肿瘤干细胞放射治疗抗性的机制研究进展

Mechanistic research progress on radiotherapy resistance of cancer stem cells

摘要

放射治疗是肿瘤的重要治疗方案，其参与了50%以上肿瘤患者的治疗过程。然而，肿瘤对电离辐射的抗性导致放射治疗的效果不佳及后期肿瘤的复发转移。随着对肿瘤发病机制的不断深入研究，具有自我更新和分化潜能的肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)日益受到重视，并且其在肿瘤的放射治疗抗性、进展、转移、免疫逃避等过程中均发挥了重要作用。其中，肿瘤微环境、DNA损伤修复、上皮-间充质转化等机制在CSC的放射治疗抗性中扮演了关键角色，对以上过程涉及的关键通路进行综述，挖掘针对CSC的特异性治疗靶点，有助于为制订更高效、低毒的放射治疗策略提供思路。

Abstract

Radiotherapy is an important treatment modality for tumors and is involved in the treatment course of more than 50% of cancer patients. However, resistance to ionizing radiation results in suboptimal radiotherapy efficacy and contributes to tumor recurrence and metastasis at later stages. With the increasing understanding of tumor pathogenesis, cancer stem cell (CSC), characterized by self-renewal capacity and differentiation potential, have attracted growing attention and play key roles in radiotherapy resistance, tumor progression, metastasis, immune evasion, and other processes. Mechanisms including the tumor microenvironment, DNA damage repair, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) are critical drivers of CSC-mediated radiotherapy resistance. Reviewing the key pathways involved and identifying CSC-specific therapeutic targets may provide new insights for developing more efficient and less toxic radiotherapy strategies.

Graphical abstract

关键词

放射治疗抗性 / 肿瘤干细胞 / 肿瘤微环境 / DNA损伤修复 / 上皮-间充质转化 / 肿瘤复发 / 肿瘤转移

Key words

radiotherapy resistance / cancer stem cell / tumor microenvironment / DNA damage repairs / epithelial-mesenchymal transition / tumor recurrence / tumor metastasis

目前，肿瘤是全球重大的公共卫生挑战，已成为多数国家过早死亡的首要或第2大原因，且其发病率和病死率呈持续上升趋势^[1-3]。作为肿瘤治疗的常用方式之一，放射治疗(以下简称“放疗”)以单独使用或与手术、化学治疗(以下简称“化疗”)、免疫治疗联合使用等形式参与了约50%肿瘤患者的治疗过程。然而，肿瘤的放疗抗性可导致其治疗后复发和远处转移，这是目前放疗的主要挑战，同时也是肿瘤高病死率的主要原因。目前，解释肿瘤起源及耐药性中放疗抗性产生的假说主要有2种，即克隆演化模型和肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)模型。克隆演化模型认为：在基因突变不断累积及治疗选择压力作用下，肿瘤细胞形成高度异质性的克隆群体，放疗和化疗(以下简称“放化疗”)会筛选并富集耐受亚群，从而赋予肿瘤整体更强的抗性^[4]。CSC模型认为：处于分层顶端的CSC可以分裂产生新的CSC并分化为非致瘤肿瘤细胞，且二者在肿瘤微环境信号引导下可双向转化^[5]。乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的基因测序研究证实了克隆演化模型^[6-8]，同时在白血病等肿瘤中也成功分离出了CSC^[9]。这2种模型可能并非互斥，而是从不同层面共同阐释了肿瘤产生和发展的机制。然而，关于驱动肿瘤发生的最根本机制，学界尚未形成统一的理论框架。值得注意的是，CSC被视为上述2种理论观点的重要链接锚点，并被认为是驱动放疗抗性、肿瘤复发和转移的关键细胞群体。因此，本文将聚焦于CSC，围绕与其相关的DNA损伤修复、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)相互作用等关键过程，综述CSC在肿瘤放疗抗性中的作用及机制，并探讨潜在的治疗干预方向和策略。

1 CSC与TME

1.1 CSC的特征与识别

相比于其他肿瘤细胞，CSC具有2个独特优势：自我更新能力和分化为非致瘤细胞的能力。这决定了彻底治疗肿瘤需以杀灭所有CSC为先决条件。其与正常干细胞相似的分化和增殖特征表明，CSC可能起源于正常干细胞，由于基因突变等原因转化为CSC，但基因突变的作用可能并没有按预期占据决定地位，相反，环境因素和遗传因素可能发挥了更大作用^[10-12]。基于对肿瘤研究的持续深化，肿瘤的异质性本质日益凸显。该异质性体现在两个层面：一是不同肿瘤类型之间在分子表型、侵袭潜能等方面的差异；二是同一肿瘤内部不同细胞亚群间的异质性。值得注意的是，肿瘤内部异质性的增强与不良预后显著相关^[13]，CSC作为肿瘤的关键细胞，也较好地反映了这一特点。CSC在不同肿瘤中的占比不同，在实体肿瘤中，CSC的比例可从低于1%至超过80%不等^[14-15]。在血液系统肿瘤中，急性髓系白血病的CSC比例可低于1%^[16]，而在急性淋巴细胞白血病中的比例可超过80%^[17]。CSC的绝对数目也不尽相同，一般而言，实体肿瘤体积越大，其CSC的绝对数量也越多。

彻底根除CSC已成为肿瘤治疗的一个新思路，但是这项工作的难点之一在于如何准确识别CSC。由于肿瘤间及肿瘤内的高度异质性、CSC的可塑性、基因型和表型间的变化、基因突变等原因，准确识别CSC存在巨大的难度^{[13, 18]}。基于CSC的自我更新能力及分化潜能，连续肿瘤移植测定已成为判断细胞群内是否含有CSC的金标准^[19]。通过长期的蛋白质组学分析^[20-24]，部分CSC的分子标志物被分析认证(表1)，其中，分化抗原(cluster of differentiation，CD)133、CD44作为CSC分子标志物的作用较为突出，在几乎所有类型的CSC中均有表达，或可作为鉴定CSC的辅助标准。

1.2 TME的特征及调控作用

TME由所有存在于肿瘤中的可维持、促进或阻碍肿瘤生长的非癌性因素组成。TME包括基质细胞、免疫细胞、癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)、血管内皮细胞、生长因子等，对于维持CSC干性(即其分化为非致瘤细胞的能力)、调控肿瘤生物学行为、放化疗抗性等具有重要意义^[34]。这些TME组分并非孤立发挥作用，而是通过精密的细胞通讯与微环境重塑，影响CSC对放疗的应答模式。其中，特定CAF亚群[如CD10及G蛋白偶联受体77(G protein-coupled receptor 77，GPR77)双阳性的CAF)可持续分泌白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等细胞因子，激活CSC内的神经源性位点Notch同源蛋白(neurogenic locus notch homolog protein，Notch)、无翅型MMTV整合位点家族成员(wingless-type MMTV integration site family member，Wnt)/β-连环蛋白(beta-catenin，β-catenin)、信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等信号通路，稳定其干性特征与自我更新能力，构建特异性CSC生态位，同时通过分泌胶原重塑细胞外基质，导致间质致密化与间质压升高，导致血流灌注不均，为CSC营造低氧微环境^[35]。免疫细胞则主导着放疗后CSC的免疫清除效率：M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)在照射区富集，分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)、IL-6等因子诱导肿瘤细胞发生EMT，从而获得CSC样表型，并可激活STAT3、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路增强CSC的抗凋亡与DNA修复能力^[36]；调节性T细胞与髓源抑制细胞通过调控细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)、免疫抑制性细胞因子及程序性死亡受体1(programmed cell death-1，PD-1)/程序性死亡配体1 (programmed death-ligand 1，PD-L1)轴，抑制CD8阳性的T细胞与自然杀伤(natural killer，NK)细胞的杀伤功能，使放疗后残余CSC免于被清除^[37]。

缺氧是TME的基本特征之一，缺氧可以维持CSC的自我更新，甚至可增加其数量^[38-39]。TME的缺氧条件可通过影响肿瘤细胞的葡萄糖代谢调控其生物学行为(如侵袭或增殖)。肿瘤细胞的葡萄糖代谢方式主要有2种：糖酵解途径和磷酸戊糖途径。研究^[40]证明，即使在富氧环境中，肿瘤细胞仍然以糖酵解方式为主而非氧化磷酸化，即瓦博格效应(Warburg effect)；在常氧环境中，磷酸戊糖途径促进肿瘤细胞的增殖过程；在缺氧环境中，肿瘤细胞的糖酵解较活跃，表现出强烈的侵袭和迁移行为。肿瘤细胞代谢方式的转换，与肿瘤细胞行为密切相关，符合“go or grow”假说^[28]。此外，TME的缺氧条件可激活多种信号通路例如缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α、HIF-2α、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路等增强CSC的干性和活性。HIF-1α还可诱导血管内皮生长因子的合成，在肿瘤区域促进新生血管形成，有利于CSC的能量摄取和转移^[41]。CSC位于肿瘤中称为生态位的特殊环境，生态位除了缺氧外，通常还兼具低pH值、低血糖的特点^[42]。酸性环境可以使TME呈现免疫抑制状态，主要通过3种途径实现：1)抑制非肿瘤细胞。酸性环境对正常细胞有毒性作用，导致T细胞、NK细胞潜在性死亡，对非肿瘤细胞的生长抑制作用更为明显^[43]。2)改变细胞代谢方式。酸性环境可抑制微环境中细胞葡萄糖代谢的糖酵解途径，从而更多地转向磷酸戊糖途径，减少了糖酵解途径代谢对T细胞的细胞因子的阻断，产生免疫逃避作用^{[42, 44]}。3)改变免疫细胞极性。酸性环境可促使免疫细胞如巨噬细胞、T细胞等极化为免疫抑制表型，抑制免疫反应对肿瘤的杀伤和清除^[45]。肿瘤细胞的高代谢及肿瘤环境的低血运导致了TME的低血糖，低血糖与缺氧促使大部分CSC进入休眠状态以应对不利环境，同时也是CSC固有的放化疗抵抗机制之一。

单个CSC无法独立生存，其干性依靠TME和生态位维持。癌症相关CAF是TME中一类丰富且异质的基质细胞，CD10和GPR77是癌症相关CAF的标志物，癌症相关CAF通过NF-κB亚基p65磷酸化和乙酰化介导的NF-κB的持续激活，促进肿瘤形成并赋予肿瘤化疗抵抗的能力。Su等^[46]通过分离乳腺癌中的CD10⁺GPR77⁺癌症相关CAF，将其与CSC共同注射进行移植实验，发现癌症相关CAF可以增强CSC的致瘤性、增殖活力及化疗抗性。此外，肌CAF可以分泌肝细胞生长因子，肝细胞生长因子可激活典型的无翅基因相关整合位点Wnt/β-catenin信号通路，导致肿瘤细胞去分化，从而维持CSC的数目^[47]。

2 CSC与放疗抗性机制

放疗对肿瘤的杀伤作用主要通过损伤肿瘤细胞的DNA实现，当肿瘤细胞的DNA损伤过多，无法修复，细胞会启动凋亡、衰老、有丝分裂灾变等程序，丧失分裂能力，从而达到姑息治疗或根治肿瘤的目的^[48-50]。放疗可通过直接和间接效应对DNA造成损伤^[18]，机制主要有2种：1)自由基损伤DNA。DNA周围的分子吸收电离辐射中的能量，产生大量高活性自由基，这些自由基与DNA链中的核糖、脱氧核糖等反应，导致脱氧核糖等分子变性、DNA链断裂、碱基缺失等^[51]。2)损伤DNA修复系统。正常情况下，DNA断链等损伤可以经过同源重组等方式修复，但是电离辐射产生的自由基等会损害修复过程需要的蛋白质分子，并与DNA修复所需原料反应，导致修复不足或修复过程停滞，最终造成细胞凋亡。理论上，只要电离辐射的剂量足够，所有肿瘤细胞均可被杀死，但这也会杀死健康组织细胞，因此放疗是在周围组织能承受的辐射剂量下，最大限度地杀伤肿瘤细胞的平衡过程。最初，Dizdaroglu^[51]和Hewitt^[52]等在等基因小鼠模型中进行肿瘤细胞移植实验，随后在人类异种移植肿瘤模型中复现，证明放疗的治疗潜力取决于这些模型中致瘤细胞的数量，即CSC的数量。这意味着放疗效果在很大程度上取决于对CSC的杀伤，放疗结束后，如果有残余的CSC存活，那么CSC通过分化、增殖又会重新形成肿瘤实体，并获得更强的放疗抗性^{[4-5, 53]}。

随着对肿瘤放疗认识的不断深入，基于放疗生物学理论，“5R原则”被提出：1)修复(repair)，即修复电离辐射造成的DNA损伤；2)再分配(redistribution)，即有丝分裂的细胞在不同周期对电离辐射的敏感性不同，具体而言，M期(有丝分裂期)>G₁期(M期结束到S期之间的间隙)>G₂期(DNA合成后期)>S期(DNA合成期)，经过电离辐射后，DNA损伤导致各个时期在修复完成前停滞，导致有丝分裂时期的比例重新分配；3)再生(repopulation)，即放疗区域内细胞增殖；4)再氧化(reoxygenation)，即放疗后放疗区域内的缺氧状况得到改善，氧合良好的组织对放疗敏感性增加；5)内在放射抗性(intrinsic radioresistance)，即肿瘤及个体对放疗的敏感性存在异质性^[54]。随后，另有学者^[55]总结提出了第6个“R”：抗肿瘤免疫应答的激活(reactivation of anti-tumor immune response)。研究^[56]发现放疗优先杀伤非CSC的肿瘤细胞，换言之，CSC对电离辐射具有更高的放疗抗性。放疗后，如未能完全清除肿瘤细胞，则会得到一个CSC更加富集的肿瘤实体，同时由于电离辐射刺激及接触抑制减弱，会使处于G₀期的CSC进入细胞周期并增殖，并使非CSC的肿瘤细胞发生重新编程，转化为CSC，进一步增加CSC的数量^[57-58]。放疗效果与CSC数量密切相关，在同等剂量下，CSC比例高的肿瘤，其治愈率低于CSC比例低的肿瘤，这意味着要增加放疗剂量才能达到相同的治疗效果；同时，电离辐射的治疗效果还与CSC的数目、密度、固有放射抗性呈负相关^[18]。因此，降低CSC的放疗抗性、提高其放疗敏感性是放疗中必须要考虑的重点之一。目前，CSC的放疗抗性机制主要包括DNA损伤修复、EMT、缺氧、自噬等的相关信号通路。

2.1 CSC与DNA损伤修复

电离辐射对DNA的损伤可导致碱基损伤、脱落、交联甚至DNA链断裂，DNA链断裂包括单链断裂和双链断裂，特别是双链断裂对细胞的影响是最为致命的^[59]。在细胞正常有丝分裂过程中，整个过程可被划分为G₁期、S期、G₂期、M期，在细胞分裂间期存在2个必须要经过的检查点：G₁检查点决定细胞是否进入S期进行DNA复制，G₂检查点决定细胞DNA复制是否正确、能否进入G₂期。检查点的作用在于阻止DNA损伤的积累及传播，细胞经过检查点时如果存在DNA损伤，其细胞周期会停滞并启动DNA修复程序，直到修复完成，方可进入下一时期，如果损伤不能修复，则可能会发生凋亡^[60]。碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)、重组修复是较常见的3种DNA损伤修复方式。

2.1.1 BER

BER是指切除和替换DNA碱基损伤的修复方式，主要针对DNA单链断裂和小的碱基改变(包括氧化、甲基化等)，也是人体主要的DNA修复方式。BER过程由糖苷酶启动，糖苷酶能识别受损碱基并通过水解糖苷键将其切除，从而在DNA骨架上产生一个无碱基的裸露的脱嘌呤/脱嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)位点，随后AP内切核酸酶在AP位点的5’端切断DNA骨架的磷酸二酯键，AP外切核酸酶再切割AP位点的3’端，产生的空缺由DNA聚合酶利用互补链进行填补，最后由DNA连接酶连接成完整的链，完成修复^[61]。BER过程由多种酶协同完成，并且1种酶对应切除1种碱基。例如，尿嘧啶-DNA糖苷酶特异性切除DNA中的尿嘧啶^[62]。研究^[63-65]表明：放化疗后的CSC亚群可显著上调多种DNA修复基因，尤其是BER及单链损伤修复相关因子，从而使其较非CSC群体能够更迅速地清除电离辐射诱导的氧化碱基损伤与单链断裂。这种高效的BER机制被认为是CSC获得放疗抵抗能力、并在治疗后出现克隆富集的重要分子基础之一。

2.1.2 NER

NER是人体内识别DNA损伤种类最多的修复通路，主要识别影响碱基配对并造成DNA双螺旋结构异常的损伤^[66]。与BER不同，NER不识别任何异常的碱基损伤、不对个别碱基进行修复，而是识别结构异常的DNA双螺旋结构，在修复过程中将含有异常结构的一段DNA切除^[67]。NER是基于模板的修复方式，必须有完整的DNA链才能完成正确修复，其包括2条途径：一是全基因组-NER(global genome-NER，GG-NER)，能在基因组任何部位移除受损DNA，由着色性干皮病C组(xeroderma pigmentosum, group C，XPC)、人类RAD23同源物B(recombinant RAD23 homolog B，RAD23B)和中心体蛋白2(centrin-2)组成的XPC复合体扫描识别损伤DNA；二是转录偶联-NER(transcription-coupled NER，TC-NER)，由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA POL Ⅱ)负责识别损伤DNA，随后在损伤DNA处募集通用转录因子Ⅱ H(general transcription factor Ⅱ H，TFIIH)，TFIIH验证损伤并解旋受损的DNA，通用转录因子复合体结合受损DNA并将其从5’端切开，以完好的DNA互补链为模板合成新链，随着合成进行，在损伤的3’端进行第二次切割，损伤的DNA片段脱落，新合成的DNA片段通过DNA连接酶与原链结合，完成修复^[67-69]。对于铂类药物及紫外辐射等引起的庞大DNA加合物及双螺旋结构畸变，CSC常表现为XPC、切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)等NER核心因子的表达上调或活性增强，从而可较普通肿瘤细胞更有效地识别并移除此类损伤^[70]。在宫颈癌等实体瘤中，抑制NER相关通路可选择性削弱CSC的DNA修复能力，并提高其对放疗的敏感性，提示NER相关通路的强化同样参与维持CSC的放疗抗性^{[64, 70]}。

2.1.3 重组修复

切除修复能精准修复的重要前提之一是DNA损伤仅存在于DNA双链中的一条链中，尚存另一条链储存着正确完整的遗传信息。对于DNA双链损伤则必须使用重组修复，利用DNA复制中形成的姐妹染色单体来恢复正常的遗传信息，根据DNA末端连接的同源性，可将重组修复分为同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)。由于需要广泛的末端切除，HR修复较为缓慢；同时，由于需要姐妹染色单体的DNA序列，所以HR主要在S期和G₂期发挥作用，对DNA双链断裂修复的贡献相对NHEJ较弱^[71]。

HR途径中，在检测到双链断裂后，首先外切核酸酶将DNA双链的5’端剪开，留下的游离3’端单链与DNA修复蛋白RAD52(DNA repair protein RAD52 homolog，RAD52)结合以避免末端被降解，在RAD52后面的DNA单链与DNA修复蛋白RAD51(DNA repair protein RAD51 homolog，RAD51)结合以便于进入姐妹染色单体，形成典型的霍利迪连接体结构，随后进行单链DNA区域的合成、分支迁移和连接解析等过程，完成双链修复^[72]。多种实体瘤的CSC或干细胞样细胞中，均观察到RAD51及其辅因子表达上调，且DNA双链断裂后，RAD51焦点形成显著增强，HR修复效率明显高于非CSC群体^[73]。使用RAD51抑制剂或更广谱的DNA损伤应答(DNA-damage response，DDR)抑制剂联合放疗，在胶质瘤干细胞样细胞中可有效抑制HR介导的双链断裂修复，并显著增强放疗的杀伤效果，表明“CSC偏向依赖的HR通路”是其电离辐射耐受的重要机制之一^[73-74]。

NHEJ是DNA双链修复最主要的方式，负责修复G₀期和G₁期几乎全部的双链断裂，同时在S期和G₂期也发挥巨大的作用，可修复约80%的双链断裂^[75]。根据是否使用核心的NHEJ蛋白如DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)和DNA解旋酶II 70 kD亚基(DNA helicase II 70 kD subunit，KU70)/DNA解旋酶II 80 kD亚基(DNA helicase II 80 kD subunit，KU80)异二聚体可分为经典NHEJ和替代末端连接(alternative nonhomologous end-joining，ANHEJ)。在识别到DNA双链断裂(double-strand break，DSB)之后，经典NHEJ通过结合KU70和KU80异二聚体及募集DNA-PKcs来稳定DNA的游离端。肿瘤蛋白p53结合蛋白1(tumor protein p53 binding protein 1，53BP1)和KU70/80阻止DNA切除，这是其他类型DSB修复过程的第一步。NHEJ以DNA-PKcs依赖的方式招募其他核心NHEJ蛋白，包括X射线交叉补体蛋白4(X-ray repair cross-complementing protein 4，XRCC4)，DNA连接酶4(DNA Ligase IV，LIG4)，XRCC4样因子(XRCC4-like factor，XLF)，以及最近发现的XRCC4和XLF的同源蛋白(paralog of XRCC4 and XLF，PAXX)，它们共同调控DNA的排列和连接。如果缺乏核心NHEJ蛋白或当NHEJ/HR启动但未能完成修复时，作为修复补偿可能会启动ANHEJ进行修复，但ANHEJ的具体修复方式尚不清楚^[72]。

因为独立于模板的修复方式，所以NHEJ相比HR更易出错，同时HR和NHEJ修复后的细胞具有更高的放疗敏感性，也会增加正常细胞癌变的风险。除是否存在姐妹染色单体外，决定双链修复方式的关键因素还包括DNA 3’末端突出之间的同源性，如果末端长度小于20 bp，则称为微同源性，其取决于DNA末端保护与切除的程度。经典NHEJ一般不需要微同源性，或仅利用1~4 bp的末端微同源性；ANHEJ通常需要至少2 bp(通常更多)且小于20 bp的微同源性，HR的同源性要求通常超过100 bp^[75-76]。动物及细胞实验^[77]进一步表明，采用药理手段抑制DNA-PKcs或其他NHEJ关键组分，不仅可促进CSC分化、削弱其干性特征，还能显著提高其对放疗的敏感性，因此，“靶向CSC中的NHEJ修复轴”被视为克服肿瘤放疗抗性的潜在策略之一。

2.2 CSC与EMT

EMT是一个涉及胚胎发生、伤口愈合和器官纤维化的发育过程，可分为3种类型：I型EMT涉及着床、胚胎发生和器官发育^[78]；II型EMT促进组织再生和器官纤维化^[79]；III型EMT在癌症的发生和发展中发挥作用，促进转移并导致治疗抵抗^[80-81]。EMT是维持CSC干性的关键调节过程。EMT诱导转录因子包括锌指结合转录因子(snail family zinc finger，Snail)1/Snail2、基本螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)因子、Twist相关蛋白(twist-related protein，TWIST)1/TWIST2和锌指E-box结合同源盒因子(zinc finger E-box binding homeobox factor，ZEB)1/ZEB2^[82]。在永生化或转化的人乳腺上皮细胞中过表达SNAI1、SNAI2或TWIST，可诱导干细胞标志物表达，而抑制这些EMT诱导转录因子可阻断乳腺重建和降低肿瘤起始活性^[83-86]。ZEB1还可通过抑制EMT相关过程的微小核糖核酸(microRNA，miR；如miR-200s、miR-183和miR-203)对乳腺癌、胰腺癌和结直肠癌细胞赋予干细胞特性。EMT的诱导因素众多，除以上诱导转录因子外，还包括高剂量活性氧(reactive oxygen species，ROS)、电离辐射、HIF和STAT等，这些因素通过激活TGF-β、Wnt、刺猬信号通路(hedgehog signaling pathway，Hedgehog)、Notch、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)/PI3K/AKT和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信号通路激活EMT^[83-86]。

2.3 CSC与缺氧

在肿瘤的发生和发展过程中，缺氧作为TME的重要组成部分发挥了保护和维持CSC、产生抗肿瘤治疗抗性、促进肿瘤转移等诸多作用。HIF是参与细胞氧信号通路的转录因子，由氧敏感α亚基(包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和HIF-1β亚基组成，在缺氧条件下HIF因子进入细胞核与缺氧调控元件结合，调节下游靶基因的表达。缺氧通过驱动瓦尔堡效应(Warburg effect)与酸中毒，重塑肿瘤代谢并诱导免疫抑制微环境，间接削弱放疗效果^[87-88]。缺氧诱导HIF表达增加，HIF可促进血管内皮生长因子表达，促进新生血管生成，一定程度上可改善缺氧情况、增加放疗敏感性，但同时也为肿瘤提供了营养物质，可促进肿瘤增殖。缺氧是常见的EMT激活剂，在缺氧条件下，HIF-1α可以激活EMT过程，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，同样也是肿瘤细胞产生耐药的原因之一^[89]。同时，缺氧是维持CSC干性、介导产生放化疗耐药性的重要环节。在缺氧条件下，从口咽癌细胞系中分离出的CSC在电离辐射后更快地表达HIF-1α，抑制HIF-1α表达后，CSC和肿瘤细胞的放射敏感性均显著增加^[90]。Notch、Wnt和Hedgehog等通路是参与CSC自我更新的经典信号通路，同时也是EMT发生的下游信号通路，缺氧可以激活这些通路来维持CSC干性，高度同源的HIF-1α和HIF-2α也可以通过激活Notch途径来维持CSC的干性^[91]。缺氧条件下，Notch1信号被激活并增加性别决定区Y-box 2启动子(sex-determining region Y-box 2 promoter，SOX2)的活性，进而介导卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cell，OCSC)的耐药性^[92]。在乳腺癌中，HIF-2α可以激活Notch，促进乳腺癌干细胞表型(breast cancer stem cell phenotype，BCSC)转化，并增加其对紫杉醇的耐药性^[93]。Wnt通路可以调节各种干细胞(包括CSC)的更新，Wnt/β-catenin作为Wnt信号转导的经典通路，已被证明与多种癌症有关，包括结直肠癌、肝癌、乳腺癌等^[94-96]。在缺氧条件下，HIF可直接激活胚胎干细胞中的Wnt/β-catenin信号转导并影响β-catenin的转录活性，抑制Wnt通路可以逆转HIF过表达诱导的耐药性^[93]。

2.4 CSC与自噬

和EMT类似，自噬也是维持CSC干性的关键环节。自噬最初是指细胞将细胞质物质运输至溶酶体中进行降解，随后扩展到受损细胞器、外来病原体、错误折叠蛋白等的分解代谢过程。常见的自噬形式有3种：自噬-伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬^[97]。自噬对于维持细胞稳态有着非常重要的作用，在肿瘤细胞发生和发展的不同阶段，自噬有着不同的作用和表现。肿瘤发展的初期，自噬抑制肿瘤的发展进程，在肿瘤进程的后期，自噬促进肿瘤细胞转移和产生放化疗抗性。在营养剥夺、缺氧、感染、氧化应激等应激条件下，肿瘤细胞激活自噬程序收回核苷酸、氨基酸等物质以满足自身营养物质需求和增强对环境的抵抗能力。干细胞(包括正常组织干细胞和CSC)依靠自噬来维持自身不断更新和分化的能力。在神经干细胞中，自噬通过提供代谢物来促进神经生成；在造血干细胞中，叉头框蛋白O3a(forkhead box O3a，FoxO3a)诱导自噬以维持干细胞干性；在肿瘤组织中，乳腺癌干细胞通过自噬形成乳腺球从而获得侵袭能力，并且与普通乳腺癌细胞相比，乳腺癌干细胞的自噬通量显著升高^[98]。自噬的调控通路众多，其中PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路较为重要。在细胞应激条件下，抑制mTOR可诱导自噬；而在营养丰富的正常状态下，mTOR通过抑制自噬相关蛋白13(autophagy-related protein 13，ATG13)蛋白抑制UNC-51样激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)复合物及自噬。自噬程序高度激活也会抑制EMT过程的激活，抑制mTOR通路可通过抑制EMT来抑制肿瘤的侵袭和迁移，但同时会升高细胞自噬水平，提高肿瘤对放化疗的抵抗能力^[99]。因此，在考虑肿瘤治疗方案时，应将自噬、EMT、CSC三者综合考虑，以获得更好的治疗效果。

2.5 CSC与非CSC在放疗抗性关键通路上的差异

在DDR与修复方面，研究^{[53, 100-102]}发现CSC相比非CSC具备更强的损伤感知与修复效能。例如，CSC在辐射后能更快速地清除磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX)焦点，并上调共济失调毛细血管扩张突变激酶(ataxia telangiectasia mutated kinase，ATM)/共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase，ATR)/检查点激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)/检查点激酶2(checkpoint kinase 1，CHK2)、RAD51及DNA-PKcs等关键因子，从而同时增强HR与NHEJ的修复能力。同时，在乳腺癌、胶质瘤等模型中，ALDH1阳性/CD133阳性的CSC亚群表现出更高效的DNA双链断裂修复与复制叉保护能力，导致放疗后残余细胞中CSC比例显著上升。这些证据^{[53, 100-102]}共同表明增强的DNA损伤修复与复制胁迫缓冲能力是CSC放疗抗性的分子基础。

在自噬水平及其与放疗关联方面，CSC通常表现出更高的基础自噬通量。研究^[103-104]显示：CD44⁺/CD133⁺结直肠CSC亚群中微管相关蛋白1轻链3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II)/微管相关蛋白1轻链3-I(microtubule-associated protein 1 light chain 3-I，LC3-I)的比值及自噬流显著高于亲本非CSC，而抑制自噬可在多种肿瘤模型中干扰CSC的存活与干性维持。此外，在缺氧与放疗应激下，自噬可通过清除受损线粒体、减少ROS累积，协助CSC适应治疗压力，并与免疫抑制、EMT等过程形成互动网络，共同塑造具有“高自噬-高抵抗”特征的CSC亚群^{[103, 105]}。需注意的是，自噬与CSC放疗抵抗的关系可能具有情境依赖性，在某些肿瘤类型中表现不一致，提示靶向自噬需考虑肿瘤组织及CSC亚群的异质性^[104-105]。

在EMT与CSC放疗抵抗的交叉调控方面，EMT不仅促进肿瘤细胞的迁移侵袭与免疫逃逸，还与DNA损伤修复能力的提升直接关联。典型EMT转录因子ZEB1已被证实是ATM激酶的底物，可在辐射后被ATM磷酸化并稳定，进而上调CHK1，增强DDR，从而显著提高乳腺癌细胞及CSC样细胞的放疗抵抗性^[106]。综合多种肿瘤模型证据，EMT所诱导的CSC特征往往伴随HR/NHEJ相关因子的上调及细胞周期分布的改变，使更多CSC处于修复能力更强的S/G₂期，从而更易逃避辐射杀伤^{[53, 107]}。因此，EMT-CSC-DDR构成一个功能上相互强化的模块：EMT促进CSC富集和DNA修复增强，而CSC又通过维持EMT表型进一步巩固其放疗抗性^{[53, 106-107]}。

3 治疗策略

CSC依托包括DNA损伤修复、EMT等诸多机制抵抗电离辐射对其的杀伤效果，造成疗效不佳、肿瘤复发等后果。因此，可针对CSC放疗抗性产生的机制，阻断相关通路激活和减少免疫逃避来增强CSC放疗敏感性和杀伤效果(图1)。

3.1 针对TME和EMT的放疗增敏策略

TME对于肿瘤迁移、免疫逃避、干细胞干性的EMT具有重要意义，因此针对TME缺氧、酸性等特征也是近年来的研究热点。理论上，改善T细胞功能和缓解免疫抑制的最直接策略是通过复氧逆转肿瘤的缺氧状态。在黑色素瘤模型小鼠中，复氧增强了效应T细胞的肿瘤浸润，上调了促炎细胞因子的表达，并降低了调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的抑制活性^[108-109]，复氧对肿瘤的作用还体现在减少EMT，可抑制肿瘤的侵袭和迁移能力，同时还可改变肿瘤的代谢方式。糖酵解和氧化代谢之间的平衡在许多系统中决定了干细胞静止与分化的比率，尽管因为Warburg effect，肿瘤在复氧后仍较多以糖酵解方式代谢，但其氧化磷酸化的代谢比例会增加，这使得部分处于“休眠”状态的CSC被激活，导致这部分CSC对电离辐射诱导的自由基杀伤更为敏感，提高其放疗敏感性^[110-113]。

复氧、血管正常化、HIF抑制剂及针对乳酸代谢的干预方式，在多种动物模型中已被证明可增强效应T细胞浸润、降低Treg/M2型TAM的比例、抑制EMT与侵袭表型，从而与放疗及免疫治疗产生协同作用^[114-116]。但在临床转化层面，不同肿瘤类型乃至同一肿瘤内部的缺氧程度具有高度异质性，缺乏统一、可推广的缺氧分层与动态监测手段。同时，全身性调控代谢或HIF信号可能面临毒性阈值限制，如何在避免加重心血管、骨髓等正常组织损伤的前提下，实现“可持续复氧”并精准靶向CSC，仍需更多前瞻性随机试验进一步验证^[115-117]。

3.2 针对DNA损伤修复的放疗增敏策略

放疗后，肿瘤细胞应对电离辐射所致DNA链断裂最主要的机制是重组修复，CSC通过上调HR、NHEJ等修复途径中的核心因子，显著提高其对DNA双链断裂的修复效率，这是其放疗抗性的重要基础。损伤修复相关通路的抑制剂可人为制造修复方式缺陷，干扰其在放疗后DNA损伤修复的有效完成，增强放疗敏感性。目前，多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、CHK1、有丝分裂进入抑制蛋白激酶(Wee1-like protein kinase，WEE1)和ATM的抑制剂均取得了良好的效果^[118]。PARP抑制剂已经在多种HR缺陷肿瘤的临床前和早期临床研究中显示出与放疗的“合成致死”和免疫激活潜力；ATM/ATR、DNA-PKcs、CHK1/CHK2、WEE1等靶点的抑制剂亦在多种实体瘤和CSC富集性肿瘤(如胶质母细胞瘤、头颈鳞癌)中表现出一定的放疗增敏作用^[119-122]。然而，靶向DDR网络同样是正常造血干细胞和高增殖组织维持基因组稳定性的关键路线，DDR抑制剂联用放疗往往伴随骨髓抑制、皮肤黏膜毒性加重及患者耐受剂量受限等问题^{[119, 121-122]}。一方面，目前患者筛选主要基于BRCA和HRD等基因的改变，而非CSC特异的修复表型，真正意义上的“CSC成瘾型DDR依赖”的临床分层尚待建立；另一方面，肿瘤细胞可通过启动替代修复通路、改变细胞周期分布等方式获得对DDR抑制剂的继发耐药性^{[120, 122]}。因此，未来DDR抑制联合放疗的优化方向，不仅在于筛选合适的分子亚型和CSC富集肿瘤类型，更在于精细设计给药时序与分割方案，并与免疫治疗或代谢干预组合，在扩大CSC特异“治疗窗”的同时尽量降低对正常组织的不可逆损伤。

3.3 质子治疗

CSC对于电离辐射拥有更高的放疗抗性，在常规光子放疗剂量下仍可存活并导致复发。尽管质子治疗已经出现了几十年，但是临床上仍然较多地使用常规光子治疗作为主要的放疗方法，质子治疗使用比例不足30%^[48]。常规光子治疗过程中，所有组织连续乘积剂量，除了杀伤正常组织外，也会更多地受到正常组织放疗耐受性的限制，难以在CSC富集区域进一步选择性地提高放疗剂量。质子治疗在放疗过程中其剂量呈现布拉格峰，即在路径中形成一个最高峰，粒子能量在此达到极点，远离此处位置则会迅速降低。采用质子治疗时，将肿瘤组织置于峰值部位，健康组织将更少地暴露于电离辐射中，意味着在健康组织耐受范围内，可以选择性地提高CSC实际接受的有效剂量，增强对肿瘤细胞的选择性杀伤能力。已有较多证据^[123-126]证明：质子治疗有助于降低对心血管、内分泌和神经认知等的远期毒性，可在正常组织耐受范围内对CSC富集区域实现剂量提升。在青年、儿童等人群的恶性肿瘤治疗过程中，质子治疗结束后的不良反应等更少，展现出更广泛的适用性^[127]。然而，质子中心的建设与运营成本高，可及性较弱，导致实际接受质子治疗的患者比例远低于理论可获益人群^[123-124]；同时，质子射程和相对生物学效应(relative biological effectiveness，RBE)随组织密度和空间位置变化而存在不确定性，目前仍需更多循证医学证据的支持^[125-126]。

4 结语与展望

放疗抗性是肿瘤治疗中难以避免的痛点，随着对肿瘤认识的加深及对肿瘤成分进行细分后，CSC成为肿瘤治疗中不可忽视的关键群体。CSC的自我更新和分化能力极有可能导致复发和转移，这使得彻底杀灭所有CSC成为肿瘤治疗的首要目标。相比于普通肿瘤细胞，CSC在TME、EMT等方面均有独特特性，使其更能耐受不良刺激。针对CSC产生放疗抗性的特异性机制采取特定或者联合治疗方案，能更有效地杀伤CSC，降低复发风险，延长肿瘤患者的生存时间并改善其生活质量。

本综述系统阐述了CSC介导放疗抵抗的多层次网络。CSC通过增强DNA损伤修复、维持高水平自噬与代谢适应、激活EMT及免疫逃逸，并依托缺氧、酸性与免疫抑制的TME，共同构建了一个稳固且动态的耐受体系。为将上述机制转化为临床获益，未来研究可重点聚焦以下几个方向：首先，借助单细胞和空间组学等技术，精细解析CSC的异质性、可塑性及其与生态位的动态互作，建立可用于临床分层和疗效预测的CSC评估体系。其次，应从孤立通路研究转向构建CSC放疗应答的“时空网络模型”，在统一框架下整合DNA修复、EMT、自噬与TME重塑等多模块的协同机制，为分割设计和剂量优化提供理论支撑；同时，治疗思路应从单纯“直接杀伤CSC”扩展到“瓦解其生态位”，通过逆转缺氧、重编程基质与免疫细胞等策略，削弱TME对CSC的外部支持，提升放疗及全身治疗的综合效应。再次，治疗策略需从“单靶点抑制”升级为基于CSC特异性“通路成瘾”的智能联合，优化放疗的时序配合，并结合分子和影像标志物实现患者精准筛选与动态调整，以在扩大CSC靶向效应的同时尽量控制全身毒性。最后，有必要发展类器官、人源化动物模型等更接近临床实际的临床前评价体系，并推动临床试验终点由传统的局部控制率，逐步向涵盖CSC负荷、功能影像和免疫应答在内的综合评价体系转变；在此基础上，将放疗技术与人工智能等先进技术进行跨学科融合，实现基于CSC和TME特征的“定向剂量绘画”，帮助突破CSC的放疗抗性。

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基金资助

国家自然科学基金(82401136┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ┣82401136)

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