星形胶质细胞通过Cx47调控外泌体介导的CHI3L1分泌并促进少突胶质前体细胞增殖

Astrocytes promote oligodendrocyte precursor cell proliferation via Cx47-mediated regulation of exosome-derived CHI3L1 secretion

摘要

目的 神经退行性变性疾病与髓鞘缺失紧密相关，而少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的增殖和分化是髓鞘修复的关键，但其调控机制尚未完全明确。本研究旨在探讨星形胶质细胞(astrocytes，ASTs)通过间隙连接蛋白47(connexin 47，Cx47)调控外泌体介导的几丁质酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)分泌及其对OPCs增殖的影响机制。 方法 采用清洁的出生后第1天斯普拉格-道利(postnatal day 1 Sprague-Dawley，P1SD)乳鼠原代细胞，建立OPCs与ASTs上清液共培养组(A组)、ASTs与OPCs直接接触培养组(C组)及OPCs单独培养组(O组)。采用光学显微镜、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)掺入及流式细胞术评估细胞状态和增殖能力。采用转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)和生物信息学分析(bioinformatics analysis，BA)筛选3组中OPCs的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。采用蛋白质印迹(Western blotting，WB)和流式细胞术分析各培养组蛋白质表达和细胞周期。采用差速离心法分离、提纯外泌体，通过纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、透射电子显微镜分析观察OPCs分泌的外泌体数量和质量，采用WB验证外泌体中CHI3L1的表达水平。采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术敲除Cx47，评估敲除后OPCs增殖能力和外泌体分泌情况。构建包裹CHI3L1的小单层脂质体(single unilamellar vesicles，SUVs)作为人工外泌体模型，采用NTA和电子显微镜鉴定其结构和尺寸。在敲除Cx47后，补充人工外泌体并采用流式细胞术和EdU试验检测OPCs增殖情况。 结果 在直接接触共培养条件下，相较于O组和A组，C组OPCs增殖最为显著(P<0.05)。RNA-Seq和WB分析结果显示，ASTs通过Cx47显著促进OPCs的增殖，并增强富含CHI3L1的外泌体的分泌。在采用siRNA技术抑制Cx47表达后，OPCs增殖活性以及外泌体释放量均显著降低(P<0.05)；再次补充分离提纯的外泌体和外源性CHI3L1后，采用siRNA技术敲除Cx47对OPCs细胞增殖的抑制作用被削弱。 结论 本研究揭示了ASTs通过Cx47调控OPCs增殖的新途径，ASTs在直接接触OPCs时通过Cx47增强富含CHI3L1的外泌体分泌，将细胞间接触信号转化为分泌信号，从而促进OPCs增殖。CHI3L1作为外泌体中的关键分子，在神经系统中的功能和髓鞘修复中的作用机制值得深入研究。

Abstract

Objective Neurodegenerative diseases are closely associated with myelin loss, and the proliferation and differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are crucial to remyelination. However, the regulatory mechanisms involved remain incompletely understood. This study aims to investigate how astrocytes (ASTs) regulate the secretion of chitinase-3-like protein 1 (CHI3L1) via connexin 47 (Cx47)-mediated exosome signaling, and its subsequent effect on OPC proliferation. Methods Primary cells were isolated from postnatal day 1 Sprague-Dawley (P1SD) rats to establish 3 culture conditions: OPCs alone (Group O), OPCs in direct contact with ASTs (Group C), and OPCs cultured with AST-conditioned medium (Group A). Cellular morphology and proliferation were assessed using optical microscopy, 5-ethynyl-2'- deoxyuridine (EdU) incorporation, and flow cytometry. RNA sequencing (RNA-Seq) and bioinformatics analysis (BA) were conducted to identify differentially expressed genes (DEGs) among groups. Protein expression and cell cycle distribution were analyzed by Western blotting (WB) and flow cytometry. Exosomes were isolated and purified via differential centrifugation, characterized by nanoparticle tracking analysis (NTA) and transmission electron microscopy (TEM), and CHI3L1 expression in exosomes was verified via WB. Cx47 was silenced using small interfering RNA (siRNA) to evaluate its effect on OPC proliferation and exosome secretion. Artificial exosomes were constructed by encapsulating CHI3L1 in single unilamellar vesicles (SUVs), whose structure and size were validated by NTA and TEM. Following Cx47 knockdown, artificial exosomes were added back, and OPC proliferation was assessed via flow cytometry and EdU assay. Results Direct co-cultured with ASTs (Group C) resulted in significantly enhanced OPC proliferation compared to the Group O and Group A (P<0.05). RNA-Seq and WB analyses revealed that ASTs promote OPC proliferation and exosome secretion enriched in CHI3L1 through Cx47. Cx47 knockdown by siRNA led to significant decreases in OPC proliferation and exosome release (P<0.05). The inhibitory effect of Cx47 silencing on OPC proliferation was partially reversed by supplementation with either isolated exosomes or exogenous CHI3L1. Conclusion This study reveals a novel mechanism by which ASTs regulate OPC proliferation: Through direct contact, ASTs enhance the secretion of CHI3L1-rich exosomes via Cx47, thereby converting intercellular contact signals into secretory signals that promote OPC proliferation. As a key exosomal molecule, CHI3L1 may play an important role in neural function and remyelination and warrants further investigation.

Graphical abstract

关键词

少突胶质前体细胞 / 星形胶质细胞 / 间隙连接蛋白47 / 外泌体 / 几丁质酶3样蛋白1 / 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 / 转录组测序 / 差异表达基因 / 细胞增殖

Key words

oligodendrocyte precursor cells / astrocytes / connexin 47 / exosomes / chitinase-3-like protein 1 / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine / transcriptome sequencing / differentially expressed genes / cell proliferation

研究^[1]证实包括阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症在内的神经退行性变性疾病均与髓鞘损伤密切相关。在中枢神经系统中，少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)是唯一可以形成髓鞘的细胞，当人体髓鞘受到损伤时，具有增生潜能的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)会大量增殖并迁移到髓鞘的受损区域，分化为能够形成髓鞘的成熟OL^[2]。大量增殖的OPCs是新生的成熟OL的主要来源^[3-4]，诱导OPCs增殖、迁移和定向分化成为具有髓鞘形成能力的成熟OL则是修复髓鞘的重要途径之一^[5-6]。星形胶质细胞(astrocytes，ASTs)是中枢神经系统中分布广泛且数量最多的神经胶质细胞。在白质髓鞘受损的情况下，ASTs在调控OPCs增殖与分化过程中发挥重要作用，但其具体调控机制仍不清楚^[7]。本研究探讨ASTs调控OPCs增殖及分泌外泌体的分子途径，为探索髓鞘损伤相关神经退行性变性疾病潜在治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁的出生后第1天斯普拉格-道利(postnatal day 1 Sprague-Dawley，P1SD)乳鼠由重庆医科大学动物实验中心提供；神经母细胞瘤细胞株B104由重庆医科大学干细胞平台保存；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰酶、N-2无血清添加剂均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；DMEM/F-12培养基购自美国Hyclone公司；四季青血清购自浙江天杭生物科技有限公司；0.1%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、多聚-D-赖氨酸(poly-D-lysine，PDL)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液、山羊血清、FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)抗体、Cy3标记山羊抗小鼠IgG抗体、青霉素-链霉素溶液(100×)、蛋白质印迹(Western blotting，WB)及蛋白质提取相关试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF)膜购自美国Millipore公司；5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'- deoxyuridine，EdU)试剂盒、间隙连接蛋白(connexin，Cx)47小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)试剂盒均购自广州市锐博生物科技有限公司；PCR试剂盒、RNA逆转录酶(M-MLV)试剂盒均购自日本TaKaRa公司；血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRα)抗体、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体、几丁质酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)抗体均购自美国Santa Cruz公司；CHI3L1重组蛋白购自武汉云克隆科技股份有限公司；6孔细胞培养板购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

OPCs培养：原代细胞来源于培养日龄1 d的SD乳鼠。在预冷的PBS缓冲液中剥离脑膜，分离端脑，去除剩余脑组织；分离后的端脑经0.25%胰酶消化后离心。将细胞重悬于涂有PDL的培养皿中，培养皿中添加含12% FBS的培养基；贴壁培养24 h，隔天更换12% FBS培养基；培养3~5 d后，采用含有20% B104上清液和1% N-2无血清添加剂的选择性培养基替换原培养基，并继续培养4~6 d。体外培养过程中，允许单层ASTs存在大量OPCs附着。鉴于EDTA消化液消化能力有限，采用0.01% EDTA消化液消化 10 min后，将不含ASTs的上层OPCs细胞轻轻吹入含12% FBS的培养基中继续培养，最终获得纯化的OPCs。

ASTs培养：新生SD大鼠的处理参照“OPCs培养”相关操作。将细胞重悬于涂有PDL的培养皿中，培养皿中添加12% FBS培养基，隔天更换培养液；培养8~9 d时，细胞进行传代处理并经胰酶消化后离心，将细胞重悬在含12% FBS培养基中继续培养3~4 d；重复上述细胞传代步骤2~3次后，即可获得纯化的ASTs。

1.2.2 收取B104上清液

将B104细胞株接种在含有12% FBS培养基的培养皿中，待细胞融合至70%~80%时，采用含有1% N-2无血清添加剂的培养基替换原培养基，并将细胞置于37 ℃的培养箱中培养4 d，收集上清液，以1 000 r/min离心3 min，使用0.22 μm滤菌器过滤后于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 细胞分组

OPCs与ASTs上清液共培养组(A组)：分别采用0.2%的胰蛋白酶和0.01%的EDTA消化ASTs和OPCs，并在OPCs的上层细胞小室中接种ASTs，而后加入含有1% N-2无血清添加剂和20% B104上清液的培养基，并将细胞温育4~6 d。

OPCs与ASTs直接接触共培养组(C组)：将ASTs接种于涂有PDL的培养皿中，接种ASTs 1 d后，再向ASTs细胞表面接种纯化后的OPCs，建立共培养体系；加入含有1% N-2无血清添加剂和20% B104上清液的培养基，将细胞在37 ℃下培养4~6 d。在收集细胞时，用0.01% EDTA消化。

OPCs单独培养组(O组)：将原代培养的OPCs采用0.01% EDTA消化，并将其接种在涂有PDL的6孔板培养皿中；添加含有1% N-2无血清添加剂和20% B104上清液的培养基，并将细胞在37 ℃下孵育 4~6 d。

siRNA阴性对照组(NCsiRNA组)、Cx47siRNA组：按C组实验方案建立OPCs与ASTs共培养模型，待细胞铺至底面70%以上时，依据Cx47siRNA转染试剂盒说明书将siRNA转染到细胞中，培养48 h后即可检测转染效果。NCsiRNA组用作阴性对照，其序列为5'-GGCUCUAGAAAAGCCUAUGCdTdT-3'；Cx47siRNA序列为5'-CCGAGAAGACTGTCTTCTT-3'。

Cx47siRNA补充外泌体组(Cx47siRNA+组)：在Cx47siRNA组实验方案基础上，补充浓度为3.2×10⁶ 颗粒数/mL的外泌体。

Cx47siRNA补充脂质体组(Cx47siRNA++组)：在Cx47siRNA组实验方案基础上，补充浓度为3.8×10⁶ 颗粒数/mL的包裹CHI3L1的脂质体。

1.2.4 免疫荧光检测

待各组细胞生长至60%左右时，采用PBS洗涤细胞3次；采用4%多聚甲醛固定细胞；加入含0.01% Triton X-100的PBS，PBS洗涤2次；加入山羊血清在室温下封闭1.5 h；加入一抗[GFAP为1꞉1 000；少突胶质细胞转录因子2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2，Olig2)为1꞉500]在4 ℃下过夜；PBS洗涤3次；加入荧光二抗(1꞉500)在室温下避光孵育1 h；避光PBS洗涤3次；滴加DAPI染色液，避光孵育；封片后在共聚焦显微镜下拍摄并观察效果。

1.2.5 EdU细胞增殖检测

将EdU试剂A按照1꞉1 000的比例稀释至培养基中，加入细胞中共孵育24 h；移除含有EdU的培养基，使用PBS缓冲液清洗细胞3次；使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，再使用2 mg/mL的甘氨酸溶液在脱色摇床上孵育5 min；使用0.5% Triton X-100溶液在脱色摇床上处理10 min，按照说明书配制Apollo染色液并加入细胞中，避光、室温条件下脱色摇床上孵育30 min，促使EdU标记的细胞发出荧光；使用0.5% Triton X-100溶液清洗细胞2次，10 min/次；使用甲醇溶液清洗细胞2次，5 min/次，以进一步完成脱水处理。将Hoechst33342试剂按照1꞉100的比例稀释混匀后加入细胞中，避光、室温条件下摇床孵育30 min，对细胞DNA进行染色；使用PBS清洗细胞3次；取出细胞爬片，滴加抗荧光淬灭剂封片，使用荧光显微镜检测EdU标记的细胞，观察细胞增殖情况。

1.2.6 WB检测蛋白质表达水平

使用含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(100×)的RIPA裂解液提取细胞总蛋白质，使用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)蛋白质浓度检测试剂盒测定蛋白质浓度。细胞裂解液中的蛋白质经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，120 V恒流电转至PVDF膜上，室温下使用5%脱脂牛奶封闭2 h。将以下抗体孵育：Cx47(1꞉200)，CHI3L1(1꞉200)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(1꞉2 000)，ALG-2 相互作用蛋白 X(ALG-2 interacting protein X，ALIX)(1꞉1 500)，溶酶体相关膜蛋白-3(cluster of differentiation 63，CD63)(1꞉1 500)，肿瘤易感基因101重组蛋白(recombinant tumor susceptibility gene 101，TSG101)(1꞉1 000)。PBS缓冲液洗涤后，选择对应的二抗在室温下孵育，利用增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒对膜进行显影处理，显色结果使用Image Lab软件分析条带灰度值，定量评估目标蛋白质的表达水平。

1.2.7 流式细胞术分析细胞周期

各组细胞经胰酶消化后，收集到离心管中，使用PBS缓冲液洗涤2次，随后使用75%预冷乙醇固定。检测前，使用PBS缓冲液去除乙醇，加入碘化丙啶/核糖核酸酶A(propidium iodide/ribonuclease A，PI/RNase A)染色液，避光、室温下孵育30 min，随后进行细胞周期检测与分析。

1.2.8 转录组测序分析

样品RNA分离、文库制备和Illumina测序委托深圳华大基因科技有限公司完成。原始数据质量控制、直接量化、表达量估计以及差异表达基因(differential expressed genes，DEGs)筛选由深圳华大基因科技有限公司完成。符合|log₂Ratio|>1、错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.01及P<0.01的基因被定义为DEGs。基因本体(Gene Ontology，GO)分类和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析使用DAVID功能注释工具进行。基因本体论涵盖3个方面：细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)。GO-KEGG 通路功能注释富集分析通过DAVID功能注释图确定。显著富集定义为|log₂差异倍数(fold change，FC)|≥1.5，P<0.05。

1.2.9 外泌体分离与收集鉴定

收集OPCs增殖培养基(培养36 h)的上清液，采用差速离心法^[8-9]进行处理，条件分别为4 ℃、1 000 r/min离心 10 min，2 000×g离心30 min，以及10 000×g离心30 min；而后采用贝克曼库尔特(Optima XPN-100)超高速离心机在4 ℃、120 000×g离心150 min，并用300 μL PBS重悬管壁，所有沉淀物保存于4 ℃环境中，以用于后续实验。

1.2.10 透射电镜鉴定

将10 μL样本悬液滴在铜网上，静置15 min后吸去悬液，滴加适量质量浓度为1%磷钨酸染液在铜网上，染色30 s后吸去染液。待铜网晾干后，在透射电镜下观察并拍摄其形态、结构。

1.2.11 纳米颗粒追踪分析

使用1×PBS缓冲液适当稀释外泌体样品，以测量颗粒大小和浓度。采用Zeta View PMX 110纳米颗粒分析系统(VivaCell Biosceinces)进行纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，并配合相应软件Zeta View 8.04.02对外泌体样本进行粒径分布和浓度测定。记录NTA测量值并在11个位置进行分析，使用Zeta View系统110 nm聚苯乙烯颗粒进行校准，温度保持在23~30 ℃。

1.2.12 脂质体制备

空白脂质体采用薄膜分散法制备。称取0.03 g大豆卵磷脂、0.01 g胆固醇溶解于1 mL二氯甲烷的茄形瓶中；使用旋转蒸发仪在4 ℃真空环境中旋转干燥以除去残余的有机溶剂。将10 mL PBS加入茄形瓶中，使用功率400 W的超声震荡茄形瓶5 min，并以工作3 s、间歇3 s的模式使PBS与脂质薄膜发生水合作用。2 000 r/min离心5 min后，再使用0.22 μm微孔滤膜进行过滤。含CHI3L1的脂质体制备方法同上，将水合介质PBS改为质量浓度为100 ng/mL的CHI3L1蛋白溶液。

1.2.13 紫外分光光度法测定CHI3L1蛋白溶液含量

精密称量CHI3L1，用pH值7.4的PBS溶解后配制成含CHI3L1质量浓度为100、200、400、500 ng/mL的溶液，摇匀。采用紫外分光光度法检测不同浓度CHI3L1的吸光度，以CHI3L1质量浓度(X)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.14 超速离心法测定脂质体包封率

吸取质量浓度为500 ng/mL CHI3L1的脂质体 2 mL在4 ℃、20 000 r/min高速离心机中离心2 h，分离游离蛋白质CHI3L1与脂质体。以未离心前的样品计算总蛋白质浓度，离心后的上清液为游离蛋白质浓度，测量离心后的上清液吸光度值，根据标准曲线测量出游离蛋白质浓度，计算包封率：百分包封率(encapsulation percentage，EN%)=(1-游离蛋白质浓度/总蛋白质浓度)×100%。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism9.5统计学软件进行数据分析，每组实验均重复3次以上，所有数据采用均数±标准差表示，两独立样本均数比较行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ASTs与OPCs直接接触的培养方式最有利于OPCs的增殖

分别采用特异性抗体Olig2和GFAP对OPCs和ASTs进行标记，结果显示纯化后细胞纯度达到90%(图1D)。对比OPCs在3种不同培养条件[即OPCs单独培养(O组)、OPCs与ASTs上清液共培养(A组)以及OPCs与ASTs直接接触式共培养(C组)]下的增殖情况，在光学显微镜下发现C组培养72 h后表现出显著的增殖优势(图1A)，证实直接接触式共培养对OPCs增殖具有显著促进作用。EdU增殖试验直观呈现了各组OPCs的增殖能力，其中C组绿色荧光标记的新生细胞比例高于A组和O组，差异均有统计学意义(均P<0.05，图1B、1C)，进一步证实直接接触式共培养在促进OPCs增殖方面具有显著优势。采用流式细胞术分析细胞周期与增殖状态，结果显示C组处于S期(DNA合成期)的细胞比例高于A组和O组，差异均有统计学意义(均P<0.05，图1E、1F)。

2.2 ASTs通过Cx47促进OPCs增殖

对不同培养条件下的OPCs进行转录组测序，利用DAVID工具对DEGs的富集通路进行分析(图2A)；C组与A组Cx47基因的表达量分别为236与43 (图2B)。采用EdU增殖试验评估Cx47表达抑制后OPCs的增殖情况，结果显示Cx47siRNA组绿色荧光标记的新生细胞比例较C组和NCsiRNA组降低，差异均有统计学意义(均P<0.001，图2C、2D)。流式细胞术结果显示Cx47siRNA组OPCs处于S期的比例低于C组和NCsiRNA组，而处于G₀/G₁期的细胞比例则较高，差异均有统计学意义(均P<0.05，图2E、2F)。为进一步验证Cx47的功能，采用WB检测Cx47siRNA在直接接触培养体系中对Cx47表达的抑制效果，发现Cx47siRNA组Cx47蛋白质表达较C组和NCsiRNA组下调(图2G)。

2.3 ASTs通过Cx47促进OPCs分泌外泌体

OPCs测序分析发现C组存在显著的胞外分泌活动。GO功能分析显示C组“extracellular exosome”(细胞外外泌体)类别富集了DEGs(图3A)。采用透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)和WB技术对C组细胞培养上清液中分离出的外泌体进行鉴定，TEM结果证实C组上清液中存在大量直径30~150 nm的囊泡，这些囊泡符合外泌体的典型形态学特征(图3B)。基于NTA的进一步量化分析显示C组外泌体粒子直径主要集中在100.6 nm(比例高达94%)；NTA定量分析表明C组细胞培养上清液中外泌体分泌量显著高于NCsiRNA组(图3C)。当特异性干扰Cx47后，C组细胞培养上清液中外泌体分泌量显著下降。WB结果显示C组细胞培养上清液中囊泡富含外泌体自身特有的标志性蛋白质CD63、ALIX和TSG101(图3D)。

2.4 OPCs分泌的外泌体具有促进OPCs增殖的功能

采用PKH26染料标记外泌体，并在OPCs与ASTs直接接触的培养体系中孵育24 h，结果显示PKH26标记的外泌体能被OPCs有效内化(图4A)。Cx47siRNA组外泌体水平显著降低，而补充C组上清液的外泌体后，Cx47siRNA+组外泌体水平回升，差异有统计学意义(P<0.001，图4B)。EdU增殖试验结果显示Cx47siRNA+组新生OPCs比例较Cx47siRNA组增高，差异有统计学意义(P<0.01，图4C)。流式细胞术结果表明Cx47siRNA+组处于S期的OPCs比例升高，差异有统计学意义(P<0.001，图4D)。

2.5 Cx47调节外泌体中CHI3L1的表达与分泌

通过对A组和C组培养条件下收集的OPCs进行转录组测序和GO分析，结果显示增殖相关基因显著富集于细胞外泌体功能类别。进一步深入分析这些基因，筛选出关键DEGs CHI3L1(表1)，其在A组中表达量为97，而在C组中显著上调至320(图5A)。WB结果显示：与C组相比，Cx47siRNA组外泌体内CHI3L1蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.001，图5B)。

2.6 外源性CHI3L1促进OPCs增殖

本研究构建包裹CHI3L1的脂质体作为人工外泌体模型来模拟天然外泌体在信息传递中的生物效应。TEM图像显示该脂质体直径约为122 nm(图6A)，与天然外泌体直径相近，且NTA确认直径在114.6 nm的脂质体占比高达94%(图6B)，证实其尺寸具有均一性。采用紫外分光光度法检测不同浓度CHI3L1的吸光度，确认在280 nm处有特征吸收峰(图6C)，并绘制出线性关系良好的标准曲线(图6D)。线性回归方程为Y=0.001 34×X-0.009 03，r=0.999 58(n=4)。结果显示CHI3L1质量浓度在100~500 ng/mL内线性关系良好。采用离心法间接测定包封率(图6E)，计算得到3批CHI3L1脂质体包封率的测定平均值为31.4%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为4.42%。证明成功制备了装载CHI3L1的人工外泌体。

NTA结果显示Cx47siRNA++组外泌体水平较Cx47siRNA组升高，差异有统计学意义(P<0.001， 图6F、6H)。EdU增殖试验结果显示，Cx47siRNA++组新增OPCs比例高于Cx47siRNA组，差异有统计学意义(P<0.001，图6G)。流式细胞术分析结果显示Cx47siRNA++组处于S期的OPCs比例增高，差异有统计学意义(P<0.001，图6I)。

3 讨 论

研究^[10-11]表明阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性变性疾病均与脱髓鞘改变有关。OPCs分化并发育为成熟OL，能包裹神经元的轴突形成髓鞘。OPCs是新生OL的主要来源^[12-13]，研究^[14-15]显示OPCs增殖、迁移和定向分化成为具有髓鞘形成能力的成熟OL是修复髓鞘的重要途径。因此，激活大量OPCs的增殖是治疗髓鞘损伤类神经退行性变性疾病的关键^[16]。ASTs是分布最广泛、体积最大的一类胶质细胞，对其他神经细胞具有营养支持、调节外环境、参与修复等重要作用^[17-18]。ASTs在OPCs增殖和分化为OL及髓鞘的过程中具有极为重要的作用。

间隙连接参与电偶联及细胞间离子、营养物质、液体的迅速交换，在维持多细胞动物生命活动中具有重要作用^[19-20]。Cx是承载间隙连接生物活动的通道，在人体内可能存在21种Cx基因。研究^[21-22]发现ASTs大量表达Cx26、Cx30、Cx43，而OL大量表达Cx29、Cx32、Cx47，且均对OPCs增殖和发育至关重要。研究^[23]显示中枢神经系统脱髓鞘疾病与连接蛋白有关。本研究特异性地敲低Cx47表达后发现共培养的OPCs增殖能力受到抑制，提示在ASTs与OPCs直接接触的培养条件下，ASTs能通过Cx47促进OPCs增殖，Cx47作为Cx发挥了重要作用，借由传递增殖信息促进OPCs增殖；转录组测序数据表明直接接触共培养条件下，Cx47上调且伴有约20%的DEGs在外泌体相关通路富集，提示OPCs增殖不仅有赖于细胞间的直接接触(空间距离短，但调控细胞数量有限)，而且还受外泌体介导的细胞远程通信(空间距离长，但调控细胞数量更多)影响，即ASTs与OPCs直接接触共培养显著促进了外泌体的分泌，借由协同作用增强了OPCs的增殖能力。

外泌体负责细胞间物质运输与信息交换，广泛参与细胞增殖、分化、迁移以及免疫应答等生物学过程^[24-25]。本研究NTA结果表明：采用直接接触共培养的C组的外泌体分泌量是非接触培养的O组、A组的5~10倍，证实ASTs与OPCs直接接触共培养能促进OPCs分泌外泌体，从而增强OPCs的增殖能力。本研究在OPCs与ASTs直接接触共培养条件下干扰Cx47表达后发现外泌体分泌量显著下降，提示外泌体分泌受Cx47调节；在单独培养的OPCs组中直接加入外泌体，EdU试验结果显示新生OPCs比例显著增加，并且外泌体可以被OPCs内化，证实外泌体确实可以促进OPCs增殖。

外泌体携带的蛋白质种类较多，其中CHI3L1是糖蛋白水解酶18家族的成员，具有结合几丁质的功能，但不具有酶活性^[26-28]。CHI3L1与肝癌、宫颈癌、甲状腺癌、乳腺癌、结直肠癌、儿童脑癌、前列腺癌等恶性肿瘤进展相关，并呈现高表达状态。研究^[29-30]发现在乳腺癌和黑色素瘤中，CHI3L1通过上调血管生成因子和促生长因子的表达显著增强肿瘤细胞的肺转移能力。目前，CHI3L1在肿瘤进展与转移中的研究较为深入，但其在神经系统中的功能研究仍较为缺乏。本研究证实CHI3L1通过外泌体传递的增殖信号能够有效促进OPCs增殖，为阐述神经退行性变性疾病中髓鞘修复的新机制提供了重要依据。本研究结果显示OPCs增殖受细胞间接触与外泌体分泌的综合调控，二者协同传递增殖信息，即ASTs通过Cx47刺激OPCs分泌外泌体，外泌体携带增殖信息分泌到胞外后，又被其他OPCs细胞所内化，从而促进OPCs增殖。

综上所述，外泌体分泌可以突破细胞间接触的空间束缚，将OPCs的细胞增殖信号进行扩散，这一发现不仅深化了对OPCs增殖机制的理解，也为开发针对神经退行性变性疾病的新型治疗策略提供了理论依据与潜在靶点。

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