黄芪皂苷IV调控miR-21抑制Notch信号通路对骨质疏松症大鼠BMSCs成骨分化的影响

Effect of astragaloside IV on osteogenic differentiation of BMSCs in osteoporotic rats via regulation of miR-21 and inhibition of the Notch signaling pathway

摘要

目的 骨质疏松症的核心病理是骨吸收超过骨形成，因此促进成骨成为关键的治疗策略。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化是骨形成的基础。黄芪皂苷IV(astragaloside IV， A-IV)作为中药黄芪的主要活性成分，其促进成骨的分子机制仍有待研究揭示。本研究旨在探讨A-IV对骨质疏松症大鼠BMSCs增殖与成骨分化的影响，并通过分析微RNA(microRNA，miR)-21与Notch2的表达变化，深入阐明其分子机制。 方法 成熟雌性SD大鼠经1周适应性喂养后，随机分为假手术(Sham)组(n=4)和卵巢切除术(ovariectomy，OVX)组(骨质疏松症模型组；n=8)。术后12周分离、培养大鼠股骨髓腔内提取的BMSCs，并分为S-BMSCs组(来源于Sham组)、O-BMSCs组(来源于OVX组)和A-BMSCs组(来源于OVX组)，S-BMSCs组和O-BMSCs组的BMSCs使用成骨诱导培养基诱导其成骨分化，A-BMSCs组的BMSCs添加A-IV进行干预后诱导其成骨分化。采用流式细胞术鉴定S-BMSCs组和O-BMSCs组BMSCs的细胞表面间充质干细胞标志物CD29和造血干细胞标志物CD34的表达水平，确认间充质干细胞特性。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测BMSCs增殖活性。采用茜素红染色定量分析钙结节形成情况。采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测评估成骨分化水平。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)检测成骨相关基因[矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)]和miR-21的表达变化，并通过蛋白质印迹法分析Runx2、OPN和Notch2蛋白质表达情况。 结果 流式细胞术结果显示O-BMSCs组的BMSCs仍然符合BMSCs的细胞表面标志物特征。A-IV可显著促进骨质疏松症大鼠BMSCs的增殖(P<0.05)，并增强ALP活性，上调成骨分化Runx2和OPN基因和蛋白质表达水平(P<0.05)。且miR-21与Notch2存在靶向结合关系，A-IV能促进miR-21的表达，并抑制Notch信号通路关键受体Notch2蛋白表达水平(P<0.05)。 结论 A-IV通过上调miR-21的表达，抑制Notch信号通路关键蛋白质Notch2的表达，从而解除Notch2对骨质疏松症来源BMSCs成骨分化的抑制作用，促进其向成骨分化。

Abstract

Objective The core pathology of osteoporosis lies in bone resorption exceeding bone formation; thus, promoting osteogenesis is a key therapeutic strategy. The osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) forms the biological basis of bone formation. Astragaloside IV (A-IV), a major active component of Astragalus membranaceus, is known to enhance osteogenesis, but its precise molecular mechanisms remain unclear. This study aims to investigate the effects of A-IV on the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs from osteoporotic rats and to elucidate its molecular mechanism through the regulation of microRNA-21 (miR-21) and Notch2 expression. Methods After 1 week of adaptive feeding, mature female SD rats were randomly divided into a sham-operated (Sham) group (n=4) and an ovariectomized (OVX) group (n=8) to establish an osteoporosis model. Twelve weeks after surgery, BMSCs were isolated from femoral bone marrow and cultured. Cells were divided into a S-BMSCs group (from Sham), an O-BMSCs group (from OVX), and an A-BMSCs group (from OVX-derived BMSCs treated with A-IV). S-BMSCs and O-BMSCs were induced for osteogenic differentiation using osteogenic induction medium, whereas A-BMSCs were treated with A-IV before induction. Flow cytometry was used to identify mesenchymal stem cell surface markers (CD29) and hematopoietic stem cell marker (CD34) to confirm BMSC characteristics. Cell proliferation was assessed using the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Alizarin red staining was performed to quantify calcium nodule formation, and alkaline phosphatase (ALP) activity assays were used to evaluate osteogenic differentiation. Real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) was used to detect changes in osteogenic-related genes, runt-related transcription factor 2 (Runx2) and osteopontin (OPN), as well as miR-21 expression. Western blotting was performed to assess Runx2, OPN, and Notch2 protein expression. Results Flow cytometry confirmed that O-BMSCs retained the phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells. A-IV significantly enhanced the proliferation of BMSCs from osteoporotic rats (P<0.05), increased ALP activity, and upregulated the mRNA and protein expression of Runx2 and OPN (P<0.05). Bioinformatic and experimental analyses demonstrated that miR-21 directly targeted Notch2. A-IV treatment increased miR-21 expression while suppressing Notch2 protein expression and inhibiting activation of the Notch signaling pathway (P<0.05). Conclusion Astragaloside IV promotes the osteogenic differentiation of BMSCs derived from osteoporotic rats by upregulating miR-21 expression and inhibiting the key Notch signaling protein Notch2, thereby relieving the Notch2-mediated suppression of osteogenesis.

Graphical abstract

关键词

黄芪皂苷IV / 骨质疏松症 / 骨髓间充质干细胞 / 成骨分化 / Notch信号通路

Key words

astragaloside IV / osteoporosis / bone marrow mesenchymal stem cells / osteogenic differentiation / Notch signaling pathway

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征的中老年常见骨骼疾病，髋部骨折患者术后1年生存率仅为80%^[1]，其发病机制主要涉及骨代谢平衡失调，表现为破骨细胞骨吸收活性增强和/或成骨细胞骨形成功能减弱，最终导致骨形成-吸收偶联失衡和骨微结构损伤^[2-3]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，不仅是成骨细胞和骨细胞的主要前体来源，更是维持骨组织稳态的关键细胞群体^[4]。近年研究^[5-6]发现：BMSCs的谱系定向分化紊乱，特别是向脂肪细胞而非成骨细胞分化，是OP的重要病理基础，而年龄相关的BMSCs功能衰退则是老年性OP发生和发展的核心环节。

微RNA(microRNA，miR)在中医药调控BMSCs成骨分化过程中扮演关键调控角色^[7]。其中，miR-21作为重要的骨代谢调节因子，在骨质疏松状态下呈显著低表达特征，其表达上调可有效改善骨代谢异常^[8-9]。研究^[10]表明：在OP动物模型中，miR-21通过特异性靶向S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，Skp2)基因抑制破骨细胞生成，展现出潜在的治疗价值。开发miR-21纳米递送系统可通过增强BMSCs的成骨分化能力促进骨质疏松性骨折修复^[11]。值得注意的是，骨质疏松状态下BMSCs内miR-21表达水平明显下调，而通过外源性手段恢复miR-21的表达可显著促进成骨分化进程^[12]。Notch信号通路作为骨组织发育和稳态维持的关键调控网络，其成员Notch2具有抑制细胞增殖和分化的作用^[13-14]。生物信息学预测分析发现，miR-21与Notch2存在特异性结合位点，提示miR-21可能通过负向调控Notch2表达来促进BMSCs成骨分化，进而影响OP的病理进程。

基于中医“肾藏精，主骨生髓”的理论基础，肾精亏虚可导致骨髓失养、骨量减少，最终引发OP^[15]。BMSCs作为骨髓微环境的核心功能单元，其生物学特性与中医“肾精”功能高度契合，成为中医药防治OP的重要作用靶点。中医药以其独特的优势在治疗骨科疾病中发挥重要作用。黄芪作为临床治疗OP的常用中药，其活性成分黄芪皂苷IV(astragaloside IV，A-IV)属于环烷型三萜糖苷类化合物，具有促进干细胞增殖和分化的药理活性^[16-17]。临床研究^[18]显示含黄芪的中药复方可显著提升OP患者的骨密度并改善临床症状。与此同时A-IV可以抑制破骨细胞的形成，并与加压力学模型结合促进前成骨细胞株OCT-1的成骨分化^[19]。然而，A-IV调控OP来源的BMSCs成骨分化的具体分子机制尚未完全阐明，有待深入揭示。本研究旨在探讨A-IV对OP大鼠BMSCs增殖与成骨分化的影响，并通过分析miR-21与Notch2的表达变化，深入阐明其分子机制。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得湖南中医药大学第二附属医院动物伦理委员会批准(审批号：MDL2022-10-14-02)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠OP模型的构建

成熟雌性SD大鼠经1周适应性喂养后，随机分为假手术(Sham)组(n=4)和卵巢切除术(ovariectomy，OVX)组(n=8)。手术器械经高压蒸汽灭菌进行无菌操作。采用OVX建立SD雌性大鼠OP模型，OVX组大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(2 mL/kg)麻醉，于卵巢下方约0.5 cm处结扎并离断卵巢血管及输卵管，完整摘除双侧卵巢。Sham组大鼠仅切开腹腔暴露卵巢，并在卵巢周围切除等体积脂肪组织。术中用生理盐水冲洗创面，并局部应用适量青霉素预防感染，随后还纳腹腔脏器，逐层间断缝合肌层及皮肤。术后常规饲养12周，检测显示OVX组血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平显著高于Sham组，证实OP模型构建成功。每组随机选取4只大鼠，无菌条件下分离股骨用于BMSCs提取。

1.2.2 大鼠股骨BMSCs的分离、培养及成骨诱导分化与干预

无菌条件下分离双侧后肢股骨，彻底去除附着肌肉及软组织，暴露完整骨组织。用手术钳固定股骨，切除一端骨骺以开放骨髓腔，使用含15%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)的α型最低必需培养基(alpha-minimum essential medium，α-MEM)冲洗骨髓腔，直至骨腔呈灰白色，收集冲洗液至离心管。以5 000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀重悬于10 mL完全培养基，接种于培养瓶并置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

原代培养期间，每3 d半量更换新鲜培养基，定期观察细胞形态及贴壁情况。待细胞融合为80%~90%时，以0.25%胰酶消化传代，持续培养至第3代。采用流式细胞术鉴定BMSCs的细胞表面间充质干细胞标志物CD29和造血干细胞标志物CD34的表达水平(CD29⁺/CD34^-)，确认间充质干细胞特性。

将传至第3代的BMSCs随机分为3组。假手术(sham BMSCs，S-BMSCs)组：收集Sham组大鼠股骨髓腔内BMSCs，使用成骨诱导培养基(PD-008，pricella)诱导其成骨分化；OP模型OVX(ovariectomy BMSCs，O-BMSCs)组：使用成骨诱导培养基诱导OVX组大鼠股骨髓腔BMSCs成骨分化；A-IV干预(A-IV BMSCs，A-BMSCs)组：OVX组大鼠股骨髓腔BMSCs添加A-IV(MCE公司，No：84687-43-4)进行干预后，使用成骨诱导培养基诱导成骨分化；3组细胞均于相同条件下培养，定期检测成骨分化标志物，并进行组间比较。

1.2.3 细胞活性检测

将各组BMSCs以5×10³/孔的密度接种于96孔板，分别给予不同浓度A-IV(0、10、20、40、80 μg/mL)处理，每个浓度设3个复孔。培养至预定时间后，每孔加入四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液[5 mg/mL，生工生物工程(上海)股份有限公司，E606334]，于37 ℃、5% CO₂条件下继续孵育4 h。小心吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解甲臜结晶，37 ℃振荡10 min使结晶充分溶解。使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度值，每组重复测定3次取平均值。

1.2.4 ALP活性检测

取成骨诱导7 d的各组BMSCs，经超声破碎制备样本。96孔板设置如下：空白孔(仅反应缓冲液)、标准孔(含已知浓度标准品)及样本测定孔(分别加入3组细胞裂解液)。参照ALP检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司，P0321M)说明书配制反应体系，各孔加入等体积反应工作液。37 ℃避光反应30 min后，使用酶标仪于405 nm波长下测定吸光度值。通过标准曲线计算各组ALP活性，每组样本重复测定3次。

1.2.5 茜素红染色

成骨诱导21 d后，收集各组BMSCs。采用4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗3次后，加入1%茜素红染色液(上海碧云天生物技术有限公司，C0148S，pH 4.2)室温避光染色20 min。光学显微镜下观察钙盐沉积形成的橙红色矿化结节。采用ImageJ软件定量分析钙化结节面积。

1.2.6 实时反转录聚合酶链反应

收集各组BMSCs，采用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA。使用Nanodrop，Thermo Fisher Scientific测定RNA浓度及纯度(A₂₆₀/A₂₈₀比值1.8~2.0)，取1 μg RNA经反转录试剂盒(美国Fermentas公司)合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)采用SYBR Green法。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样本设3个技术重复，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)或U6为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.2.7 蛋白质印迹法

采用RIPA裂解缓冲液(含1×蛋白酶抑制剂cocktail，美国Thermo Fisher Scientific公司)裂解各组BMSCs，于4 ℃ 下12 000 g离心15 min，收集上清。采用二喹啉甲酸(bicin-choninic acid，BCA)蛋白质定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，P0012)测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)标准品制作标准曲线(0~2 000 μg/mL)；配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5% BSA[含吐温20的Tris缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)配制]室温封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次10 min，于室温下孵育辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗(1꞉5 000稀释)1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。用增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂处理膜，并在暗室中用X光胶片显影。通过上述步骤，使用蛋白质印迹法检测并分析细胞中矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和Notch2等蛋白质的表达情况。

1.2.8 双荧光素酶实验

通过TargetScan数据库预测miR-21a-5p(miR-21)潜在靶基因Notch2，采用荧光素酶报告基因实验进行靶向关系验证；具体步骤将Notch2受体3'非翻译区(3' untranslated region，3'UTR)的预测结合序列(5'- AGAGTC…AAGAAATAAGCTAACTTG…TGTCAA-3')[生工生物工程(上海)股份有限公司]克隆至pMIR-REPORT载体的SpeI和HindIII酶切位点，并设计器突变体，与100 mol/L pre-miR-21-5p及0.2 μg β-半乳糖苷酶对照质粒共转染HEK293细胞，转染24 h后检测荧光素酶活性(经β-半乳糖苷酶标准化)。实验使用Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)转染试剂进行细胞转染。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验验证正态性：符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时选用LSD法进行两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。所有实验均独立重复3次以上，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠股骨来源的<bold>BMSCs</bold>表型鉴定

流式细胞术结果显示：S-BMSCs组和O-BMSCs组细胞的CD29表达率分别为89.7%和93.2%，均呈阳性表达；S-BMSCs组和O-BMSCs组细胞的CD34表达率分别为4.39%和3.74%，均呈阴性表达(图1)。这说明进行去势处理后提取的股骨来源的BMSCs仍然符合BMSCs的细胞表面标志物特征。

2.2 <bold>A-IV</bold>对<bold>BMSCs</bold>细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示：与O-BMSCs组(0 μg/mL)比较，S-BMSCs组(0 μg/mL)在各时间点(1、3、5、 7 d)的增殖能力差异均无统计学意义(P>0.05)；当 A-IV浓度在10~80 μg/mL范围内时，A-BMSCs组的细胞增殖能力均显著高于O-BMSCs组(均P<0.05，图2)。这表明A-IV对OP大鼠BMSCs的增殖具有显著促进作用，且在10~40 μg/mL浓度范围内呈现明显的剂量依赖性增强效应。基于此，本研究确定40 μg/mL为A-IV促进BMSCs增殖的最佳干预浓度，并进行后续实验。

2.3 <bold>A-IV</bold>对<bold>BMSCs</bold>成骨分化的影响

ALP活性检测(图3)和茜素红染色(图4)评估A-IV对BMSCs成骨分化的影响的结果显示：与S-BMSCs组比较，O-BMSCs组的ALP活性显著降低(P<0.05)，钙化结节稀疏、数量明显减少。这表明OP显著抑制BMSCs的成骨分化能力。与O-BMSCs组比较， A-BMSCs组ALP活性显著提升(P<0.05)，钙化结节分布均匀，数量也明显增加，提示A-IV干预能有效促进OP来源BMSCs的成骨分化，恢复其矿化能力。综上，A-IV可通过增强BMSCs的成骨分化功能来改善OP。

2.4 <bold>A-IV</bold>对<bold>BMSCs</bold>成骨相关因子表达的影响

Real-time RT-PCR(图5)和蛋白质印迹法(图6)检测结果显示：与S-BMSCs组比较，O-BMSCs组Runx2和OPN的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05)。经A-IV干预后，A-BMSCs组细胞的Runx2和OPN的mRNA和蛋白质表达水平较O-BMSCs组均显著上调(均P<0.05)。这表明A-IV可通过上调成骨关键调控因子Runx2和OPN的表达，提升OP大鼠来源BMSCs的成骨分化能力。Runx2作为成骨分化的核心转录因子，其表达上调可进一步激活下游成骨相关基因的表达；而OPN作为重要的骨基质蛋白，其表达增加有助于促进细胞外基质的矿化，因此A-IV可能通过调控Runx2、OPN来改善OP导致的BMSCs成骨分化功能障碍。

2.5 <bold>A-IV</bold>通过调控<bold> miR-21</bold>抑制<bold>Notch2</bold>影响<bold>BMSCs</bold>成骨分化

荧光素酶报告基因实验证实：miR-21与Notch2存在直接靶向调控关系，miR-21可特异性结合Notch2的3'UTR，显著抑制荧光素酶活性(图7A)。为阐明A-IV的作用机制，本研究检测各组BMSCs中 miR-21和Notch2的表达变化(以U6和GAPDH作为内参)，结果显示：与S-BMSCs组比较，O-BMSCs组的miR-21表达显著下调，同时Notch2的mRNA和蛋白质表达水平均显著上调(均P<0.05)；而经A-IV干预后，A-BMSCs组miR-21表达明显回升，Notch2的表达则被显著抑制(均P<0.05；图7B、7C)。上述结果提示，A-IV可能通过上调miR-21表达来抑制Notch2，从而促进BMSCs的成骨分化。

3 讨 论

随着年龄增长，人体骨骼系统逐渐出现退行性改变，其中OP已成为威胁中老年人健康的重要疾病^[20]。该疾病以骨量显著减少、骨微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和骨折风险升高^[21]。目前，OP的治疗策略主要聚焦于维持骨代谢平衡和抑制骨吸收。然而，促进骨形成的药物研发面临挑战。这主要是因为骨形成过程极为复杂，涉及多种细胞和分子之间的相互作用与影响。骨形成的关键在于增加成骨细胞的数量，而这些细胞主要由BMSCs分化而来。

BMSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞，在骨代谢平衡中发挥关键调控作用^[22-23]。生理状态下，BMSCs可定向分化为成骨细胞促进骨形成，而病理条件下则异常分化为脂肪细胞，导致骨髓脂肪堆积和骨形成减少，这正是OP的典型病理特征^[24]。随着年龄增长，BMSCs表现出数量减少、成骨分化能力下降及成脂倾向增强等衰老特征，这种“成骨-成脂”分化失衡成为OP发病的重要机制^[25]。这一现代医学发现与传统中医“肾主骨”理论高度契合：肾精的盛衰变化类比于BMSCs的增殖分化能力，“精生髓、髓养骨”的经典论述恰反映了BMSCs通过成骨分化维持骨稳态的生物学过程。因此，通过靶向调控BMSCs的定向分化来纠正“成骨-成脂”失衡，已成为OP再生治疗的重要策略方向。

黄芪皂苷是中药黄芪的核心活性成分及定性定量指标^[26]，其化学结构为羊毛甾醇型四环三萜皂苷(分子式为C₄₁H₆₈O₁₄)，近年研究^[27]发现该成分具有免疫调节、心脑血管保护、抗肿瘤及器官保护等多重药理活性。鉴于过去20年间黄芪因其作为补益药物在中药治疗OP中的高频使用，结合黄芪皂苷的多种药理活性，笔者推测黄芪皂苷可能在OP的预防和治疗中发挥重要作用。本研究探讨了A-IV对去势大鼠来源BMSCs增殖的影响。MTT实验表明：A-IV在10~80 μg/mL浓度范围内能显著促进BMSCs增殖，其中10~40 μg/mL呈现明显的剂量依赖性增强效应，并在40 μg/mL时达到最佳促增殖效果。这一发现不仅证实了A-IV对BMSCs的正向调控作用，同时为后续研究确定了40 μg/mL这一优化干预浓度。

ALP活性和钙化结节形成是评估BMSCs成骨分化进程的关键指标^[28]。在成骨分化过程中，Runx2作为核心转录调控因子，具有双重功能：一方面在分化起始阶段促进间充质干细胞向成骨细胞定向分化；另一方面在分化后期抑制成熟成骨细胞的增殖，调控其向骨细胞的分化进程^[29]。OPN作为重要的分泌型磷蛋白，不仅参与细胞外基质的矿化调控，还在破骨细胞与成骨细胞的相互作用中发挥关键调节作用^[30]。

Wang等^[31]学者发现，A-IV作用于BMSCs后，ALP水平显著提升，证明其与成骨相关。本研究发现：卵巢去势大鼠来源的BMSCs表现出显著的成骨分化障碍，具体表现为ALP活性降低和钙化结节数量减少；经A-IV干预后，A-BMSCs组的成骨分化能力明显改善，ALP活性增加，矿化面积增加，同时成骨相关基因(Runx2、OPN)表达显著上调。这提示A-IV显著提升OP大鼠股骨来源BMSCs成骨分化能力。Wu等^[32]的研究表明A-IV能显著促进大鼠BMSCs的增殖并诱导其向成骨细胞分化。值得注意的是，这一促分化作用在加入miR-21抑制剂后显著减弱，提示A-IV的成骨诱导效应可能通过调控 miR-21的表达来实现。

MiR-21是一种长度为21~25个核苷酸的非编码小RNA，通过调控靶mRNA的翻译或降解来影响细胞的增殖与分化过程。Meng等^[33]的研究进一步证实miR-21在成骨分化中的关键作用：在人脐带间充质干细胞中，过表达miR-21可显著上调成骨相关基因的表达水平，而miR-21抑制剂则能逆转这一效应。这些发现均表明miR-21可能是调控间充质干细胞向成骨细胞分化的关键分子之一。

Notch信号通路在胚胎发育及骨稳态维持中发挥关键调控作用。Notch2的功能获得性突变与哈杰杜-切尼综合征(Hajdu-Cheney syndrome，HCS)密切相关，该疾病以早发性OP为主要特征^[34]。Yorgan等^[35]进一步证实，Notch2通过抑制成骨细胞分化参与骨重塑调控，但其持续表达导致OP的具体机制尚不明确。基于Targetscan数据库预测分析显示Notch2 mRNA的3'UTR区存在miR-21的潜在结合位点，提示miR-21可能通过靶向Notch2影响BMSCs的成骨分化进程。本研究进一步采用荧光素酶实验证实了miR-21与Notch2的靶向结合关系，进一步采用蛋白质印迹法和real-time RT-PCR技术检测了不同干预条件下BMSCs的miR-21、Notch2及成骨相关因子OPN和Runx2的相对表达水平。相较于Sham组，OVX组的BMSCs在成骨诱导后miR-21表达显著下调，同时Notch2的mRNA及蛋白质水平明显升高，而OPN和Runx2的表达则显著降低。A-IV处理可显著上调miR-21及成骨相关因子(OPN、Runx2)的表达，同时抑制Notch2的转录和翻译。这表明A-IV可通过上调miR-21的表达水平，特异性抑制Notch2信号通路的激活，从而有效促进BMSCs的成骨分化。这一发现不仅揭示了OP发病的新机制，也为阐释黄芪皂苷的骨保护作用提供了重要的分子理论基础。

综上所述，A-IV通过miR-21/Notch2信号轴显著增强卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。这一作用机制提示A-IV在防治OP方面具有明确的治疗潜力，将为黄芪皂苷的临床转化应用提供更充分的科学依据。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2022JJ70025)

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