UPLC-MS/MS测定生物样本中替来他明及其代谢物方法的建立及应用

Establishment and application of a UPLC-MS/MS method for the determination of tiletamine and its metabolite in biological samples

摘要

目的 兽用麻醉剂替来他明为新型毒品替代物，在全球多地区出现滥用情况，对公众健康造成巨大危害，但其检测方法的灵敏度难以满足法医学实践需求。本研究旨在建立一种测定人体生物样本中替来他明及其代谢物去乙基替来他明的超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法，并通过方法学验证其能否应用于法医学实践。 方法 选择SKF_525A为内标，采用乙腈(含1 ng/mL SKF_525A)萃取生物样本，漩涡振荡10 min，超声处理20 min，以10 000 r/min离心10 min，取500 μL上清液经0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱系统(ACQUITY UPLC H-Class PLUS)和三重四极杆质谱仪(XEVO TQ-S Micro)进行检测。色谱条件采用ACQUITY UPLC^® BEH C18(1.7 µm, 2.1 mm×100 mm)色谱柱，0.3 mL/min流速，考察4种流动相体系(20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+甲醇、20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+乙腈、水+甲醇、水+乙腈)对替来他明及去乙基替来他明的分离效果。质谱条件采用电喷雾离子源正离子模式(electrospray ionization in positive mode，ESI+)、多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)，替来他明和去乙基替来他明分别选用质荷比为224.043→179.016、196.08→151.06作为定量离子对。以添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、 200 ng/mL替来他明的血样的质谱响应值为纵坐标，替来他明浓度为横坐标，通过最小二乘法进行线性回归获得校准曲线，考察替来他明在血样中的线性范围、检出限和定量限；选取替来他明低(5 ng/mL)、中(20 ng/mL)、高(100 ng/mL)3种浓度制备多份血液、肝脏及肾脏的阳性添加样本和空白样本，经前处理后上机进行检测分析并记录其响应值，考察替来他明在不同生物样本中的精密度、准确度、基质效应、提取回收率和稳定性。最后，采用UPLC-MS/MS定量检测实际案例获取的替来他明样本，以验证其适用性。 结果 建立的UPLC-MS/MS法可同时检测人体生物样本中的替来他明及代谢物去乙基替来他明，保留时间分别为3.42 min和2.82 min。以流动相A(20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液)和流动相B(乙腈)梯度洗脱替来他明和去乙基替来他明的效果最佳。血液样品中替来他明在0.1~200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.992，决定系数R²=0.983，检出限为0.03 ng/mL，定量限为0.1 ng/mL，提取回收率为92%~107%，基质效应为71%~99%；肝脏样本中的提取回收率为91%~98%，基质效应为69%~96%；肾脏样本中的提取回收率为93%~104%，基质效应为72%~100%。本方法在不同样本中的日内、日间精密度[以相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示]和准确度[以相对误差(relative error，RE)表示]均控制在15%以内，且样本在-20 ℃冻存条件下表现出良好的稳定性。从实际案件获取的生物样本中检测到替来他明成分：案例1血液、肝脏、肾脏样本含量分别为0.37 μg/mL、0.15 μg/g、0.11 μg/g，案例2血液样本含量为8.75 ng/mL；在血样中检测到代谢物去乙基替来他明成分。 结论 UPLC-MS/MS法高效、准确、灵敏，适用于人体生物样本中替来他明和代谢物去乙基替来他明成分的检测。

Abstract

Objective Tiletamine, a veterinary anesthetic, has emerged as a novel psychoactive substance and has been abused in many parts of the world, causing great harm to public health. However, the sensitivity of existing detection methods cannot meet the needs of forensic practice. This study aims to establish an ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method for the determination of tiletamine and its metabolite desethyltiletamine in human biological samples, and to verify its applicability in forensic practice. Methods SKF_525A was used as the internal standard. Biological samples were extracted with acetonitrile containing 1 ng/mL SKF_525A, vortexed for 10 min, ultrasonicated for 20 min, centrifuged at 10 000 r/min for 10 min, and 500 μL of the supernatant was filtered through a 0.22 μm membrane. Analyses were performed using an ACQUITY UPLC H-Class PLUS system and an XEVO TQ-S Micro triple quadrupole mass spectrometer. An ACQUITY UPLC^® BEH C18 (1.7 µm, 2.1 mm×100 mm) column at a flow rate of 0.3 mL/min was used, and four mobile phase systems were tested to optimize separation. Detection used positive electrospray ionization (ESI+) in multiple reaction monitoring (MRM) mode, with quantifier ion transitions of mass to charge 224.043→179.016 for tiletamine and mass to charge 196.08→151.06 for desethyltiletamine. Calibration curves were established over 0.1-200 ng/mL in spiked blood samples. The linear range, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) were determined. Low (5 ng/mL), medium (20 ng/mL), and high (100 ng/mL) concentrations of tiletamine were spiked into blood, liver, and kidney to evaluate precision, accuracy, matrix effect, recovery, and stability. Finally, actual forensic case samples were tested to validate applicability. Results The established UPLC-MS/MS method achieved simultaneous detection of tiletamine and desethyltiletamine in human biological samples, with retention times of 3.42 min and 2.82 min, respectively. Using mobile phase A (20 mmol/L ammonium acetate and 0.1% formic acid in water) and mobile phase B (acetonitrile) produced the best separation. In blood, tiletamine showed good linearity from 0.1-200 ng/mL (r=0.992, R²=0.983), LOD 0.03 ng/mL, LOQ 0.1 ng/mL, recovery 92%-107%, and matrix effect 71%-99%. In liver and kidney, recoveries were 91%-98% and 93%-104%, and matrix effects were 69%-96% and 72%-100%, respectively. Intra- and inter-day precision [expressed as relative standard deviation (RSD)] and accuracy [expressed as relative error (RE)] were within 15%, and samples were stable at -20 ℃. Tiletamine was detected in actual case samples at 0.37 μg/mL (blood), 0.15 μg/g (liver), 0.11 μg/g (kidney) in case 1, and 8.75 ng/mL (blood) in case 2; desethyltiletamine was also detected in blood. Conclusion The UPLC-MS/MS method is efficient, accurate, and sensitive, and is suitable for detecting tiletamine and desethyltiletamine in human biological samples.

Graphical abstract

关键词

法医毒理学 / 新精神活性物质 / 替来他明 / 去乙基替来他明 / 生物样本

Key words

forensic toxicology / novel psychoactive substances / tiletamine / desethyltiletamine / biological samples

替来他明是苯环己哌啶衍生物，属于非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，具有显著的止痛效应^[1-2]。在医疗实践中，替来他明常与唑拉西泮以1꞉1混合制成名为舒泰50(Telazol)的动物麻醉剂^[3-4]。替来他明的化学结构及作用机制与氯胺酮高度相似^[5]。近年来，随着执法部门对毒品打击力度的持续增强，不法分子开始将替来他明伪装成氯胺酮进行非法交易并滥用。在以往案例中，替来他明被掺入电子烟烟油、酒水及饮料中，通过欺骗手段诱导不知情者摄入，对公众健康构成了巨大威胁^[6-7]。许多研究^[8-9]表明：替来他明可对人类中枢神经系统产生显著的毒性效应，其典型临床症状包括肌肉抽搐、口齿不清、呼吸功能抑制和认知功能障碍。目前，多国出现了替来他明滥用的现象，相关中毒及死亡案例频繁发生^[10-14]。在中国，替来他明虽尚未被正式列为国家管制药物，但已被湖南省纳入非列管物质临时管制品种增补目录。目前，该物质在部分群体中已出现局部滥用现象，对社会秩序和公共安全构成现实威胁。因此，建立一种高灵敏度、高准确度的检测方法显得尤为迫切。

质谱法凭借其高灵敏度与准确性，成为检测替来他明的首选手段。何思阳等^[15]采用气相色谱四级杆飞行时间质谱(gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，GC-QTOF-MS)法成功定性检测了某药物辅助性犯罪案件尿样中的替来他明及其代谢物。宋辉等^[16]通过气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法在槟榔样本中实现了替来他明的定性与定量分析，其检出限和定量限分别为0.15 μg/mL和0.5 μg/mL。电子烟烟油燃烧过程中释放的替来他明可附着于大气颗粒物表面。闻武等^[6]通过采样器富集结合超高效液相色谱-串联质谱法，实现了对大气颗粒物中残留替来他明的定量检测。而张婧文等^[17]结合液液萃取和超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱法，实现了对人血样及尿样中替来他明的高灵敏度检测。Fenwick等^[18]通过液相色谱-高分辨率质谱(liquid chromatography-high resolution mass spectrometric，LC-HRMS)法在马肝的体外代谢模型中检测到替来他明和代谢物去乙基替来他明。然而，现有方法对人体生物样本中替来他明的定量检测灵敏度仍难以充分满足法医学实践中的检测需求，且无法实现对代谢物的有效检测。

本研究在已有工作基础上，建立了一种超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法用于人体生物样本中替来他明的定量分析及血样中去乙基替来他明的定性检测，并通过方法学验证其能否应用于法医学实践。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅基础医学院伦理委员会批准(审批号：2024-KT024)，并获得检测对象亲属的知情同意。

1.2 仪器和试剂

高效液相色谱系统(ACQUITY UPLC H-Class PLUS)和三重四极杆质谱仪(XEVO TQ-S Micro)均购自美国Waters公司；超声波清洗机(KQ5200DE)购自昆山市超声仪器有限公司；微孔有机滤膜(0.22 μm)购自天津科亿隆实验设备有限公司。

替来他明对照品(纯度>99.9%)购自上海原思标物科技有限公司，SKF_525A、甲醇、乙腈、甲酸及乙酸铵均为色谱纯，购自德国Merck公司。实验用水采用Milli-Q超纯水系统制得。

空白样本和阳性检材由湖南省湘雅司法鉴定中心提供，于-20 ℃冻存。

1.3 样品前处理

对照品储备液：精准称取替来他明对照品，用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的替来他明储备液，4 ℃保存。

对照品工作液及阳性添加样本：以甲醇为溶剂，对替来他明储备液进行梯度稀释配制工作液。取多份体积为1 mL的空白血液置于10 mL塑料离心管中，分别添加不同浓度对照品工作液配制成含0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL替来他明的阳性添加血样，加入1 mL乙腈溶液(含1 ng/mL内标SKF_525A)，漩涡振荡10 min，超声处理20 min，10 000 r/min离心10 min，取500 μL上清液经0.22 μm滤膜过滤后待测。

实际案例的血液样本及空白对照血液样本：取 1 mL血液置于10 mL塑料离心管中，加入1 mL乙腈溶液(含1 ng/mL内标SKF_525A)，漩涡振荡10 min，超声处理20 min，10 000 r/min离心10 min，取500 μL上清液经0.22 μm滤膜过滤后待测。

实际案例的组织样本及空白对照组织样本：将肝脏、肾脏组织剪碎研磨成匀浆，称取1 g组织置于10 mL塑料离心管中，加入1 mL乙腈溶液(含1 ng/mL内标SKF_525A)，漩涡振荡10 min，超声处理20 min，10 000 r/min离心10 min，取500 μL上清液经0.22 μm滤膜过滤后待测。

1.4 仪器条件

色谱条件：ACQUITY UPLC^® BEH C18色谱柱(1.7 µm，2.1 mm×100 mm)；柱温35 ℃；进样量 2 μL；替来他明和去乙基替来他明以流动相A (20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液)和流动相B(乙腈)，流速0.3 mL/min 洗脱，洗脱程序见表1。

质谱条件：离子源采用电喷雾离子源正离子模式(electrospray ionization in positive mode，ESI+)；扫描模式为多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)；毛细管电压0.5 kV；离子源温度500 ℃；干燥气流量为高纯氮气1 000 L/h；待测物的质谱参数见表2。

1.5 线性范围、检出限和定量限

取多份体积为1 mL的空白血液样本，根据1.3样品前处理方法处理血样，制备浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL替来他明的阳性血样及空白血样，每个浓度均制备3份平行样本，在1.4仪器条件下进行分析并记录其响应值，通过最小二乘法进行线性回归获得校准曲线。检测限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantification，LOQ)基于以下公式计算：LOD=3 σ_blank/m、LOQ=10 σ_blank/m(其中σ_blank是空白血样响应值的标准差，m是校准曲线的斜率)^[19]。σ_blank是通过连续测量空白血样10次，并计算其响应值的标准差获得。

1.6 精密度和准确度

取多份体积为1 mL的空白血样及质量为1 g的肝脏、肾脏样本，选取替来他明低(5 ng/mL)、中 (20 ng/mL)、高(100 ng/mL)3种浓度制备阳性样本，根据1.3样品前处理方法进行处理。每个浓度均平行制备3份样本，并在连续3 d内进行测定，在1.4仪器条件下进行分析并记录其响应值，考察方法的准确度[以相对误差(relative error，RE)表示]、日内和日间精密度[以相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示]。参照SF/T 0063—2020中对精密度和准确度的要求，日内、日间精密度的RSD值和准确度的RE值应控制在15%以内。

1.7 基质效应和提取回收率

取多份体积为1 mL的空白血样及质量为1 g的肝脏、肾脏样本，选取替来他明低(5 ng/mL)、中(20 ng/mL)、高(100 ng/mL)3种浓度制备阳性样本，根据1.3样品前处理方法进行处理。每个浓度均平行制备3份样本，并重复进样5次，在1.4仪器条件下进行分析并记录其响应值。基质效应及提取回收率的计算公式如下：

\mathrm{基质}\mathrm{效应}(\mathrm{\%})=\mathrm{\alpha }/\mathrm{\gamma }\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(1)

\mathrm{提取}\mathrm{回收}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=\mathrm{\beta }/\mathrm{\alpha }\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(2)

式中：\mathrm{\alpha }为空白基质样品经预处理后，添加低、中、高浓度替来他明溶液所测得的峰面积均值；\mathrm{\beta }为空白基质样品在预处理前，添加低、中、高浓度替来他明溶液所测得的峰面积均值；\mathrm{\gamma }为低、中、高浓度替来他明对照品溶液所测得的峰面积均值^[20]。

1.8 稳定性

取多份体积为1 mL的空白血样及质量为1 g的肝脏、肾脏样本，选取替来他明低(5 ng/mL)、中(20 ng/mL)、高(100 ng/mL)3种浓度制备阳性样本，根据1.3样品前处理方法进行处理，于-20 ℃冷冻条件下保存，每隔24 h在1.4仪器条件下进行分析并记录其响应值，以持续观察目标物在血液、肝脏及肾脏样品中的稳定性。参照SF/T 0063—2020中对稳定性分析的要求，当偏倚值超过±15%即视为该样品不具备稳定性。

2 结 果

2.1 色谱分析

实验以等梯度洗脱方法优化流动相体系，考察不同流动相体系对30 ng/mL替来他明阳性血样中替来他明分离效果的影响，结果(图1)发现：当采用水+甲醇作流动相时，色谱峰响应值较高，但峰展宽显著并伴随拖尾现象(图1C)；当采用水+乙腈作为流动相时，色谱峰拖尾(图1D)；当水中加入20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸后，可改善色谱峰峰形；当以20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+乙腈作为流动相时，色谱峰峰形高尖，响应值较高，且无拖尾现象。因此，本研究采用20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+乙腈来洗脱分离替来他明，结果(图1B)显示替来他明的保留时间为3.42 min，定性离子对的质荷比为224.043→179.016、224.043→96.931，定量离子对的质荷比为224.043→179.016，相对离子丰度比为32.75%。

在法医案例获取的血样中检测到替来他明的代谢物去乙基替来他明。去乙基替来他明的保留时间为2.82 min(图2)，定性离子对的质荷比为196.08→151.06、196.08→179.05，定量离子对的质荷比为196.08→151.06，相对离子丰度比为67.91%。

2.2 线性范围、<bold>LOD</bold>和<bold>LOQ</bold>

血样中替来他明在0.1~200 ng/mL范围内线性关系良好，线性方程为Y=8 830.92X-1 428.52(X为替来他明的质量浓度，Y为质谱响应值)，相关系数r=0.992，决定系数R²=0.983(图3)，LOD=0.03 ng/mL，LOQ=0.1 ng/mL。结果表明该方法的灵敏度和线性范围均符合法医学鉴定的要求。

2.3 精密度和准确度

结果如表3所示，低(5 ng/mL)、中(20 ng/mL)、高(100 ng/mL)浓度替来他明在不同生物样本中的RSD值和RE值均成功控制在15%以内。

2.4 基质效应和提取回收率

结果如表4所示，添加低(5 ng/mL)、中(20 ng/mL)、高(100 ng/mL)浓度替来他明的血样的基质效应均处于71%~99%，提取回收率为92%~107%；肝脏样本的基质效应均处于69%~96%，提取回收率为91%~98%；肾脏样本的基质效应均处于72%~100%，提取回收率为93%~104%。该结果表明本研究建立的提取方法对替来他明的损失较小。

2.5 稳定性

结果如表5所示，将添加低(5 ng/mL)、中 (20 ng/mL)、高(100 ng/mL)浓度替来他明的不同生物样本置于-20 ℃冰箱冷冻保存，检测后发现其响应强度会随时间的延长而改变。在-20 ℃冷冻条件下，血样中低浓度的替来他明在10 d内可以保持稳定，中浓度的替来他明在7 d内可以保持稳定，而高浓度的替来他明在5 d内可以保持稳定；肝脏样本中低、中、高浓度替来他明在10 d内均可以保持稳定；肾脏样本中低、中浓度在10 d内可以保持稳定，高浓度替来他明在9 d内可以保持稳定。

2.6 案例应用

案例1涉及1名39岁男性非正常死亡事件，死者生前存在吸毒史。死者经解剖，送检血液、肝脏、肾脏组织。将本案中的血样及组织样本于-20 ℃冷冻保存1 d后，依据本研究中建立的样品前处理和检测方法进行检测，从送检死者的血液、肝脏、肾脏样品中检出替来他明成分，其含量分别为0.37 μg/mL、 0.15 μg/g、0.11 μg/g。

案例2涉及1名26岁男性疑似吸食含替来他明电子烟后出现幻觉的高坠死亡事件。将本案中的血样于-20 ℃冷冻保存1 d后，依据本研究中建立的样品前处理和检测方法进行检测，从送检的死者血液中检出替来他明成分，其含量为8.75 ng/mL。

3 讨 论

流动相体系的优化对目标化合物的电离效率和质谱响应特性具有显著影响，直接决定检测结果的准确性。替来他明化学结构中包含哌啶基团，在酸性条件下易被质子化，形成带正电荷的离子(哌啶-H⁺)，宜采用酸性流动相以增强其离子化程度。通过系统比较不同流动相体系在ESI+下的色谱行为发现：水+甲醇体系虽能产生较高的响应值，但色谱峰展宽显著并伴随拖尾现象。改用乙腈作为有机相后，色谱峰尖锐度得到部分提升，但响应值较甲醇降低，且依旧存在拖尾现象，这与研究^[5]相符。进一步优化流动相，在水相中添加20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸后，色谱峰峰形得到显著改善，这是由于甲酸和乙酸铵能够调节pH，增强替来他明的电离效率，故采用 20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+乙腈来洗脱分离替来他明。此外，采用该流动相体系对血样中去乙基替来他明进行检测，结果显示色谱分离效能良好，响应稳定。

采用以上流动相体系，对替来他明对照品溶液、30 ng/mL替来他明阳性血样和空白血样进行扫描，确定替来他明的特征离子对的质荷比为224.043→179.016、224.043→96.931，鉴于前者具有更高的响应信号强度，选择质荷比224.043→179.016作为定量离子对。以定量离子对为参考离子，以峰高为离子信号强度，计算另一特征离子对的相对离子丰度比约为32.75%。此外，在法医案例血样中检测到代谢物去乙基替来他明，选择具有更高响应信号强度的质荷比196.08→151.06作为定量离子对，另一特征离子对的相对离子丰度比约为67.91%。同时，在空白血样中未检测到替来他明和去乙基替来他明的特征峰和特征离子对，方法特异性较好。

基质效应是指待测样品中的非目标成分抑制或增强信号导致待测物含量的测定值和真实值存在较大偏差，从而影响质谱的灵敏度和特异性的现象。这在UPLC-MS/MS分析中普遍存在。其主要受离子源类型、样品前处理和待测物性质等因素影响，需根据不同目标化合物的性质选用合适的离子源。采用有效的前处理方式可以将基质效应对结果的影响降至最低，在检测时需同时设置对照品添加空白基质样本做对比。提取后添加法是通过对比对照品溶液和预处理后添加基质样本中目标物的响应值来评估绝对基质效应(absolute matrix effect，AME)^[21-22]。在空白样本(血液、肝脏和肾脏)中加入低(5 ng/mL)、中 (20 ng/mL)、高(100 ng/mL)浓度的替来他明对照品，将获得的信号响应值与同浓度的替来他明对照品溶液进行比较，判断基质效应是否引起离子化增强(AME>100%)或抑制(AME<100%)。当AME为80%~120%时，可认为基质效应处于可接受范围^[23]。本研究结果提示：基质对替来他明的信号响应略有离子化抑制作用，在低浓度时更为明显；肝脏样本中的离子化抑制作用较其他样本更为显著，这可能是由于肝脏代谢旺盛，富含脂类、胺类及肽类等内源性干扰物质。提取回收率的计算应充分考虑基质效应对检出结果的影响，本研究采用空白基质样本预处理前添加低、中、高浓度替来他明溶液所测得的峰面积均值来计算提取回收率，得到的结果可作为真实回收率。

法医学实践中的样本检测通常存在时间延迟的现象，故研究替来他明在生物样本中精密度、准确度及稳定性至关重要。参照SF/T 0063—2020中对方法学验证的要求，日内、日间精密度的RSD值和准确度的RE值应控制在15%以内；当偏倚值超过±15%即可视为该样品不具备稳定性。本研究结果表明：在-20 ℃的条件下，血液、肝脏、肾脏样本中不同浓度的替来他明均可在5 d内保持良好的稳定性。这为法医学实践提供了有用的参考信息，特别是在短时间内无法分析样品的情况下。

综上，本研究成功建立了一种在人体生物样本中检测替来他明及其代谢物的方法。该方法前处理步骤简单、灵敏度高、样品用量少、操作简便。经验证，其选择性、线性范围、准确度、精密度、灵敏度和稳定性等指标均能满足生物样品定性、定量分析要求，适用于替来他明的法医学鉴定，为相关案件的侦破和司法判决提供了有力的技术支持。

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基金资助

国家自然科学基金(82402201)

长沙市自然科学基金(kq2402237)

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