1例Dent病患者CLCN5基因新发移码突变的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of a CLCN5 geneframeshift mutation in a patient with Dent disease

摘要

Dent病是一种罕见的X连锁隐性遗传肾小管疾病，临床特征为低分子量蛋白尿(low molecular weight proteinuria，LMWP)、高钙尿症、肾钙质沉着等，可诱发进行性肾功能衰竭。该病主要由CLCN5基因突变引起。本文报告1例10岁男性患者，在常规体检中发现蛋白尿表型，综合生化检测结果及临床评估显示显著的LMWP和高钙尿症，病理组织染色显示肾小球系膜细胞及基质均增多。进一步的全外显子测序发现患者CLCN5基因中有1个突变(NM_001127899.4, c.1158delC, p.F387Lfs*42)，导致移码和提前终止，可能破坏其在氯/氢离子交换和内涵体酸化中的功能。生物信息学分析显示该突变致病。基因检测在诊断罕见肾病中具有重要意义，对致病突变的早期识别有助于及时干预、疾病管理以及改善患者的预后。本文扩展了CLCN5的突变谱，有助于理解Dent病的遗传和分子机制。

Abstract

Dent disease is a rare X-linked recessive inherited renal tubular disorder characterized by low molecular weight proteinuria (LMWP), hypercalciuria, nephrocalcinosis, and other clinical features, and can lead to progressive renal failure. It is primarily caused by mutations in the CLCN5 gene. This article reports the case of a 10-year-old male patient of Chinese descent who was incidentally found to have asymptomatic proteinuria during a routine health examination. Comprehensive biochemical testing and clinical evaluation revealed significant LMWP and hypercalciuria, while renal biopsy showed mesangial cell and matrix proliferation. Whole exome sequencing identified a novel deletion mutation in the CLCN5 gene (NM_001127899.4, c.1158delC, p.F387Lfs*42) causing a frameshift and premature termination, which is likely to disrupt its role in chloride/hydrogen ion exchange and endosomal acidification. Bioinformatic analysis indicated the variant is pathogenic. Genetic testing plays an important role in diagnosing rare kidney diseases. Early identification of pathogenic mutations is essential for facilitating timely intervention and appropriate management, potentially enhancing patient outcomes. This report expands the CLCN5 mutation spectrum and contributes to understanding the genetic and molecular mechanisms of Dent disease.

Graphical abstract

关键词

Dent病 / CLCN5基因 / 全外显子测序 / 移码突变 / 生物信息学分析

Key words

Dent disease / CLCN5 gene / whole exome sequencing / frameshift mutation / bioinformatics analysis

Dent病[在线人类孟德尔遗传数据库(On-line Mendelian Inheritance in Man，OMIM):300009]是一种罕见的X连锁隐性遗传病，特点为低分子量蛋白尿(low molecular weight proteinuria，LMWP)、高钙尿症、肾钙质沉着或进行性肾功能衰竭^[1-2]。目前已鉴定出2种疾病亚型：携带CLCN5突变的Dent病1型^[3]和携带OCRL突变的Dent病2型^[4]。此外还有约25%的Dent病患者并未发现明确的致病基因^[5]。CLCN5基因编码ClC-5氯/氢离子交换蛋白，主要在肾近曲小管中表达。该基因的突变会导致内涵体酸化缺陷和受体介导的内吞作用障碍，从而引起疾病发生。Dent病1型由CLCN5基因突变引起，约占临床病例的60%^[5]。本文报道1例通过全外显子测序鉴定的CLCN5基因移码突变导致的10岁Dent病患者，以期提高临床医师对Dent病的认识水平，并为早期诊断及干预提供依据。

1 病例资料

1.1 伦理声明

本研究获得我院伦理委员会批准(审批号：XMSB-2023-0316)。

1.2 病例资料及生物信息学分析方法

先证者为男性，汉族，10岁，因发现蛋白尿来中南大学湘雅三医院(以下简称“我院”)就诊。父母非近亲结婚，足月妊娠。无水肿和少尿。否认高血压病史，无肝炎等传染病史、手术史、外伤史、输血史、药物过敏史和食物过敏史，无家族遗传性疾病与肾脏疾病病史。体格检查：体温正常，全身皮肤及黏膜未见皮疹，颜面部及双下肢无水肿。24 h尿蛋白定量为1 650 mg，24 h尿钙0.26 mmol，血磷为 0.75 mmol/L，抗核抗体+血清抗磷脂酶A2受体抗体检测为阴性，血常规、大便常规、尿沉渣、凝血功能、甲状腺功能检查全套和尿培养均未见异常。双肾超声显示双侧肾实质回声增强(图1A)，肾穿刺组织过碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining，PAS)显示肾小球系膜细胞及基质均增多，个别袢与囊壁粘连，囊壁节段增厚(图1B)。

为寻找潜在的致病原因并对疾病进行分型，提取患者外周血基因组DNA样本进行全外显子测序。收集患者的临床病史、辅助检查结果，以及患者及其家族成员的外周血样本进行后续研究。使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒从家族成员的外周血淋巴细胞中提取基因组DNA。由成都市贝瑞和康基因技术股份有限公司进行外显子捕获、高通量测序和常规过滤。

基于基因组聚合数据库(Genome Aggregation Database，GnomAD)和1000基因组计划(1000 Genomes)注释变异频率，并使用MutationTaster、SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)软件、CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)工具、PolyPhen-2和MetaDome预测变异的致病性。变异保留的条件为：1)变异频率小于0.001；2)至少3种生物信息学软件预测变异为致病性。对于选定的变异，使用OMIM对基因的遗传模式和临床表型进行注释，并使用美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)标准和指南对其致病性等级进行分级。

1.3 生物信息学分析结果

1.3.1 鉴定出<italic>CLCN5</italic>基因新突变

经过数据分析和Sanger测序的验证，在患者CLCN5基因第11外显子中鉴定出1个半合缺失突变：NM_001127899.4, c.1158delC, p.F387Lfs*42，即CLCN5基因编码序列的第1 158位的胞嘧啶缺失，该单核苷酸缺失导致移码和氨基酸序列提前终止，预计产生截短且可能无功能的ClC-5蛋白。进一步的家系分析发现：患者父母均无明显的疾病相关表现，父亲无该变异，而母亲是该突变的杂合携带者，符合Dent病的X连锁隐性遗传模式(图2)。根据以下ACMG证据，该突变的致病性分级为“致病”：1)本研究中突变类型为移码突变，导致蛋白翻译提前终止，破坏基因功能，而功能缺失是Dent病的重要病因，符合PVS1；2)该突变未被GnomAD、1000G等正常对照人群数据库收录，符合PM2；3)该突变与疾病在家系中共分离，在家系成员中检测到此变异，符合PP1(表1)。通过检索HGMD数据和PubMed数据库，均未发现该CLCN5突变被报道，提示该位点突变可能是首次发现。结合患者临床表型与遗传检测结果，诊断为Dent病1型。

1.3.2 c.1158delC突变导致CLCN5蛋白严重截短

综合多种生物信息学方法探究c.1158delC突变的致病性及其对于CIC-5蛋白功能的影响。多物种CIC-5蛋白的氨基酸序列比对结果发现，突变位点及后续序列在物种进化上相对保守，而突变不仅改变了387位之后的氨基酸，还造成了提前终止(图3A)。氨基酸保守性和蛋白质结构域分析结果显示，387位点及之后的氨基酸对突变的耐受性极差(图3B)，且该区域对于蛋白质的多次跨膜极其重要(图3C)，而突变则会导致后续蛋白质缺失大量的蛋白质结构(图3D)，严重干扰CIC-5蛋白的正常功能。上述结果表明CLCN5基因c.1158delC突变具有致病性，该突变可能通过产生截短CIC-5蛋白，最终影响肾功能，导致Dent病的发生。

2 讨 论

Dent病是一种罕见的X连锁隐性遗传疾病，该病主要由CLCN5基因突变引起。CLCN5基因定位于染色体Xp11.22，有12个外显子^[6]，CLCN5基因编码的ClC-5蛋白在内涵体的酸化过程中起关键作用，对于肾小管中蛋白质、钙和其他离子的重吸收至关重要^{[5, 7]}。CLCN5基因的突变影响了重吸收过程，也是导致Dent病特征性表现的重要遗传因素^[7]。具体而言，无法重吸收低分子量蛋白质导致LMWP的发生，而钙重吸收的破坏则导致高钙尿症和肾钙化。本研究发现的CLCN5基因移码突变预计会截短ClC-5蛋白，导致丧失包括胱硫醚-β-合成酶域在内的关键功能域。这些功能域对ClC-5氯/氢离子交换蛋白的正常功能至关重要，在肾近曲小管的内涵体酸化和受体介导的内吞作用中起关键作用^[8]。CLCN5基因敲除模型小鼠中表现出高磷酸盐尿、高钙尿和肾结石表型，强调了CIC-5蛋白在维持正常肾脏功能的关键作用^[9]。一项研究^[5]也发现了在Dent病患者中CLCN5基因的突变位点(c.988_989ins GTGGAGTATTATTCAG，p.S335Rfs*8)，这一发现也佐证了这一区域发生移码突变的致病性。该突变位点引起翻译提前终止，导致终止后的蛋白片段消失，包括半胱硫氨酸-合成酶1(cystathionine beta-synthase 1，CBS1)和半胱硫氨酸-合成酶2(cystathionine beta-synthase 2，CBS2)功能域的缺失，进一步证实了该突变的致病性。该突变的致病性需要体外实验在分子水平上的进一步证实。

Dent病患者通常在儿童期出现如蛋白尿和高钙尿症的症状^[10]。随着疾病的发展，患者可能会进一步出现肾钙化、肾结石，最终发展为慢性肾病^[5]。即使在携带同一突变的同一家族患者中，症状严重程度和进展速度也可能有很大差异，这表明该病具有高度异质性的遗传表型^[10]。由于表型多样，Dent病的诊断往往具有挑战性^[11]。临床上对于不明原因的LMWP和高钙尿症，特别是有肾病家族史的患者需要高度怀疑Dent病的可能性。全外显子测序是识别疾病类型和发现与该病相关的新突变的重要工具，对于辅助临床诊断和治疗有重要意义。既往遗传学研究^[3-4]发现，Dent病主要与CLCN5基因突变(Dent病1型)有关，但OCRL基因突变也可引起类似表型(Dent病2型)。有趣的是，约25%的Dent病的患者没有携带这2个基因的致病突变，提示可能存在其他致病因素。这也进一步表明了在疑似Dent病患者中进行全面基因检测的重要性。

Dent病的临床治疗和管理的主要方向集中在缓解症状和延缓疾病进展。噻嗪类利尿剂常用于减少高钙尿症并防止肾钙化，血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂用于控制蛋白尿和高血压^[12-13]。定期监测肾功能、尿钙排泄和骨密度也对监测疾病进程至关重要。Dent病的预后主要取决于具体的突变类型和症状的严重程度。有些患者可能在成年期仍然保持正常的肾功能，而另一些患者可能进展为需要透析或移植的终末期肾病。

综上所述，本文报道了1个新的CLCN5移码突变导致的Dent病病例，通过生物信息学预测和比较突变前后蛋白质结构变化和突变致病性，丰富了该病的遗传变异谱。本研究也强调了基因检测在诊断Dent病中的重要性，特别是在表现非典型或轻度的病例中。早期进行基因检测并识别致病突变有助于及时临床干预，减缓疾病进展和防治其他并发症。新突变的鉴定对理解和认识Dent病的发生、发展有一定意义，有助于完善基因型-表型相关性。此外，新突变为研究疾病的分子机制提供了潜在的价值，有助于开发针对性的治疗方法。

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