成瘾行为大小鼠模型的建立与评价

Establishment and evaluation of rat and mouse models with addictive behaviors

摘要

药物成瘾行为动物模型通过模拟主动觅药、强迫性用药及复吸等核心行为，构建了研究中脑边缘奖赏环路的体系。大鼠和小鼠作为最常用的模式动物，其主流模型基于操作性条件反射与经典条件反射原理建立，其中自身给药范式能直接模拟主动觅药与强迫性用药，被视为“黄金标准”。这些模型在表面效度、结构效度和预测效度上各有特点，但仍难以完全模拟人类复杂社会认知维度。近年来，光遗传与化学遗传学技术实现了对特定神经元类型和环路的精准调控，推动研究从现象观察进入因果验证阶段。当前的研究趋势强调整合多模态行为范式、关注个体差异，并致力于将环路机制的基础发现转化为靶向干预策略，为理解成瘾机制和开发新治疗方法提供方向。

Abstract

Animal models of drug addiction simulate core behaviors such as active drug seeking, compulsive drug use, and relapse, thereby establishing a system for studying the mesolimbic reward circuit. Rats and mice serve as the most commonly used model organisms in this field. Mainstream models are developed based on the principles of operant conditioning and classical conditioning, among which the self-administration paradigm is regarded as the “gold standard” because it can directly simulate active drug seeking and compulsive drug use. These models demonstrate face validity, construct validity, and predictive validity to varying degrees, but also face limitations in fully replicating the complex cognitive and sociocultural factors of human addiction. In recent years, optogenetic and chemogenetic technologies have enabled precise spatiotemporal regulation of specific neuronal types and circuits, promoting research from phenomenological observation to causal verification. Current research trends emphasize integrating multimodal behavioral paradigms, focusing on individual differences, and striving to translate basic research findings into intervention strategies targeting specific neural circuits, providing direction for understanding addiction mechanisms and developing new treatment approaches.

关键词

自身给药 / 化学遗传学 / 光遗传学 / 条件位置偏爱 / 行为敏化 / 药物成瘾 / 动物模型 / 大鼠 / 小鼠

Key words

self-administration / chemogenetics / optogenetics / conditioned place preference / behavioral sensitization / drug addiction / animal models / rat / mouse

药物成瘾是一种慢性复发性脑疾病，其核心行为学特征为强迫性觅药和用药行为，且在药物减量或停用时会诱发不同程度的生理及心理戒断症状^[1]。该疾病的神经结构基础是中脑边缘奖赏环路，具体涉及从中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)投射到伏隔核(nucleus accumbens，NAc)多巴胺能神经元，通过调节突触间隙多巴胺(dopamine，DA)神经递质水平，并进一步投射至边缘系统和眶额叶皮层等关键脑区^[2-3]。值得注意的是，这一奖赏环路同时也是机体“趋利避害”本能行为的调控中枢，参与调节进食、性行为、逃避反应等有利于个体生存与种族延续的自然奖赏行为。

成瘾行为动物模型的建立，一方面有助于更好地理解动物成瘾行为的神经生物学本质，另一方面也为探索人类成瘾行为的治疗提供理想工具，具有重要意义。笔者通过总结成瘾行为动物模型的国内外最新研究进展，以啮齿类动物(尤其是大、小鼠)为例，对经典的成瘾行为动物模型的建立与评价方法进行优缺点比较，以期为开展成瘾相关基础研究时在大、小鼠模型选择上提供参考。

1 研究对象及饲养环境的选择

成瘾行为受品系、性别、年龄及饲养环境等多种因素影响，研究者可根据研究目的和需求选择合适的研究对象。啮齿类动物因生命周期短、繁殖力强、饲养成本低、便于实验操作，且具有明确的神经解剖图谱，已成为成瘾行为动物模型中最常用的物种。其中，大鼠在操作性条件训练中表现优异，能够更快掌握复杂任务，且体型和脑容量较大，便于手术操作，因此在涉及功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)和正电子发射体层成像(positron emission tomography，PET)等影像学及计算神经行为学^[4]、在体成像及电生理检测等成瘾行为相关研究中被优先选用。小鼠具有体积小、易于基因编辑等独特优势，在涉及基因编辑、神经元活性操控、环路示踪、光遗传及化学遗传等技术的成瘾行为动物模型研究中应用广泛。由于成瘾易感性及相关神经环路功能在人类和啮齿类动物中均存在性别差异^[5]，研究者需要根据不同的研究目的选择不同性别的大、小鼠。如在食物限制或低剂量自身给药(self-administration，SA)条件下，雌鼠对甲基苯丙胺^[6]、可卡因^[7-8]、芬太尼^[9]等精神活性物质的摄取速度更快、使用剂量更大，且在线索和低剂量甲基苯丙胺激发下表现出更高的复发易感性。在雌鼠吗啡-SA和海洛因-SA成瘾行为模型中，雌鼠的断点均显著高于雄鼠，提示其觅药动机更强^[10]。在条件位置偏爱模型(conditioned place preference，CPP)中，雌鼠氯胺酮-CPP评分显著高于雄鼠^[11]，且形成可卡因- CPP所需的阈剂量低于雄鼠^[12]。此外，在行为敏化(behavioral sensitization，BS)模型中，雌鼠对可卡因^[13]、甲基苯丙胺^[14]所致的运动激活效应更为敏感。上述性别差异主要与激素水平和动情周期密切相关。催产素^[15]、雌激素、孕酮及性腺切除术^[16]均能影响动物成瘾行为。在可卡因-SA模型中，发情期的雌鼠表现出对可卡因的需求量增加^[17]，断点升高^[18]，戒断期觅药行为更强^[19]，复吸易感性增加^[20]。在人类群体中，物质使用通常始于青春期至成年早期^[21]。这一阶段的神经发育特点使得大脑对成瘾物质尤为敏感；同时，青春期物质暴露可通过干扰神经发育进程导致长期脑功能损害^[22-23]，且初次使用年龄与成瘾的严重程度及不良预后密切相关。具体而言，初次饮酒年龄与乙醇使用障碍发病风险呈负相关^[24]。动物模型试验^[25]亦证实青春期乙醇暴露会显著增加成年期饮酒摄入量。青春期尼古丁暴露使雄性小鼠的DA回路停滞在不成熟状态，增加成年期的尼古丁成瘾易感性^[26]。青春期大麻素暴露，虽然不改变成年期形成大麻素成瘾样行为，但会增加冲动性样行为^[27]。作为典型的群居动物，大、小鼠的社交行为与饲养环境是其成瘾行为的重要影响因素。积极的社交互动与环境丰富化能显著抑制动物的药物寻求行为。具体而言，社交互动能够有效抑制甲基苯丙胺 和海洛因SA行为的发生^[28]；在群体中处于优势地位的雄性大鼠亦表现出对SA的易感性降低^[29]。反之，负面的社交经历则会增加成瘾易感性：早期社交隔离应激可增强海洛因戒断后的觅药行为^[30]，而经历社交挫败的小鼠其可卡因SA率也显著升高^[31]。

此外，成瘾个体常表现出“同伴同质化”的社交聚集倾向。当个体与有相同药物使用史的同伴接触时，这种社交互动可能形成正反馈循环，导致药物摄入增加，成瘾记忆巩固，并最终显著提升复吸风险。近期关于阿片类药物的研究为此提供了直接证据^[32]。在SA模型建立过程中，由于手术原因需单笼饲养，对结果的解读需要考虑社交隔离对成瘾行为的影响。

综上所述，在成瘾相关研究中，应考虑动物的性别、年龄及饲养环境对成瘾行为的影响，选择合适的研究对象，或是针对不同性别、不同年龄、不同饲养环境下成瘾行为的差异，探索成瘾易感性机制。

2 SA

SA行为试验分为操作性SA和非操作性SA 2种。其中操作性SA基于操作性条件反射，大鼠或小鼠通过摁压杠杆或鼻触器可以获得药物或刺激，如自然奖赏(食物、水、性)、成瘾物质、直接颅内电刺激或基于光遗传技术激活奖赏环路等正性强化刺激^[33]。在非操作性SA中，试验动物不需要通过压杆或鼻触等行为方式获得刺激，而是直接通过口服获得，特指乙醇口服SA，模拟人类饮酒行为。

2.1 操作性SA

在操作性SA行为试验中，中性条件线索(如声音或灯光)与正性强化刺激同时出现，动物通过反复联合训练建立操作性行为(按压杆或鼻触)与中性线索及正性强化刺激带来的奖赏作用之间的联系，这一过程也被认为是联合型学习记忆的形成阶段^[34]。训练时根据操作性行为发生数量或时间与获得药物之间的关联强化程序不同，分为固定比率程序(fixed ratio schedule，FR)和累进比率程序(progressive ratio schedule，PR)等。

判断动物是否成功建立SA行为有如下评价指标：1)测试时存在持续性的觅药行为。即使在药物不可获得的情况下，存在成瘾行为的动物仍会持续尝试获得药物。2)训练期获取药物的动机高。使用PR任务可以衡量动物获取药物的动机。为获得药物愿意付出的操作性行为越多，即断点越高，获取药物的动机越强。3)面对有害后果仍持续使用药物。即使在用药时伴随有害后果(如电击足底)，仍会持续获取药物，这反映了成瘾行为的强迫性质^[35-36]。

成功建立稳定的SA行为后，即可进入消退训练阶段，即反复训练操作性行为使其无法获得药物，形成新的消退记忆，直至操作频率降至基线水平，视为消退成功。以往研究^[37]多聚焦于强制性戒断，但临床实践中，人类成瘾者常因药物使用的负面后果(如法律风险、社会关系破裂、经济困境等)或非药物奖励(如美食、情感关系等)而主动选择戒断。因此，近年来研究^[38]开始关注自愿戒断模型，包括由美味食物、社交互动、惩罚或足底电击等条件诱发的戒断行为。当提供可口食物作为替代奖赏时，大鼠会主动选择食物并自愿维持戒断状态；而一旦移除该奖励，其复吸行为便会迅速重现^[39]。值得注意的是，经历社交互动诱发自愿戒断的大鼠，其后续药物寻求行为显著低于强制戒断组^[40]，提示社会奖赏可能具有长期保护效应。相比之下，即使引入足底电击作为惩罚手段，仍有一定比例的大鼠出现强迫性药物寻求行为^[41]，凸显成瘾行为的顽固性。重新暴露于低剂量药物、与药物相关联的线索或应激刺激等条件均可以使SA恢复^[42]。研究^[43]发现，间歇性海洛因-SA可增加复吸时的药物摄入量，表现为暴发性摄入量增加。药物总摄入量可预测药物依赖性严重程度，而给药频率则可预测药物复吸易感性^[44]。在成瘾阶段建模方面，研究^[45]根据训练时间的长短区分成瘾药物使用的初级阶段和强迫性用药阶段。使用二级强化程序和觅药-取药链范式模拟强迫性觅药和用药行为。此外，通过同轭对照比较主动觅药和被动给药，可分别考察药物渴求和药物奖赏效应^[46]。

SA是动物通过操作性行为主动获得药物，在多方面模拟了人类成瘾的觅药和用药行为，其表面效度、结构效度极佳^[47]。SA可以评估成瘾特征、预测成瘾阈值、筛选抗成瘾药物等，具有良好的预测效度。然而，静脉SA依赖导管植入与程序化输注技术，操作难度系数高且易引发术后感染/血栓，存在动物存活率低、数据稳定性差、成功率低的缺点^[48]。SA需要反复自我获取药物以建立可靠的成瘾行为，这种反复暴露方案可能会影响与耐受性和/或致敏性相关的受体转导机制。尽管存在这些挑战，静脉SA模型因其高度模拟人类成瘾行为，仍然是研究药物成瘾的神经机制、评估潜在的成瘾治疗药物及探索成瘾行为的心理和行为特征的重要工具。

2.2 非操作性SA

非操作性SA常用的乙醇SA模型包括双瓶自由饮(two-bottle choice，TBC)、液体含乙醇饮食等。其中TBC是最大程度模拟人类自主寻求乙醇的模型^[49]。该试验中动物可以选择饮酒与否、饮酒量和时间，经过反复训练，可形成类似于人类过度饮酒的行为。试验中乙醇浓度是影响其摄入量最重要的因素，大、小鼠口服乙醇最适浓度范围为10%~12%，若浓度太低(<4%)，脑内的乙醇浓度过低^[50]；若浓度太高，则因口感不好难以启动饮酒行为。可以通过逐渐增加乙醇浓度、使用乙醇/蔗糖梯度、限制水的饮用或强迫暴露于乙醇环境等方法建立乙醇SA行为。

乙醇SA评价指标包括摄入的纯乙醇量、相对偏好程度及总液体摄入量。偏好程度=乙醇溶液摄入量/总液体摄入量，比值越大，表明动物对乙醇依赖程度越大^[51]。

TBC方法包括持续性和间断性2种方式，间歇性TBC(intermittent access to ethanol in two-bottle choice，IATBC)是由饮酒和戒酒的反复循环组成。IATBC乙醇摄入量明显高于持续性TBC，故在乙醇使用障碍研究中应用更为广泛^[52]。在IATBC模型中，大鼠血液乙醇浓度(blood alcohol concentration，BAC)通常在饮酒后40~60 min达到峰值(20~30 mg%，即0.02%~0.03%)。为进一步提升饮酒量，Two-Shot模型先让大鼠在IATBC下饮酒3个月，然后改为每周2次、每次包括2个5 min饮酒时段(间隔10 min休息)的方案，可使BAC提升至≥80 mg%(即0.08%)，达到人类重度饮酒水平^[53]。然而，该方法耗时长；近期研究^[54]提示，大鼠高糖饮食后立即进行TBC训练可在短期内快速增加TBC模型的乙醇摄入量。

2.3 结合光遗传学或化学遗传学技术的SA

化学遗传学是通过改变生物大分子的配体结合特性，使其只响应特定的外源性配体，进而调控神经元活动。目前最常用的只由特定药物激活的受体(designer receptors exclusively activated by designer drug，DREADD)改变了G蛋白偶联受体——毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor，mAChR)的结构，使其只能被特定的化合物氯氮平N-氧化物(clozapine-N-oxide，CNO)激活或抑制，如兴奋性DREADD与CNO结合激活神经元；抑制性DREADD与CNO结合抑制神经元^[55]。这种基于特异性配体-受体相互作用的调控方式，为在体研究成瘾等行为的神经环路机制提供了强大工具。

光遗传学是一种整合光学与遗传学的神经调控技术。其原理是通过病毒转导等手段，将编码光敏感蛋白的外源基因，如兴奋型通道视紫红质(channelrhodopsin-2，ChR2)、抑制型盐系视紫红质(halorhodopsin，NpHR)及古菌视紫红质(archaerhodopsin，Arch)等，导入靶细胞，使其在细胞膜上功能性表达。借助特定波长的光照，可精准调控这些光敏感通道的活性状态，进而改变细胞膜电压，实现对神经元的快速兴奋或抑制^[56]。该技术能够在细胞类型特异性水平上解析神经环路功能，并为成瘾等神经精神疾病的机制研究与潜在治疗策略开发提供强有力的技术工具^[57]。

建立脑功能与行为之间的因果关系是成瘾相关神经科学研究的核心目标之一。通过光化学遗传学，Wang等^[30]揭示了大脑前边缘皮层-VTA调控小鼠早期社交隔离应激增强的海洛因觅药行为的机制。Cheng等^[58]明确了丘脑室旁核催产素-伏隔核核心部(NAc core)在调控甲基苯丙胺奖赏行为中的作用。但2种技术各有优劣：化学遗传学操作简单，组织损伤程度小。但其时空特异性较差，可产生DREADDs脱敏、CNO不良反应等^[59]。光遗传学实现了对目标神经元精确的时空控制，可随时精准地调节目标神经元的刺激强度^[60]。光遗传学不仅可以用来观察神经环路的直接联系，还能够揭示下游神经元是否与被刺激的上游神经元存在功能上的联系，进而描绘出整个神经环路的功能架构^[56]。光遗传学虽然在成瘾相关研究中具有巨大潜力，但也面临多方面的挑战和限制。与啮齿类动物相比，光遗传调控所诱发的行为反应在非人灵长类动物中的一致性较差或效应较弱。此外，该技术存在显著局限性：首先，光传输依赖光纤植入深部脑区，可能造成组织机械损伤；其次，异源光敏蛋白的长期表达可能诱发免疫排斥反应或神经炎症；最后，灵长类动物较大的脑体积与皮层厚度进一步增加了光散射与光毒性风险^[61]。

3 CPP和条件性位置厌恶

CPP和条件性位置厌恶(conditioned place aversion，CPA)基于巴甫洛夫经典的条件反射原理，将特定环境刺激(如触觉、嗅觉和视觉刺激等)与具有奖赏或者厌恶作用的精神活性物质关联，形成正性或负性的联想记忆，行为学上表现为对特定环境的偏好或回避^[62]。该范式的形成、表达与再巩固3个阶段，分别对应于成瘾记忆的编码形成、提取(回忆)与再巩固过程，因而被广泛应用于成瘾记忆机制的研究。

在CPP建模中，首先进行基线测试以评估动物的先天侧向偏好。若动物两侧停留时间均衡(近50%)，则采用无偏设计，任选一侧为药物配对箱，并通过平衡分组消除潜在基线偏差；若动物两侧停留时间存在显著侧偏(偏离50%)，则采用有偏设计，将非偏好侧指定为药物配对箱，以规避基线偏好对药物条件化效应的干扰。成功建立CPP后，经消退训练使药物配对箱的偏好时间恢复至基线水平。在消退完成后，与用药相关的线索、应激源或小剂量药物，均能诱发CPP复吸，即已消退的偏爱行为恢复。CPP复吸是研究成瘾记忆提取与再巩固机制的重要行为范式^[63]。借助CPP模型，研究揭示了不同成瘾物质依赖的神经环路存在差异：可卡因奖赏记忆与海马腹侧CA1区-伏隔核核心部印迹细胞环路密切相关^[64]；阿片类药物成瘾记忆的形成与维持受丘脑室旁核至杏仁核与NAc输出通路的协同调控^[65]；外周血皮质酮通过激活杏仁核投射至NAc core投射通路上的盐皮质激素受体，介导了吗啡戒断记忆的情境依赖性提取^[66]。

CPP/CPA作为评价药物奖赏/厌恶作用动物模型的优点是试验周期短、试验装置和方法简单易行。缺点是个体差异大、对样本量要求高，难以确定药物奖赏效应的剂量-反应关系。在缺乏标准化的实验条件下，个体差异和试验设计缺陷可能导致CPP假阳性升高和可重复性降低^[45]。

4 BS

长期、间断性使用精神活性物质，会导致量效曲线左移，对药物的反应随着反复多次给药而增强，即为药物敏化。药物敏化主要表现是行为学的改变，如对药物的强烈渴求和寻找行为等，即BS^[67]。对吗啡致敏的大鼠表现出对食物、性行为及社会行为的兴趣增加^[68]。这表明，长期、间断使用精神活性物质可非特异性激活脑内奖赏通路。

影响BS模型建立的主要因素是注射剂量和注射间隔时间。环境因素能够刺激已形成的BS环路，对BS的建立及表达强度产生影响，BS可分为环境依赖性与环境不依赖2种类型^[69]。对于小鼠或大鼠而言，多样化的环境(如隧道、跑轮或者各种景观)能够逆转或减轻获得性BS^[70]。Itzhak等^[71]观察到，长期预暴露于乙醇的动物表现出对可卡因敏感，且此效应具有双向性，提示药物间存在交叉致敏效应。产前暴露于某些药物(如吗啡、美沙酮及丁丙诺啡)的雌性大鼠，其后代更容易产生甲基苯丙胺-BS^[72]。与正常喂养的大鼠相比，慢性营养不良的大鼠使用低剂量吗啡就能发生BS，且使用低剂量的可卡因就能产生交叉致敏^[70]。这表明，BS的形成是一个复杂的过程，受遗传、环境和生活方式等多种因素的影响。

BS范式试验周期短、操作简单、结果容易观察和量化，试验数据的离散程度相对较小，结果的一致性和可重复性较高。BS对药物的反应敏感，低剂量的药物暴露可致啮齿动物显著的行为变化，有利于研究药物成瘾的早期阶段。但BS无法解释长时间使用药物导致滥用的现象。此外，BS缺乏表面效度，人类的致敏性难以证明^[73]。

5 结 语

药物成瘾不仅仅是一种脑部疾病，还是个体遗传易感性、环境因素及成瘾物质本身性质共同作用的结果。社会等级、家庭环境^[21]、同伴影响^[28]和社会文化背景等因素都会影响药物成瘾的发生发展，不同的个体对同一成瘾药物的易感性不同，不同的成瘾药物对药物暴露产生的神经适应模式不同，使得药物成瘾行为存在极大的个体差异。尽管现有动物模型尚无法完美模拟人类成瘾的全部临床异质性，但其在模拟核心成瘾行为表型(如药物渴求、强迫性用药及复吸行为)方面具有较高的表型效度。同时，与其他精神疾病的动物模型相比，药物成瘾的动物模型在构建核心症状维度上表现出更优的结构效度与预测效度。鉴于药物成瘾机制(包括成瘾的起始、发展、维持、戒断和复发等不同阶段)的复杂性，整合多模态动物模型仍是解析其神经机制与开发干预策略不可替代的研究范式。

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基金资助

国家自然科学基金(82271535)

湖南省湖湘英才“荷尖人才”计划(2022RC1008)

湖南省自然科学基金(2021JJ40894┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation ┣82271535)

the Science and Technology Innovation of Hunan Province(2022RC1008)

the Natural Science Foundation of Hunan Province(2021JJ40894)

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