FTO通过调控pri-miR-139的m⁶A修饰抑制乳头状甲状腺癌转移

FTO-regulated m⁶A modification of pri-miR-139 represses papillary thyroid carcinoma metastasis

摘要

目的 低风险微小乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)的检出增加与过度诊断和治疗有关。N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine，m⁶A)修饰导致的微RNA(microRNAs，miRNA)失调在肿瘤转移和进展中发挥重要作用。然而，m⁶A靶向miRNAs在PTC中的功能仍不清楚。本研究旨在探究m⁶A-miR-139-5p在PTC中的表达调控机制，明确其与PTC转移的关联，并评估其作为PTC转移诊断生物标志物的潜力，为PTC的精准诊断和治疗提供实验依据。 方法 通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和GSE130512队列筛选与PTC转移相关的候选靶向m⁶A-miRNA分子。收集13例PTC转移患者和18例非转移患者的临床标本，检测m⁶A-miR-139-5p的表达水平，分析其与转移的相关性。通过实验探究脂肪质量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)对pri-miR-139甲基化水平及加工过程的影响，明确其对miR-139-5p表达的调控作用。在TPC-1细胞中，通过四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验检测miR-139-5p过表达对FTO过表达介导的细胞增殖的影响。通过细胞侵袭实验验证miR-139-5p对PTC细胞侵袭能力的作用，并探究其是否通过靶向ZEB1/E-钙黏蛋白轴发挥功能。 结果 通过比较TCGA和GSE130512队列，发现血清循环m⁶A-miR-139-5p可作为检测PTC转移的生物指标。对13例转移和18例非转移临床标本的检测表明，FTO通过降低其甲基化水平抑制pri-miR-139的加工，导致miR-139-5p在PTC中表达失调(P<0.05)。在TPC-1细胞中，MTT实验显示miR-139-5p过表达可部分逆转FTO过表达介导的细胞增殖(P<0.05)。此外，miR-139-5p通过靶向ZEB1/E-钙黏蛋白轴抑制PTC细胞的侵袭能力，而FTO过表达可部分削弱这种抑制效应。 结论 血清循环miR-139-5p可作为评估PTC转移的潜在标志物，FTO通过调控pri-miR-139的m⁶A修饰影响miR-139-5的表达及功能，但其临床价值需进一步验证。

Abstract

Objective Increasing detection of low-risk papillary thyroid carcinoma (PTC) is associated with overdiagnosis and overtreatment. N6-methyladenosine (m⁶A)-mediated microRNA (miRNA) dysregulation plays a critical role in tumor metastasis and progression. However, the functional role of m⁶A-miRNAs in PTC remains unclear. This study aims to elucidate the regulatory mechanism of m⁶A-miR-139-5p expression in PTC, determine its association with PTC metastasis, and evaluate its potential as a diagnostic biomarker for PTC metastasis, thereby providing experimental evidence for precision diagnosis and therapy. Methods Expression profiles of m⁶A-miRNAs were compared between the The Cancer Genome Atlas (TCGA) and GSE130512 cohorts to identify metastasis-associated candidates. Clinical specimens from 13 metastasis and 18 non-metastasis PTC patients were analyzed to assess m⁶A-miR-139-5p expression and its correlation with metastasis. Functional experiments were conducted to investigate the effect of fat mass and obesity-associated protein (FTO) on pri-miR-139 methylation and processing, clarifying its regulatory role in miR-139-5p expression. In TPC-1 cells, MTT assays were performed to evaluate whether miR-139-5p overexpression could counteract FTO-mediated cell proliferation. Transwell invasion assays were used to determine the impact of miR-139-5p on PTC cell invasion, exploring whether it functions through the ZEB1/E-cadherin axis. Results By comparing TCGA and GSE130512 cohorts, it was found that circulating m⁶A-miR-139-5p could serve as a biological indicator for detecting PTC metastasis. Detection of 13 metastatic and 18 non-metastatic clinical specimens showed that FTO inhibited the processing of pri-miR-139 by reducing its methylation level, leading to the dysregulation of miR-139-5p in PTC (P<0.05). In TPC-1 cells, MTT assay showed that overexpression of miR-139-5p could partially reverse FTO overexpression-mediated cell proliferation (P<0.05). In addition, miR-139-5p inhibited the invasive ability of PTC cells by targeting the ZEB1/E-cadherin axis, while FTO overexpression could partially weaken this inhibitory effect. Conclusion Circulating miR-139-5p can be a potential marker for evaluating PTC metastasis. FTO affects the expression and function of miR-139-5p by regulating m⁶A modification of pri-miR-139, but its clinical value needs further verification.

Graphical abstract

关键词

乳头状甲状腺癌 / N⁶-甲基腺苷修饰 / m⁶A靶向微RNA / 脂肪质量和肥胖相关蛋白 / 生物信息学分析 / 血清循环微RNA

Key words

papillary thyroid carcinoma / N⁶-methyladenosine modification / m⁶A target microRNAs / fat mass and obesity-associated protein / bioinformatics analysis / serum circulating microRNAs

甲状腺癌作为内分泌系统中最为常见的恶性肿瘤之一，近年来在全球范围内的发病率呈现出显著的上升趋势，最常见的甲状腺癌类型是乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，占甲状腺癌的85%~90%^[1-3]。关于甲状腺结节的诊断和治疗方法一直存在争议。在过去20年中，低风险微小PTC检出的增加常常与过度诊断和治疗有关^[4]。常见的检测方法如细针穿刺活检，虽然特异性较高，但灵敏度欠佳。实际上，10%~40%的结节是不确定的病变，因此可能导致良性病变患者接受不必要的甲状腺切除手术治疗^[5]。BRAF(V600E)突变是诊断PTC最常用的标志物之一，可将PTC的诊断准确率提高20%~30%，然而仍会产生PTC的怀疑性诊断，缺少特异性。因此，具有高特异性的诊断标志物有助于诊断不确定性质的甲状腺结节，从而避免因过度诊断给患者带来的焦虑^[6]。

N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine，m⁶A)作为真核生物mRNA最丰富的转录后修饰，其动态调控过程涉及“写入”(writer)、“擦除”(eraser)和“读取”(reader)3类蛋白质^[7]。甲基转移酶复合物(METTL3/METTL14/WTAP)负责催化m⁶A形成，而去甲基化酶[脂肪质量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)/α-酮戊二酸依赖的加双氧酶AlkB 同源蛋白5(alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase AlkB homolog 5，ALKBH5)]则可逆地去除甲基化修饰^[8]。m⁶A修饰通过调控RNA代谢的各个环节(剪接、出核、翻译和降解)参与多种生理病理过程^[9]，m⁶A引起的miRNA失调在肿瘤转移和进展中起重要作用。研究^[10]表明m⁶A调节因子与PTC的预后有关。对于胃癌，m⁶A的诊断价值显著高于癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)^[11]。在乳腺癌中，m⁶A修饰与肿瘤分期相关，其诊断效率高于CEA和糖类抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)^[12]。而在食管鳞状细胞癌中，METTL14通过促进pri-miR-99a加工增加miR-99a-5p的表达，从而提高癌症干细胞的持久性和抗辐射性^[13]。METTL14还可以通过调节m⁶A介导的初级miRNA加工来抑制肝细胞癌细胞的转移能力^[14]。m⁶A可诱导miRNA失调，从而调节肿瘤的转移和进展，m⁶A靶向miRNA(m⁶A-miRNA)可作为检测肺癌、胃癌和肝细胞癌的生物指标^[15]。然而，m⁶A甲基化相关miRNA在PTC发生和进展中的作用尚未完全阐明。

FTO作为第1个被发现的m⁶A去甲基化酶，其生物学功能研究经历了从代谢疾病到肿瘤的转变^[16]。结构生物学研究^[17]揭示FTO通过其双链β-螺旋结构域特异性识别m⁶A修饰，并利用Fe²⁺和α-酮戊二酸作为辅因子催化去甲基化反应。在肿瘤中，FTO的表达和功能呈现出显著的组织特异性，在血液系统肿瘤如急性髓系白血病和神经胶质瘤中高表达并发挥促癌作用；而在实体瘤如乳腺癌中常表现为抑癌效应。

MiR-139-5p被广泛认为是一种重要的抑癌miRNA，其在肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达下调^[18]。从机制上看，miR-139-5p通过靶向调控上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)转录因子——蜗牛家族转录抑制因子2(snail family transcriptional repressor 2，SLUG)、锌指E盒结合同源框1(zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)、细胞周期调控蛋白(cyclin D1，CCND1)和侵袭相关酶[基质金属蛋白9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)]形成多维度的转移抑制网络；pri-miR-139的加工成熟过程受到精细调控。生物信息学分析显示pri-miR-139茎环区存在保守的m⁶A修饰位点(RRACH序列)，且该位点与Drosha切割位点重叠；体外实验证实，METTL3过表达可促进pri-miR-139加工为成熟miR-139-5p，而ALKBH5则表现出抑制作用^[19]。然而，FTO是否参与调控pri-miR-139的m⁶A修饰，以及这种调控是否影响PTC转移，目前尚未见报道。

本研究旨在探究m⁶A-miR-139-5p在PTC中的表达调控机制，明确其与PTC转移的关联，并评估其作为PTC转移诊断生物标志物的潜力，为PTC的精准诊断和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得湘雅三医院伦理委员会的批准(审批号：2021-S222)。所有参与者或其家属均签署书面知情同意书。

1.2 数据来源

从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库中获取PTC患者的miRNA和转录组数据。此外，从TCGA数据库中导入492名PTC患者和58例甲状腺组织正常者的完整临床信息及miRNA-seq(Seq-count数据)、RNA-seq(Seq-FPKM数据)。从基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库中的GSE130512数据集导入PTC患者的微阵列转移(n=8)和非转移(n=8)数据。通过R软件(版本3.6.0)包edgeR版本4.2.1(R-project.org/)确定差异表达的miRNA，筛选标准为|log₂差异倍数(fold change，FC)|>0.40，即倍数变化>1.3，且伪发现率(false discovery rate，FDR)<0.05。

1.3 富集功能分析

使用R包“clusterProfiler”进行基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析。

1.4 <bold>CeRNA</bold>网络构建

在CeRNA网络构建中，采用miRDB、目标扫描(TargetScan)和miRTarBase 3个数据库预测特定miRNA的靶基因(mRNA)。随后，通过Cytoscape 3.0将筛选得到的miRNA及其对应的靶基因mRNA进行关联，构建miRNA-mRNA网络。

1.5 患者资料

本研究纳入2021年12月至2022年3月在中南大学湘雅三医院住院的31名PTC患者，其中包括18例经术后病理确诊的PTC无颈部淋巴结转移患者(非转移组)，13例PTC合并颈部淋巴结转移患者(转移组)。排除标准：合并其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病、甲状腺炎患者，以及近期接受过甲状腺相关治疗的患者。患者的临床信息和特征见附表1(https://doi. org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00125)。

1.6 实时荧光定量<bold>PCR</bold>

收集31名PTC患者的血清和组织样本。使用TRIzol试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)提取全RNA，并采用RT试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)将其反转录为cDNA。分别选用反转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行miRNA和mRNA反转录。在实时荧光qPCR系统(美国ABI 7500)上进行定量反转录PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR)检测，使用Tli RNaseH Plus试剂盒(日本京都TaKaRa公司)作为反应试剂。反应过程严格控制温度、时间及循环次数等参数。采用2^-ΔΔCt法评估基因的相对表达水平。引物序列详见附表2(https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00125)。

1.7 <bold>m⁶A</bold>免疫共沉淀

使用高纯miRNA分离试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)从细胞或组织样品中提取高纯度miRNA。按照EZMagna RIP试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)说明进行小RNA片段免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)。具体操作如下，将miRNA(50 ng)在4 ℃下与5 µg的亲和纯化抗m⁶A多克隆抗体或阴性对照IgG(美国Sigma-Aldrich公司)在IP缓冲液中充分混合，在4 ℃孵育过夜。次日，使用TRIzol LS试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)获取IP的RNA，并通过RT-PCR进行扩增，以便后续对m⁶A修饰的miRNA进行定量分析。

1.8 免疫组织化学

利用人类蛋白质图谱数据库验证FTO的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)表达水平。将 6 µm的组织切片在室温下用4%甲醛固定15 min以确保组织形态和抗原性稳定，然后用含有0.3% Triton X-100的PBS冲洗2次，每次5 min，增加通透性，促进抗体渗透，去除切片表面杂质和未结合固定剂。清洗后用10%正常山羊血清在室温下封闭1 h，封闭后将切片与FTO一抗(美国Abcam公司)在4 ℃下孵育过夜。次日，加入0.3% H₂O₂反应15 min，消除内源性过氧化物酶活性。充分洗涤后，切片在室温下用生物素标记的二抗孵育1 h。再次洗涤后，用链霉亲和素偶联的HRP在室温下处理1 h，用PBS冲洗3次，每次5 min，然后在室温下用3,3’-二氨基联苯胺反应10 min，使阳性信号显色，结束反应后用水冲洗 5 min。经苏木精复染后，将切片脱水、透明化并封片。使用徕卡正置显微镜分析组织的IHC结果，通过图像分析软件对阳性染色强度和范围进行量化评估。

1.9 细胞培养

通过构建FTO过表达和敲低的TPC-1细胞模型，深入研究FTO对miR-139-5p成熟过程的调控作用。选用人乳头瘤状甲状腺癌细胞TPC-1为研究对象，在37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。培养时，使用含1%抗生素和10%胎牛血清(均购自美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM培养基，为细胞提供适宜生长环境，确保正常生长和增殖。定期观察细胞生长状态，细胞到达对数生长期后可进行后续实验操作。

1.10 荧光素酶报告物测定

细胞达到85%融合后，采用Lipofectamine 2000转染试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)，严格按照说明书操作流程，将shFTO质粒(靶向敲低FTO)与突变型和野生型pri-miR-139报告载体共转染至TPC-1细胞。在37 ℃、5% CO₂条件下培养48 h后，收集细胞进行荧光素酶活性检测。每孔加入100 μL 1×Passive Lysis Buffer(PLB；美国Promega公司)，将培养板置于室温摇床孵育15 min以确保细胞完全裂解。通过双荧光素酶报告分析系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定每个孔的荧光强度。通过比较不同转染组荧光强度差异，判断FTO对pri-miR-139转录活性的影响。

1.11 细胞活性检测

采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验检测细胞活性。将处于对数生长期的细胞用完全培养基调整密度至1×10⁴个/mL，以每孔200 µL的体积接种于96孔细胞培养板。将培养板置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中预培养24 h，待细胞完全贴壁后，用不同浓度的黄芩素对细胞进行处理，处理时间分别为24、48、72、96和110 h。在预定时间点，每孔加入100 µL新鲜配制的MTT溶液(1 mg/mL，美国Sigma-Aldrich公司)，将培养板放回培养箱继续孵育4 h，期间避免光照。孵育结束后，每孔加入150 µL DMSO溶解形成的紫色结晶，将培养板置于微量振荡器上低速振荡10 min以确保充分溶解。在490 nm波长处测定吸光度值，通过吸光度值变化反映细胞活性的改变。

1.12 划痕试验

取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，以完全培养基重悬并调整细胞密度至5×10⁵个/mL。在6孔细胞培养板中每孔接种2 mL细胞悬液(即1×10⁶个/孔)，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。当单层细胞形成后，用消毒过的200 µL移液枪头在细胞层上划十字形划痕，并用PBS冲洗2次，去除脱落细胞。然后，向每个孔中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。在划痕后0和24 h，通过显微镜测量由划痕产生的间隙宽度，以此评估细胞迁移能力。

1.13 蛋白质印迹法

使用RIPA缓冲液(200 µL)在冰上裂解细胞 30 min，以提取细胞中的总蛋白质，裂解完成后，使用高速离心机在4 ℃下离心10 min，收集上清液中的蛋白质。通过10% SDS-PAGE(美国Thermo Fisher Scientific公司)分离变性蛋白质，并将其转移到PVDF膜(美国Thermo Fisher Scientific公司)上，然后在室温下用5%脱脂乳封闭2 h，在4 ℃下用一抗处理过夜，使一抗与目的蛋白特异性结合。次日，用TBST冲洗，在室温下用二抗孵育1~2 h，再次用TBST清洗。使用BS ECL Plus试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)观察蛋白质条带显色，通过凝胶成像系统观察记录蛋白质条带位置和强度。

1.14 细胞侵袭试验

在细胞培养前，先用Matrigel基质胶包被Transwell小室的膜，模拟细胞外基质。将细胞接种于上室后，取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶- EDTA消化后，以无血清DMEM培养基(Gibco)重悬，调整细胞密度至1×10⁵个/mL。将1个8 μm孔径的Transwell小室插入到24孔板中。将细胞(1×10⁵个/孔)培养在上室含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基中。在下室部分，加入600 µL含10% FBS的DMEM培养基。24 h后，用棉签轻轻擦去未迁移至膜下表面的细胞。然后，用1꞉1的甲醇꞉丙酮固定液在室温下固定细胞30 min，用结晶紫在室温下染色15~20 min，最后在倒置显微镜下观察并计数穿过基质胶和膜的细胞数量，以评估细胞侵袭能力。

1.15 统计学处理

使用SPSS 16.0进行统计分析，使用GraphPad Prism 7.0创建统计图。实验重复≥3次。计量资料以均数±标准差表示。2组间比较采用非配对或配对双尾Student t检验；多组间比较使用Tukey事后检验的单因素方差分析。相关分析采用Spearman相关系数分析进行评估。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 通过生物信息学分析研究<bold>m⁶A-miRNA</bold>在<bold>PTC</bold>中的生物学行为

通过整合转录组测序和miRNA表达谱数据，构建了30个m⁶A调节因子和797个miRNA之间的共表达关系(附表3，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00125)。采用Pearson相关性分析筛选出128个与19个m⁶A调节因子显著相关的miRNA(图1A)，这些miRNA可能受到m⁶A修饰的调控。

进一步比较PTC组织和正常组织中的128个候选m⁶A-miRNA，其中47个在PTC中显著上调(如miR-146b-5p、miR-221-3p等)，36个miRNA下调(如miR-139-5p、miR-451a等；图1B)。这些差异表达的m⁶A-miRNA可能参与了PTC的发生、发展过程。

GO分析结果(图1C)显示这些miRNA的靶基因显著富集于3个重要方面：在生物学过程中主要参与“细胞-基质黏附”(P=3.2×10^-6)；在细胞组分中富集于“基底膜”(P=1.8×10^-5)；在分子功能方面则主要涉及“生长因子结合”(P=4.5×10^-4)。

KEGG结果(图1D)显示这些m⁶A-miRNA主要调控3个关键通路：ECM-受体相互作用通路(P=7.3×10^-5)、PI3K-Akt信号通路(P=9.1×10^-4)及p53信号通路(P=0.002 3)。

2.2 <bold>MiR-139-5p</bold>可作为<bold>PTC</bold>进展中的候选<bold>m⁶A-miRNA</bold>标志物

通过对GSE130512队列中非转移(n=8)与转移(n=8)PTC患者血清样本的miRNA测序数据分析，鉴定出19个差异表达的血清循环miRNA，其中5个上调，14个下调(图2A)。通过整合m⁶A-miRNA预测数据库和实验验证数据，发现仅有miR-139-5p和hsa-miR-142-3p同时满足差异表达和m⁶A修饰2个条件(图2B)。

本研究选择miR-139-5p作为重点研究对象。TCGA数据分析显示miR-139-5p的表达水平与PTC的多个临床病理特征显著相关，与T分期(P<0.001)、N分期(P<0.001)、M分期(P=0.034)以及TNM分期 (P=0.007)均呈现负相关性(图2C)。这一结果提示miR-139-5p可能作为PTC进展的负向调控因子。

GO功能富集分析结果显示miR-139-5p的靶基因显著富集于3个关键信号通路：“小GTP酶介导信号转导负调控”(P=3.2×10^-5)、“Rho蛋白信号转导负调控”(P=1.8×10^-4)和“Ras蛋白信号转导负调控”(P=4.5×10^-4，图2D)。

2.3 <bold>PTC</bold>组织中<bold>pri-miR-139</bold>甲基化的验证

对18例非转移和13例转移PTC患者的组织和血清进行qRT-PCR检测，结果显示在转移组中，miR-139-5p在肿瘤组织和血清样本中的表达水平均显著降低(均P<0.05，图3A、3B)，这一发现与GSE130512队列的生物信息学分析结果高度一致(r=0.82，P<0.001)，验证了前期结果的可靠性。

生物信息学结果显示1个高度保守的m⁶A修饰基序(GGACU)位于pri-miR-139的5'端剪接位点区域(位置：chr11:72 188 543~72 188 547；图3C)。通过m⁶A-RNA免疫共沉淀结合qRT-PCR验证，发现pri-miR-139在抗m⁶A抗体组中的富集程度显著高于IgG(P<0.001，图3D)，确证了pri-miR-139存在m⁶A甲基化修饰。

与非转移组相比，转移组PTC中pri-miR-139的m⁶A甲基化水平显著降低(P<0.001，图3D)。同时，未加工的pri-mir-139在非转移PTC中累积(P<0.05，图3E)。这些结果表明pri-miR-139的去甲基化状态可能通过影响Drosha/DGCR8复合体对其的识别和加工效率，导致pre-miR-139剪切受阻和成熟miR-139-5p生成减少。

2.4 <bold>FTO</bold>介导的<bold>miR-139-5p</bold>在<bold>PTC</bold>中以<bold>m⁶A</bold>依赖的方式成熟

对5种关键的m⁶A甲基化调节因子(METTL3、METTL14、FTO、YTHDC1和YTHDC2)在非转移和转移PTC组织中的表达谱进行全面分析。qRT-PCR结果显示，在转移性PTC组织中，FTO的mRNA表达水平较非转移组织显著升高(P<0.01，图4A)，而其他4种调节因子表达水平的差异无统计学意义(均P>0.05)。IHC实验结果显示转移组标本中甲状腺细胞呈现明显的黄褐色染色(H-score评分：转移组185±12 vs 非转移组82±8，P<0.001)，表明FTO蛋白水平在转移性PTC中特异性上调。

Spearman相关性分析结果显示：组织中FTO的表达水平与血清(r=-0.452，P=0.006)和组织(r=-0.524，P=0.001)中miR-139-5p的表达均呈显著负相关(图4B)。这一结果提示FTO可能通过表观遗传调控机制负向调节miR-139-5p的表达水平。

qRT-PCR结果显示：FTO过表达导致pri-miR-139显著增加，同时pre-miR-139和成熟miR-139-5p水平显著降低；反之，FTO敲低则呈现完全相反的趋势(均P<0.05，图4C、4D)。提示FTO可能通过影响pri-miR-139的加工过程来调控成熟miR-139-5p的产生。

m⁶A-RNA免疫沉淀结合qRT-PCR分析发现：FTO过表达可显著降低pri-miR-139的m⁶A修饰水平，而FTO敲低则使其m⁶A水平显著升高(均P<0.05，图4E)。双荧光素酶报告基因实验显示：在FTO敲低的TPC-1细胞中，含有野生型m⁶A修饰位点的pri-miR-139报告基因活性显著增强(P<0.05)，而突变型报告基因则无显著变化(P>0.05，图4F)。

2.5 <bold>miR-139-5p/ZEB1</bold>轴通过<bold>FTO</bold>修饰抑制<bold>PTC</bold>体外转移

通过转染miR-139-5p模拟物和抑制剂，蛋白质印迹法和qRT-PCR分析显示ZEB1的表达水平分别显著下调和上调(均P<0.05；附图1A、1D，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00126)。进一步的细胞功能实验证实，miR-139-5p过表达可显著抑制TPC-1细胞的迁移和侵袭能力(均P<0.05；附图1B、1C，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00126)，而抑制miR-139-5p则产生相反效应(均P<0.05；附图1E、1F，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00126)，这些结果初步证实了miR-139-5p/ZEB1轴在PTC转移中的抑制作用。

单独过表达FTO可使ZEB1表达增加，而过表达miR-139-5p则使其降低。共转染FTO和miR-139-5p过表达载体可部分逆转这种调控效应(附图1G， https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00126)，表明FTO通过抑制miR-139-5p来解除对ZEB1的靶向抑制作用。MTT实验进一步证实，miR-139-5p过表达可显著减弱FTO促进的细胞增殖效应(P<0.05；附图1H，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00126)，提示FTO/miR-139-5p/ZEB1轴在调控PTC细胞恶性表型中起关键作用。

划痕试验和蛋白质印迹法显示miR-139-5p过表达可有效拮抗FTO诱导的细胞迁移能力增强和E-cadherin表达下调。免疫荧光染色证实FTO过表达导致上皮标志物E-cadherin表达降低而间质标志物Vimentin表达升高，这种EMT表型可被miR-139-5p过表达部分逆转。此外，双荧光素酶报告基因实验验证了miR-139-5p可直接靶向ZEB1 3'UTR区，而FTO通过降低pri-miR-139的m6A修饰水平抑制miR-139-5p成熟，从而解除对ZEB1的转录后调控。

3 讨 论

m⁶A-miRNA甲基化修饰是一个新兴的研究领域，m⁶A甲基化修饰可以调节miRNA的功能，影响癌症的发生和发展。m⁶A-miRNA对癌症检测具有准确的诊断能力^[11]。本研究探讨了m⁶A-miRNA作为PTC检测中的潜在标志物的贡献。

血清中循环的miRNA因其高稳定性、受长期室温储存和冻融影响较小，有望成为一种新型的临床诊断生物标志物。血清m⁶A-miRNAs信号在癌症检测中显示出较高的准确性^[15]。通过比较TCGA和GSE130512队列，本研究推测循环中的miR-139-5p可以用作检测PTC转移的生物标志物。在TCGA队列中，miR-139-5p的表达与TNM分期、T分级、M分级和N分级显著相关。GO分析表明，miR-139-5p靶向mRNA主要集中在Ras蛋白信号转导的负向调控、Rho蛋白信号转导的负向调控和小GTP酶介导的信号转导负调节等。Wang等^[10]研究表明miR-139-5p通过靶向GABRA1抑制胶质瘤的进展。circBACH2可以直接结合miR-139-5p，从而促进PTC细胞的增殖、迁移和侵袭^[20]。这些数据均证实了miR-139-5p可以抑制肿瘤侵袭。

临床上，甲状腺的诊断主要依靠病理检查，并辅以超声检查，但病理检查耗时、经济效益低，且超声难以诊断甲状腺的侵袭。本研究旨在探讨检测循环miR-139-5p的表达水平是否可作为判断PTC转移的一种无创、经济的辅助诊断手段。因此，本研究检测了PTC患者miR-139-5p的表达。本研究结果显示：在血清和组织样本中，非转移组患者的miR-139-5p表达明显高于转移组PTC患者。m⁶A引起的miRNA稳定性、翻译、剪接和输出失调在肿瘤转移和进展中起重要作用。本研究证明了非转移性PTC患者pri-miR-139的甲基化显著增加，并与m⁶A调节因子FTO的表达呈负相关。FTO属于AlkB家族，是首个被鉴定的哺乳动物RNA-m⁶A去甲基化酶^[21]。证据^[22]表明FTO介导的mRNA-m⁶A去甲基化与人类癌症的病理过程相关。在膀胱癌中，FTO的表达与miR-576呈负相关。

本研究证实FTO负向调节miR-139-5p的表达，并正向调节pri-miR-139。由于pri-miR-139包含高度保守的“RRACH”基序，FTO可以通过在PTC细胞中对pri-miR-139进行m⁶A修饰来促进miR-139-5p的成熟。分子实验发现miR-139-5p通过靶向ZEB1抑制PTC细胞的侵袭能力，而这种效应部分被过表达的FTO削弱。因此，笔者推测FTO通过m⁶A修饰下调的miR-139-5p在PTC转移中发挥保护作用。值得注意的是，本研究首次在PTC中系统鉴定了可能受m⁶A修饰调控的miRNA及其相关信号通路。特别是发现多个已知的癌症相关miRNA(如miR-146b、miR-221等)可能受到m⁶A修饰的调控，这为理解PTC的表观遗传调控机制提供了新的视角。这些发现不仅丰富了对PTC分子机制的认识，也为开发基于m⁶A-miRNA调控网络的诊断标志物和治疗靶点提供了重要线索。GO功能富集分析结果显示miR-139-5p的靶基因显著富集于3个关键信号通路，这些通路在肿瘤细胞迁移、侵袭和转移过程中发挥核心作用。特别是Ras和Rho家族蛋白作为分子开关，通过调控细胞骨架重组和运动能力影响肿瘤转移。本研究为PTC的早期诊断和预后评估提供了新的分子靶点和理论依据。分子机制研究表明m⁶A修饰可能通过改变pri-miR-139的二级结构或提供蛋白质结合位点，调控其加工过程。

综上，本研究构建了1个高准确度的诊断标志物m⁶A-miRNA，并验证了m⁶A靶向miRNA在PTC检测中的预后价值。血清miR-139-5p在PTC淋巴结转移患者中表达显著下调，对PTC淋巴结转移具有较好的诊断效能，m⁶A靶向miRNA有望成为辅助判断PTC转移状态的无创性生物标志物。但仍需进一步扩大样本量和深入研究其作用机制，以明确其在PTC临床诊断和治疗中的应用价值。未来可进一步研究FTO与其他m⁶A修饰相关酶(如甲基转移酶METTL3、METTL14等)之间的相互作用，以及它们共同对pri-miR-139的m⁶A修饰和甲状腺癌生物学行为的影响；研究其他m⁶A结合蛋白(除YTHDF2外)在这一过程中的作用，全面揭示m⁶A修饰调控甲状腺癌早期转移的分子网络，为开发更有效的治疗靶点提供更深入的理论基础。

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