)、AFC，行单精子卵细胞质内注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期治疗前后2个月内的获卵数、MII卵母细胞数及优质胚胎数(胚胎质量为7I、8I、9I及囊胚评级3BB以上的胚胎)，以及治疗后1年内的胚胎移植情况和妊娠状态。

1.5 统计学处理

采用SPSS 26.0统计学软件分析数据。服从正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组内治疗前后比较采用配对t检验，组间术前术后比较采用单因素方差分析。非正态分布的计量资料以中位数(第1四分位数，第3四分位数)表示，比较采用秩和检验。计数资料以频数(率)表示，比较采用χ²检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组患者治疗前后卵巢储备功能指标比较

与治疗前比较，单次PRP治疗组和双次PRP治疗组治疗后FSH水平降低、AFC和卵巢体积均增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)；空白对照组治疗前后FSH水平、AFC和卵巢体积无明显差异(均P>0.05)；人工周期对照组治疗后FSH水平降低、卵巢体积增加，但差异均无统计学意义(均P>0.05)，治疗后AFC增加，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.2 行ICSI周期的4组患者治疗前后的卵巢储备功能指标比较

4组治疗前后均行ICSI周期的患者分别有12、8、9、7例。结果显示单次PRP治疗组和双次PRP治疗组患者治疗后获卵数、MII卵母细胞数均增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)，治疗后可利用胚胎数及优质胚胎数与治疗前比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，空白对照组和人工周期对照组患者治疗前后获卵数、MII卵母细胞数、可利用胚胎数和优质胚胎数差异均无统计学意义(均P>0.05，表3)。

2.3 4组患者妊娠结局比较

4组中进行胚胎移植的患者分别有10、6、5、9例。单次PRP治疗组临床妊娠率为40.0%，活产率30.0%；双次PRP治疗组临床妊娠率为50.0%，活产率16.7%；空白对照组临床妊娠率为20.0%，活产率0%；人工周期对照组临床妊娠率为22.2%，活产率11.1%。虽然4组临床妊娠率及活产率差异均无统计学意义(均P>0.05)，但有单次PRP治疗组和双次PRP治疗组>人工周期对照组>空白对照组的趋势。

3 讨 论

DOR导致生育力下降及性激素分泌不足等症状，其病因及发病机制暂不清楚，可能与遗传、免疫、医源性及环境等因素相关^[14]。目前尚无治疗此类患者的特效手段，激素补充治疗可改善患者的临床症状，其通过刺激性腺轴的正常工作从而推动卵泡的生长、发育及排卵，但存在发生乳腺癌、子宫内膜增生性病变、血栓性疾病及心血管事件等风险^[15]，DHEA、辅酶Q10、维生素C和维生素E等抗氧化治疗可在一定程度上改善卵巢储备功能，促进患者生育^[2-4]，但不能从根源上恢复患者卵巢功能。

PRP是由新鲜血液制备而成的浓缩物，含有大量细胞因子(如VEGF、转化生长因子、EGF、结缔组织生长因子等)，具有强大的组织修复作用，已在骨科、眼科、整形外科等多个医疗领域中展现优势^[16-17]。近年来，有研究者提出在卵巢内注射PRP来激活卵巢，如Sills等^[10]将PRP注射到DOR患者的卵巢，每隔2周记录AFC、AMH和雌二醇水平，结果显示所有患者AMH水平增加、FSH水平下降或两者均有，获得了(5.3±1.3)个MII卵母细胞；Melo等^[11]进行的一项非随机临床研究结果提示：与对照组相比，接受PRP治疗的DOR患者FSH水平、AMH水平和AFC均有显著改善。在本研究中，单次PRP治疗组和双次PRP治疗组治疗后FSH水平、AFC、卵巢体积、获卵数及MII卵母细胞数均显著优于空白对照组，提示PRP能改善卵巢储备功能及提高卵巢反应性。

细胞因子是卵巢生理功能的关键调节因子，特别是在卵泡发生和排卵方面，它们有助于创造支持卵泡选择和生长的环境。细胞因子紊乱会对卵泡成熟、排卵和黄体形成等一系列过程造成影响^[18]。PRP通过释放多种具有促进血管生成的活性细胞因子，改善卵巢血运和微环境，抑制颗粒细胞的凋亡和卵泡闭锁，提高线粒体活性，促进卵泡发生和成熟，从而改善卵巢储备功能。研究^[19-21]表明：与外周血单个核细胞单独移植比较，PRP结合外周血单个核细胞卵巢内移植后卵巢组织血管生成标志物CD34和VEGF表达量增加，促进卵巢血管内皮细胞的增殖和内皮细胞向组织内基质迁移，进而促进血管形成；与空白对照组比较，PRP结合外周血单个核细胞治疗组B细胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表达增加，Bcl-2相关蛋白(Bcl-2-associated X，BAX)表达下降，颗粒细胞的凋亡减低。在针对PRP外泌体的研究中，Chen等^[22]证明PRP外泌体中富含1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)，可通过S1P1受体/蛋白激酶B/纤维连接蛋白结合蛋白1信号通路促进血管生成。此外PRP激活后会释放生长因子TGF-β1，PRP可通过TGF-β1参与卵泡膜细胞、颗粒细胞和卵母细胞之间的相互作用，从而调节卵泡存活和细胞凋亡，并与VEGF协同调节血管生成^[23]。Moulavi等^[24]在对绵羊卵母细胞体外成熟及随后的受精和胚胎发育模型的研究中发现PRP能显著提升卵母细胞的线粒体活性，有利于卵母细胞核成熟及囊胚培养。上述研究表明PRP疗法通过多种机制提升卵子质量，改善DOR患者临床结局。

一项2 256名PRP卵巢内注射治疗DOR患者的荟萃分析^[25]结果表明：PRP治疗能促进DOR患者的主要生育参数的改善，包括AMH水平、FSH水平、AFC、获卵数和胚胎数。本研究中，PRP治疗组相对于空白对照组，FSH水平、AFC、获卵数及MII卵母细胞数差异均具有统计学意义，表明PRP卵巢内注射能有效改善DOR患者卵巢储备功能，与上述研究结果相符。关于年龄对PRP治疗的影响，Garavelas等^[26]在对满足博洛尼亚标准的不同年龄DOR患者的分组研究中证明PRP治疗对22~45岁DOR患者均有效，因此本研究在样本数有限的条件下选择较大的年龄跨度进行患者招募。若要进一步阐述年龄对PRP疗法的影响，需要加大样本量进行分组研究。研究^[27]表明在体外受精方式上，对于MII卵母细胞，ICSI单精子注射较传统体外受精有更高的受精率和成囊率，因此本研究使用ICSI进行所有卵子的体外受精。此外本研究结果表明双次PRP卵巢注射患者的FSH水平、AFC高于单次注射的患者，但差异均无统计学意义。其取得优势的原因可能为PRP注射到卵巢后血小板释放的各种细胞因子往往不会在卵巢组织中停留太长时间，重复的PRP卵巢注射可增强PRP促进细胞增殖、血管增生及组织再生的作用^[6]。其没有统计学意义的原因可能为：1)连续2次PRP卵巢注射的叠加效果不够明显，需要连续3次甚至更多次PRP卵巢注射才能产生相较于单次注射更明显的效果。Melo等^[11]对46名DOR患者进行连续3个月的PRP卵巢内注射治疗，结果表明3次注射后平均FSH降值为5.5(4.9，6.3) U/L，AFC升值为3.0(3.0，3.5)，高于本研究的结果；但是临床妊娠率和活产率分别为23.9%和8.7%，低于本研究结果，这可能与本研究样本数较少及随访时间较短有关。2)从窦前卵泡发育至成熟卵泡大约需要3个月的时间，因此理论上在PRP注射后的前3个月内将达到最大效果^[6]。Sfakianoudis等^[12]的研究表明在PRP注射后3个月内DOR患者的平均AMH增值和FSH降值持续增加，并在第3个月达到最高，但本研究仅比较了术后第1个月的相关数据，未来可将观察时间延长至3个月。

关于治疗后1年内的妊娠结局，虽然4组临床妊娠率及活产率差异均无统计学意义，但有单次PRP治疗组和双次PRP治疗组>人工周期对照组>空白对照组的趋势。Melo等^[11]研究结果显示PRP组的化学妊娠率(26.1% vs 5.4%，P=0.02)和临床妊娠率(23.9% vs 5.4%，P=0.03)显著高于对照组，但活产率差异无统计学意义(8.7% vs 2.7%，P=0.38)，这表明PRP卵巢注射主要通过增加卵泡的数量来增加卵巢储备，是否提高卵泡的质量仍需进一步研究。

总之，本研究探讨了单次和双次PRP治疗DOR的临床疗效，结果显示单次和双次PRP卵巢注射均能降低FSH水平，增加AFC、获卵数和MII卵母细胞数，表明PRP能改善卵巢储备功能及提高卵巢反应性，但若需阐明PRP卵巢内注射是否能改善妊娠结局及PRP卵巢注射的最佳次数仍需扩大样本量和延长随访时间。目前PRP仍然缺乏统一的制备方式和质量管理标准，不同文献对PRP中血小板浓度等条件要求不一，后续制定相关的PRP质量管理标准也是改进实验研究和提升PPR卵巢注射临床适用性的方向。此外，改善卵巢储备功能的分子机制尚未完全阐明，后续可进行相关基础研究以进一步探讨PRP的作用机制。

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基金资助

湖南省科技创新计划项目(2021SK52404┫。This work was supported by the Science and Technology Innovation Project of Hunan Province)

湖南省科技创新计划项目(China ┣2021SK52404)

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