二甲双胍对高脂饮食大鼠肠道菌群及短链/中链脂肪酸的影响

Effects of metformin on gut microbiota and short-/medium-chain fatty acids in high-fat diet rats

摘要

目的 近年来有证据提示肠道可能是二甲双胍的主要作用部位，但二甲双胍对肠道菌群影响的相关研究尚不多，二甲双胍对短链/中链脂肪酸等肠道菌群代谢产物的影响也不明确。本研究拟探讨二甲双胍对高脂喂养大鼠肠道菌群及短链/中链脂肪酸的影响和代谢益处。 方法 将24只Sprague-Dawley大鼠随机分为3组：1)正常饮食组(ND组)，普通饲料喂养；2)高脂饮食组(HFD组)，高脂饲料喂养；3)高脂饮食+二甲双胍治疗组(HFD+Met组)，高脂饲料喂养8周，第9周起每日用二甲双胍溶液(150 mg/kg体重)灌胃。实验结束后处死所有大鼠并留取血清、肝脏及结肠内容物标本，检测糖脂代谢指标、肝脏病理、肠道菌群和结肠内容物中的短链/中链脂肪酸水平。 结果 二甲双胍显著改善了高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱及肝损伤。与HFD组比较，HFD+Met组Blautia，Romboutsia，Bilophila，Bacteroides菌属丰度降低，Lactobacillus菌属丰度显著增高(均P<0.05)；结肠内容物中丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、辛酸和月桂酸水平均显著增高(均P<0.05)，乙酸、异庚酸和壬酸水平均显著降低(均P<0.05)。Spearman相关性分析显示：Lactobacillus菌属丰度与大鼠的体重增量和胰岛素抵抗呈显著负相关，丁酸盐和戊酸盐水平与大鼠胰岛素抵抗、肝损伤呈显著负相关(均P<0.05)。 结论 二甲双胍显著增加了高脂饮食大鼠结肠内容物中Lactobacillus等益生菌的丰度，促进了丁酸盐、戊酸盐、月桂酸等短链/中链脂肪酸的产生，提示二甲双胍通过肠道菌群调节机体代谢。

Abstract

Objective Recent evidence suggests that the gut may be a primary site of metformin action. However, studies on the effects of metformin on gut microbiota remain limited, and its impact on gut microbial metabolites such as short-/medium-chain fatty acids is unclear. This study aims to investigate the effects of metformin on gut microbiota, short-/medium-chain fatty acids, and associated metabolic benefits in high-fat diet rats. Methods Twenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: 1) Normal diet group (ND group), fed standard chow; 2) high-fat diet group (HFD group), fed a high-fat diet; 3) high-fat diet + metformin treatment group (HFD+Met group), fed a high-fat diet for 8 weeks, followed by daily intragastric administration of metformin solution (150 mg/kg body weight) starting in week 9. At the end of the experiment, all rats were sacrificed, and serum, liver, and colonic contents were collected for assessment of glucose and lipid metabolism, liver pathology, gut microbiota composition, and the concentrations of short-/medium-chain fatty acids. Results Metformin significantly improved HFD-induced glucose and lipid metabolic disorders and liver injury. Compared with the HFD group, the HFD+Met group showed reduced abundance of Blautia, Romboutsia, Bilophila, and Bacteroides, while Lactobacillus abundance significantly increased (all P<0.05). Colonic contents of butyric acid, 2-methyl butyric acid, valeric acid, octanoic acid, and lauric acid were significantly elevated (all P<0.05), whereas acetic acid, isoheptanoic acid, and nonanoic acid levels were significantly decreased (all P<0.05). Spearman correlation analysis revealed that Lactobacillus abundance was negatively correlated with body weight gain and insulin resistance, while butyrate and valerate levels were negatively correlated with insulin resistance and liver injury (all P<0.05). Conclusion Metformin significantly increases the abundance of beneficial bacteria such as Lactobacillus and promotes the production of short-/medium-chain fatty acids including butyric, valeric, and lauric acid in the colonic contents of HFD rats, suggesting that metformin may regulate host metabolism through modulation of the gut microbiota.

Graphical abstract

关键词

二甲双胍 / 肠道菌群 / 短链脂肪酸 / 中链脂肪酸 / 代谢

Key words

metformin / gut microbiota / short chain fatty acids / medium chain fatty acids / metabolism

二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物。除了降低血糖，近来的研究^[1]还发现二甲双胍可以改善机体代谢和衰老。Zhou等^[2]和Shaw等^[3]曾发现二甲双胍通过激活5’-磷酸腺苷酸依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)发挥生理作用。但二甲双胍也存在不依赖于AMPK的作用^[4-5]。

Jensen等^[6]发现：在静脉注射¹¹C标记的二甲双胍后，动态正电子发射断层扫描显示二甲双胍在肝脏和远端小肠中蓄积。临床试验^[7]显示肠道是二甲双胍贮存的主要场所，二甲双胍至少70%的降血糖作用由远端肠道负责；提示肠道可能是二甲双胍的主要作用部位。

肠道菌群与疾病的关系越来越受到关注。随着高通量测序技术的运用和普及，大量研究^[8-9]报道了肠道菌群与糖尿病等的关系。目前益生菌、益生元，甚至粪菌移植已用于代谢相关疾病的治疗，但二甲双胍对肠道菌群的影响尚不十分清楚。阐明二甲双胍对肠道菌群及其代谢产物的作用，以及通过肠道对机体代谢的影响，可能为对二甲双胍不耐受的个体使用肠道益生菌和益生元替代疗法提供新思路。

短链脂肪酸由肠道菌群通过糖酵解和氨基酸及其他有机化合物代谢产生，它们构成肠上皮细胞的燃料，可以通过AMPK诱导提高肠道屏障的完整性^[10]。短链脂肪酸可以通过抑制肝乙酰辅酶A羧化酶-1抑制大鼠的脂肪从头生成^[11]，还可通过抑制食欲和诱导白色脂肪组织褐变等途径发挥抗肥胖作用^[12]。接受二甲双胍治疗的2型糖尿病患者产生短链脂肪酸的菌属的相对丰度增加^[13]，但二甲双胍对高脂饮食下肠道内容物中乙酸、丙酸、丁酸等水平的影响及可能产生的代谢益处尚不明确。

中链脂肪酸大部分来自天然食物，少部分可由肠道菌群代谢产生。中链脂肪酸不仅可以作为能量来源，还可以调节葡萄糖和脂质代谢^[14]。由于其良好的吸收特性，膳食中链脂肪酸多用于代谢和消化异常，例如胰腺功能不全、脂肪吸收不良、淋巴乳糜微粒转运受损、严重的高乳糜微粒血症和全肠外营养患者^[15]。但在高脂饮食下内源性中链脂肪酸的变化及二甲双胍对其产生的影响并未有相关报道。本研究旨在通过高脂饮食喂养大鼠，探讨二甲双胍对高脂条件下肠道菌群、短链/中链脂肪酸的影响及可能的代谢益处。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已通过中南大学实验动物福利伦理委员会批准(审批号：2018sydw184)，实验过程符合动物实验伦理规范要求。

1.2 材料

实验动物：24只6周龄无特定病原体级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK(湘)2016-0002]提供，饲养在中南大学实验动物学部[许可证号：SYXK(湘)2015-0017]屏障环境设施中，室温21~22 ℃，湿度30%~70%，光照明暗各12 h循环，自由摄食和饮水，适应性饲养1周。主要试剂：二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司；苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；肝脏甘油三酯测试盒购自南京建成科技有限公司；QIAamp粪便DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；MiSeq基因测序试剂盒购自美国Illumina公司；核酸纯化试剂盒购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分组及标本收集

正常饮食适应性喂养1周后，将大鼠随机分为3组，每组8只。分组如下：1)正常饮食组(ND组)，以普通饲料(热量比为12%脂肪、66%碳水化合物、22%蛋白质，3.5 kcal/g)(1 kcal=4.186 kJ)喂养，实验第9周起，每日用等体积生理盐水灌胃；2)高脂饮食组(HFD组)，以高脂饲料(热量比为37%脂肪、17.5%蛋白质、45.5%碳水化合物，4.5 kcal/g)喂养，实验第9周起，每日用等体积生理盐水灌胃；3)高脂饮食+二甲双胍治疗组(HFD+Met组)，以高脂饲料喂养，实验第9周起，每日用二甲双胍溶液(150 mg/kg体重)灌胃。实验共持续16周，期间每周记录大鼠体重及进食量。

实验第16周末，大鼠禁食过夜后，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg体重麻醉^[16]。于上腔静脉采血，以3 000 r/min离心20 min分离血清，保存在-80 ℃冰箱中用于后续检测。取出肝组织，称量肝重，剪取部分固定在4%多聚甲醛溶液中，用于后续石蜡包埋。其余肝组织保存在-80 ℃冰箱中用于后续检测。无菌留取结肠内容物，保存在-80 ℃冰箱中用于后续检测。实验结束后，所有大鼠经过量麻醉处死。

1.3.2 大鼠腹腔葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验

实验第16周行腹腔葡萄糖耐量试验(intra-peritoneal glucose tolerance tests，IPGTT)。大鼠禁食12 h后，予以腹腔注射2 g/kg体重的20%葡萄糖溶液。在第0、15、30、60、120 min时于尾静脉取血，并用血糖仪测定血糖。

实验第16周行胰岛素耐量试验(insulin tolerance test，ITT)。大鼠禁食5 h后，予以腹腔注射0.5 U/kg体重的胰岛素。在第0、15、30、60、120 min时于尾静脉取血，并用血糖仪测定血糖。

1.3.3 内脏脂肪测量

实验第16周，大鼠麻醉后呈俯卧位置于双能X射线吸收测定仪(GE Lunar Prodigy)测定内脏脂肪质量。

1.3.4 血生化检测

取大鼠血清，使用迈瑞全自动生化分析仪检测血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平。检测步骤严格按照分析仪说明书进行。

1.3.5 肝脏组织学检测

将用石蜡包埋好的肝组织置于切片机上切片，厚5 μm，贴于载玻片上，进行HE染色，于显微镜下观察并取图。使用非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)活动评分(NAFLD activity score，NAS)评估肝损害状态，评分指标包括脂肪变性、小叶炎症、气球样变和纤维化^[17]。所有组织学评估均由1名对治疗分组不知情的病理学专家完成。

1.3.6 肝脏甘油三酯检测

采用改良的Folch法提取肝脏脂质^[18]。将0.5 g肝组织切碎，加入5 mL氯仿-甲醇(2꞉1 v/v)中，用研磨机研磨。搅拌后加入0.9%NaCl溶液，静置24 h，使两相完全分离。提取含总脂质的下相，将溶剂在氮气下蒸发后，在无水乙醇中重悬脂质。然后使用甘油三酯测试盒测定肝组织提取液中甘油三酯水平。

1.3.7 肠道菌群分析

结肠内容物样本送至上海天昊生物科技有限公司进行肠道菌群检测。使用QIAamp粪便DNA提取试剂盒从大鼠结肠内容物中提取基因组DNA，以标准的细菌基因组DNA Mix为模板，扩增样本16S rRNA基因V3~V4高变异区。PCR产物经过纯化并调整浓度后在Miseq平台上采用2×250 bp的双端测序策略进行测序。原始数据通过微生物生态学定量分析(quantitative insights into microbial ecology，QIIME)进行过滤以去除低质量读数^[19]。通过UPARSE算法，以97%的相似度阈值对操作分类单位(operational taxonomic units，OTU)进行聚类^[20]。采用observed species和Shannon指数进行α多样性分析。基于Bray-Curtis距离矩阵主坐标进行β多样性分析。通过线性判别分析效应量(linear discriminant analysis effect size，Lefse)观察各组之间微生物群落差异^[21]。使用基于系统发育的群落未观测状态重建(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt)软件预测肠道微生物群功能概况。PICRUSt基于16S rRNA数据库和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库进行分析^[22]。

1.3.8 短链/中链脂肪酸测定

结肠内容物样本送至中科脂典公司进行短链/中链脂肪酸检测。参考文献[23]方法，采用高效液相色谱-质谱联用法测定结肠内容物中的短链/中链脂肪酸水平。用乙腈꞉水(1꞉1)混合溶剂从样本中提取脂肪酸，并加入适量丁酸-2，2-d₂和¹³C1-辛酸作为内标定量。使用Exion UPLC-QTRAP 6500 PLUS液质联用仪对目标代谢物进行定性、定量检测，条件为：气帘气为20 psi，离子喷雾电压为5 500 V，温度为400 ℃，离子源气体1为35 psi，离子源气体2为35 psi。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。对于正态分布的数据，以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行组间差异的评估，并采用Bonferroni事后检验(假设方差相等)或Tamhane’s T2事后检验(不假设方差相等)进行多重比较。对于非正态分布的数据，采用Kruskal-Wallis非参数检验，并使用Dunn检验进行组间两两比较。采用QIIME软件进行微生物相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 二甲双胍对<bold>HFD</bold>大鼠糖脂代谢、肥胖和脂肪肝的影响

HFD组大鼠平均能量摄入及16周末体重增量显著高于ND组；与HFD组相比，HFD+Met组体重增量显著降低(均P<0.01)，但平均能量摄入未见明显差异(图1A、1B)。IPGTT和ITT试验显示：HFD组大鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性均显著低于ND组(均 P<0.01)，二甲双胍治疗提高了高脂饮食大鼠的葡萄糖耐量(P<0.01)及胰岛素敏感性(P<0.05，图1C、1D)。与ND组相比，HFD组大鼠血清中总胆固醇、低密度脂蛋白水平和内脏脂肪相对含量明显增高，高密度脂蛋白水平降低；与HFD组相比，HFD+Met组内脏脂肪相对含量显著降低(均P<0.01，图1E、1F)。

与ND组相比，HFD组肝重/体重比值，肝脏甘油三酯、血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著增高；与HFD组比较，HFD+Met组肝重/体重比值，肝脏甘油三酯、血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平均显著降低(均P<0.05，图2A~2D)。HE染色结果显示：与ND组相比，HFD组肝脏肝细胞脂肪变性明显，可见较多炎症细胞浸润，NAS显著增高；HFD+Met组脂肪空泡和炎症细胞浸润较HFD组明显减少，NAS显著降低(均P<0.05，图2E)。

2.2 二甲双胍对高脂饮食大鼠肠道菌群多样性的影响

如图3A所示，通过高通量测序共得到1 389个OTUs，ND组独有223个OTUs，HFD组独有35个OTUs，HFD+Met组独有108个OTUs，3组共有608个OTUs。该结果表明各组大鼠肠道菌群结构既有一定的相似，又存在一定的差异。HFD组的observed species和Shannon指数均显著低于ND组(均P<0.05)；而HFD+Met组与HFD组比较，observed species和Shannon指数无显著变化(图3B、3C)，表明二甲双胍治疗没有显著影响高脂饮食大鼠肠道菌群的α多样性。

主坐标分析发现：与ND组比较，HFD组菌群的整体结构发生了显著变化，HFD+Met组与另外2组在菌群分类上也存在明显差异(图3D)。这提示二甲双胍改变了高脂饮食大鼠肠道菌群的整体结构。

2.3 二甲双胍对高脂饮食大鼠肠道菌群群落结构的影响

在门水平上，与ND组相比，HFD组厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)含量显著增加，拟杆菌门(Bacteroidetes)和Candidatus_Saccharibacteria含量显著减少，而HFD+Met组与HFD组在门水平上差异无统计学意义(图4A~4C)。

Lefse分析结果显示：在属水平上，与ND组相比，HFD组Blautia，Bilophila，Acetanaerobacterium，Akkermansia和Anaerovorax丰度显著增高(均P<0.05)；与HFD组比较，HFD+Met组Blautia(P<0.05)，Romboutsia(P<0.01)，Bilophila(P<0.05)，Bacteroides(P<0.05)丰度降低，Lactobacillus(P<0.01)丰度显著增高(表1，图4D；附图1，https://doi.org/10.57760/sciencedb. 29145)。

2.4 肠道菌群功能分析

KEGG分析结果显示：与ND组相比，HFD组有161条通路发生改变，其中必需氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等)的生物合成、淀粉和蔗糖代谢等通路活性增高。与HFD组相比，HFD+Met组有61条通路发生改变，其中糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖的代谢、酮体的合成与降解、丙酸盐代谢等通路活性显著升高(图5A)。

2.5 关键菌属与表型的相关性

Spearman相关性分析结果显示：大鼠的体重增量和胰岛素抵抗与Lactobacillus菌属呈显著负相关；大鼠内脏脂肪相对含量与Lactobacillus、Barnesiella和Helicobacter菌属呈显著负相关；肝脏NAS、肝脏甘油三酯水平与Prevotella、Turicibacter、Ruminococcus、Bifidobacterium和Helicobacter菌属呈显著负相关；大鼠血清谷草转氨酶水平与Helicobacter菌属呈显著负相关(均P<0.05，图5B)。

2.6 二甲双胍对高脂饮食大鼠短链<bold>/</bold>中链脂肪酸的影响

与ND组相比，HFD组结肠内容物中乙酸、丙酸、异庚酸、辛酸和壬酸水平升高，丁酸、戊酸和庚酸的水平降低(均P<0.05)。与HFD组比较，HFD+Met组丁酸(P<0.05)、2-甲基丁酸(P<0.05)、戊酸(P<0.01)、辛酸(P<0.01)和月桂酸(P<0.01)水平显著增高，乙酸(P<0.01)、异庚酸(P<0.01)和壬酸(P<0.01)水平显著降低(图6A、6B)。

大鼠短链/中链脂肪酸与肠道菌属间存在密切相关性，其中，乙酸盐、丙酸盐与Erysipelotrichaceae_incertae_sedis菌属呈显著正相关，丁酸盐、庚酸盐与Eisenbergiella菌属呈显著正相关，异庚酸与Murimonas菌属呈显著正相关，壬酸与Romboutsia菌属呈显著正相关，月桂酸与Alistipes菌属呈显著正相关(附图2，https://doi.org/10.57760/sciencedb.29145)。

Spearman相关性分析结果显示：大鼠结肠内容物中乙酸盐、异庚酸盐和壬酸盐水平与大鼠葡萄糖耐量、血清总胆固醇水平、内脏脂肪相对含量、肝脏NAS及肝脏甘油三酯水平呈显著正相关；丁酸盐和戊酸盐水平与大鼠胰岛素抵抗、肝脏NAS、血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平呈显著负相关(均P<0.05，图6C)。

3 讨 论

二甲双胍是用于治疗2型糖尿病的一线药物，但随着代谢综合征对全球健康构成的巨大负担，更多的研究聚焦在二甲双胍对肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝等多种代谢性疾病的影响。最新研究^[24]表明：二甲双胍的生物学效应起源于肠道，其通过肠道介导的作用可能主要源于对肠道菌群及其代谢产物的改变。肠道菌群因其对能量代谢和免疫功能等各方面的调节作用，在代谢性疾病中占据重要地位。但二甲双胍对高脂饮食大鼠肠道菌群及短链脂肪酸、中链脂肪酸等代谢产物的具体影响及可能通过其发挥的潜在作用尚不清楚。

与既往研究^[25]一致，本研究发现二甲双胍治疗显著减少了高脂饮食诱导的体重增加，改善了高脂饮食大鼠的糖脂代谢紊乱及肝脏组织学损伤，降低了肝脏脂肪相对含量及血清转氨酶水平。在结肠内容物中，二甲双胍并没有影响肠道菌群的α多样性，却显著改变了菌群群落的整体结构。二甲双胍对肠道菌群α多样性的影响在既往研究中也并未得到一致性结果，如Zhang等^[26]在高脂喂养的Wistar大鼠模型中发现二甲双胍小幅度地降低了肠道菌群的丰富度和多样性，而Zhang等^[27]在糖尿病大鼠模型中证实，肠道菌群多样性并未受到二甲双胍的影响。这些结果提示，二甲双胍对菌群群落结构的影响可能并非通过提高菌群的丰富度和多样性实现，而是主要改变了菌群的组成。

值得注意的是，二甲双胍并未显著影响高脂饮食大鼠结肠内容物中厚壁菌门与拟杆菌门的比例，这与Forslund 等^[28]在2型糖尿病患者临床试验中得到的结论不同。厚壁菌门/拟杆菌门比值升高通常与宿主的肥胖及代谢障碍密切相关，这可能与其增加从食物中摄取的热量有关。本研究结果提示，二甲双胍并非在门水平上改变菌群组成，减少食物能量摄入，从而减轻高脂饮食诱导的体重增加；而是在属水平上，显著改变了高脂饮食大鼠的特征菌群。Lefse分析结果显示：二甲双胍显著增加了Lactobacillus的相对丰度，并使Blautia，Romboutsia，Bilophila和Bacteroides等菌属的相对丰度显著降低。

Lactobacillus是功能性食品和膳食补充剂中使用最广泛的益生菌，可对肥胖、炎症、动脉粥样硬化等发挥有益作用。Kang等^[29]研究显示：Lactobacillus治疗可以降低高脂饮食小鼠的体重、脂肪量，减轻炎症和胰岛素抵抗，Lactobacillus不仅可以逆转高脂饮食诱导的肠道菌群失调，还能够维持肠道屏障完整性，降低代谢性内毒素血症。此外，Lactobacillus治疗小鼠的抗肥胖效果可通过粪便移植传递给高脂饮食喂养小鼠^[29]。Hsieh等^[30]研究发现口服 Lactobacillus reuteri可以降低高果糖饮食喂养大鼠的血糖和糖化血红蛋白水平，提高胰岛素敏感性。而He等^[31]的实验结果显示：Lactobacillus casei Zhang可以通过激活肠道上皮葡萄糖转运蛋白1减少小鼠脂肪积累，改善葡萄糖耐量。但二甲双胍对Lactobacillus的促进作用并未有明确报道，本研究结果显示Lactobacillus丰度与大鼠体重增量、胰岛素抵抗及内脏脂肪含量呈显著负相关，二甲双胍可能通过增加肠内容物中Lactobacillus丰度对高脂饮食大鼠的代谢发挥有益作用。

短链脂肪酸是肠道菌群代谢产物，也是结肠细胞的主要能量来源，具有调节免疫、调节氧化应激、抗炎、抗肿瘤、抗菌和改变肠道完整性等多重作用^[32]。本研究结果显示二甲双胍显著增加了高脂饮食大鼠结肠内容物中丁酸盐水平。丁酸盐被认为可以通过调节体内的能量摄入-消耗平衡而成为体重的调节剂^[33]。在动物模型中，膳食中补充丁酸盐可以预防高脂饮食诱导的肥胖及相关并发症^[34]。丁酸盐对肥胖的作用机制可能与激活AMPK，增加ATP消耗和诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅助激活因子1α(α subunit of peroxisome proliferators activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1α)活性有关^[34]。den Besten等^[35]研究发现：膳食丁酸盐补充剂可通过下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor-γ，PPAR-γ)的表达和活性，从促进脂肪生成转变为促进脂质氧化，从而发挥潜在的抗肥胖效应。在临床试验中，二甲双胍也同样增加了2型糖尿病患者肠道中产丁酸盐的菌属^[36]。与丁酸盐变化趋势一致，二甲双胍显著增加了结肠内容物中戊酸盐水平，但戊酸盐在肥胖患者中的变化存在相反的结果，如有临床研究^[37]显示肥胖合并多囊卵巢综合征患者肠道中戊酸盐水平明显增加；而在另一项临床试验^[38]中，年轻的肥胖患者粪便中戊酸盐水平显著降低。戊酸盐与机体糖脂代谢的关系也未有相关报道。本研究结果提示，结肠内容物中丁酸盐和戊酸盐的水平与大鼠的胰岛素抵抗、肝脏损伤呈显著负相关，二甲双胍可能通过促进丁酸盐的产生对机体发挥代谢益处，而通过增加戊酸盐水平对机体产生的影响尚需进一步验证。

与短链脂肪酸已有的大量研究不同，中链脂肪酸在肥胖及代谢性疾病中发挥的作用并未得到过多关注。在肥胖、糖尿病、高甘油三酯血症等代谢性疾病中，中链脂肪酸可以促进脂质代谢和体重减轻。Zhang等^[39]报道，在健康成年人的膳食中添加2%的中链脂肪酸可导致脂肪氧化和能量消耗增加。Sebag等^[40]研究发现中链脂肪酸中的6-羟基己酸可以抑制脂肪细胞促炎细胞因子的产生和脂肪分解，改善肥胖相关的葡萄糖耐量不良和胰岛素抵抗。此外，中链脂肪酸还可以通过激活生长分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF-15)-胶质细胞源性神经营养因子家族α样受体(glial cell line derived neurotrophic factor family receptor α-like，GFRAL)轴减少小鼠的食物摄入^[41]。本研究结果显示二甲双胍治疗显著增加了大鼠结肠内容物中月桂酸水平。月桂酸在中链脂肪酸中含量较高，占椰子油脂肪酸含量的50%。Xia等^[42]研究证实，月桂酸甘油三酯可以通过改善肥胖大鼠的血清甘油三酯代谢，减少脂肪细胞和肝脏脂质沉积，从而改善高脂饮食诱导的大鼠肥胖。另有研究^[43]显示：饮食中添加月桂酸会增加脂肪组织炎症、全身性胰岛素抵抗和肝损伤，但与饮食中添加棕榈酸相比，月桂酸引起的代谢紊乱的程度较小。Žáček等^[44]同样证实，与喂食含其他饱和脂肪酸的致肥胖饮食相比，补充月桂酸的饮食所引起的体重增加和肥胖相关并发症较少。由此推测，适量的月桂酸可以改善机体脂质代谢，过量的月桂酸虽有致肥胖作用，但所引起的代谢紊乱较其他饱和脂肪酸较轻。本研究结果提示，二甲双胍可能通过促进内源性月桂酸的产生，改变不同中链脂肪酸比例，从而调节机体代谢。

综上所述，二甲双胍显著增加了高脂饮食大鼠结肠内容物中Lactobacillus等益生菌的丰度，促进丁酸盐、戊酸盐等短链脂肪酸的产生，增加月桂酸在中链脂肪酸中的比例，从而调节机体代谢，为二甲双胍通过肠道改善高脂饮食诱导的代谢紊乱提供了新的证据。临床上对二甲双胍不耐受人群，在其膳食中添加不同比例的益生菌、短链/中链脂肪酸是否可以发挥同样的代谢益处尚需进一步研究。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2024JJ5422)

湖南省自然科学基金(2024JJ5550)

湖南省自然科学基金(2024JJ6494)

长沙市重大科技专项(kh2301027)

湖南省重点研发计划(2024DK2001)

湖南省重点研发计划(2024JJ5550)

湖南省重点研发计划(2024JJ6494)

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