Notch信号通路配体JAG1基因多态性与子痫前期的相关性

Correlation between JAG1 ligand gene polymorphisms in the Notch signaling pathway and preeclampsia

摘要

目的 子痫前期(preeclampsia，PE)以妊娠20周后新发的高血压和蛋白尿为特征，严重影响母婴近期及远期健康，其病因及发病机制尚未完全阐明。Notch信号通路在PE发生的早期上游机制―滋养细胞浸润及胎盘血管生成中发挥重要作用。锯齿状1(jagged canonical Notch ligand 1，JAG1)基因参与编码的锯齿状蛋白1(Jagged1蛋白)是Notch信号通路的配体，与PE的发生密切相关。本研究旨在探讨JAG1基因多态性与PE发生的关联，为PE的预防及早期干预提供理论依据。 方法 采用以医院为基础的病例对照研究设计，选取2021年3至12月于某医院就诊的117例PE患者作为病例组，同期就诊的年龄匹配的266例非PE孕妇作为对照组。通过问卷调查收集研究对象的人口学特征、生育史、个人患病史、家族史及孕期生活方式等信息，并采集外周静脉血，采用MassARRAY系统对JAG1基因的12个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点进行基因分型。对JAG1基因的12个SNPs位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，对符合平衡的位点，采用单因素和多因素Logistic回归分析探讨其与PE的关联。采用Haploview 4.2软件分析JAG1基因各SNP位点的连锁不平衡，构建单倍型，并评估各单倍型与PE发生的关联。采用广义多因子降维(generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR)及相加、相乘交互作用模型，评估JAG1基因各SNP位点间的交互作用及其与PE的关联。利用检索基因/蛋白质相互作用的搜索工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，STRING)数据库进行JAG1的蛋白质-蛋白质相互作用分析，并采用人类非编码区单核苷酸多态性与三维互作基因关联(linking human non-coding SNPs to their three-dimensional interacting genes，3DSNP)数据库对候选SNP位点进行功能注释。 结果 JAG1基因共有8个SNPs位点符合Hardy-Weinberg平衡，经错误发现率(false discovery rate，FDR)校正后，仅发现rs73604319位点的等位基因频率分布在2组间存在显著差异(Q_FDR<0.05)，其中G等位基因在对照组中频率更高(24.6% vs 15.4%)，提示G等位基因可能为PE的保护等位基因。多因素Logistic回归分析显示：8个位点的各种遗传模型与PE的关联经多重校正后均不显著。然而，进一步的单倍型分析发现，由JAG1基因内rs1051412、rs73611723、rs7264849及rs73604319位点构成的CTCG单倍型(OR=0.653，95% CI 0.429~0.993)和CCCG单倍型(OR=0.293，95% CI 0.100~0.860)与PE发生风险降低相关。交互作用分析结果显示：在JAG1基因各SNP位点的交互作用中，由rs73604319和rs73611723位点构成的一阶模型为最佳模型，其相加交互作用无统计学意义，而相乘交互作用有统计学意义(aOR=0.571，95% CI 0.332~0.972)。JAG1的蛋白质-蛋白质相互作用分析显示：其与Notch1、Notch2、Notch3、Notch4等多个Notch信号通路相关蛋白存在相互作用(综合评分为0.999)。3DSNP数据库分析显示：rs73604319与rs73611723位点的启动子活性评分最高，且在胎盘合体滋养层、绒毛滋养层及血管内皮细胞的单细胞转座酶可及染色质的高通量测序(single-cell assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，scATAC-seq)数据中均呈现高信号峰和开放染色质特征。 结论 JAG1基因rs73604319位点的G等位基因可能与PE风险降低相关；由JAG1基因内rs1051412、rs73611723、rs7264849及rs73604319位点构成的CTCG单倍型和CCCG单倍型可能与PE发生风险降低相关；JAG1基因rs73604319与rs73611723位点对PE风险可能存在相乘交互作用；生物信息学分析提示，rs73604319与rs73611723位点位于染色质开放区域，且可能与调控JAG1基因表达的启动子功能相关，但其在胎盘滋养层浸润与血管生成中的具体作用机制有待进一步验证。

Abstract

Objective Preeclampsia (PE) is a clinical syndrome characterized by new-onset hypertension and proteinuria after 20 weeks of gestation, seriously affecting the short- and long-term health of both mothers and infants. The etiology and pathogenesis of PE remain incompletely understood. The Notch signaling pathway plays an important role in early upstream processes of PE, including trophoblast invasion and placental angiogenesis. Jagged canonical Notch ligand 1 (JAG1) encodes the Notch ligand protein Jagged1, which is closely associated with the development of PE. This study aims to investigate the association between JAG1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and PE risk to support theoretical foundations for PE prevention and early intervention. Methods A hospital-based case-control study was conducted, including 117 pathologically confirmed PE patients recruited from March to December 2021 as the case group, and 266 age-matched non-PE women recruited during the same period as the control group. Demographic characteristics, reproductive history, personal disease history, family history, and pregnancy lifestyle factors were collected using standardized questionnaires. Peripheral venous blood samples were obtained for genotyping 12 JAG1 SNP loci using the MassARRAY system. Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) testing was performed on 12 SNP loci, and loci meeting equilibrium were analyzed using univariable and multivariable logistic regression. Linkage disequilibrium (LD) analysis and haplotype construction were performed using Haploview 4.2, and associations between haplotypes and PE risk were evaluated. Interactions between SNP loci and PE were assessed using generalized multifactor dimensionality reduction (GMDR) and additive/multiplicative interaction models. Search tool for the retrieval of interacting genes/proteins (STRING) and three-dimensional interacting genes (3DSNP) databases were used for protein-protein interaction (PPI) analysis and functional annotation of candidate SNPs, respectively. Results Eight of the 12 JAG1 SNP loci met HWE. After false discovery rate (FDR) correction, the allele frequency distribution of rs73604319 differed significantly between the case and control groups (Q_FDR<0.05), and the G allele was more frequent in the control group compared to the other group (24.6% vs 15.4%), suggesting that the G allele may be a protective allele against PE. After multiple testing corrections, no significant associations were observed across the 8 loci in multivariable logistic regression under any genetic models. Haplotype analysis based on the rs1051412, rs73611723, rs7264849, and rs73604319 loci identified 2 haplotypes, CTCG (OR=0.653, 95% CI 0.429 to 0.993) and CCCG (OR=0.293, 95% CI 0.100 to 0.860), both associated with reduced PE risk. The best-performing first-order GMDR model consisted of rs73604319 and rs73611723, with no significant additive interaction but a significant multiplicative interaction (aOR=0.571, 95% CI 0.332 to 0.972). Protein-protein interaction (PPI) analysis demonstrated strong interactions between JAG1 and Notch-related proteins including Notch1, Notch2, Notch3, and Notch4 (combined score=0.999). 3DSNP analysis revealed high promoter activity scores for rs73604319 and rs73611723, both presenting high-throughput sequencing (scATAC-seq) signal peaks and open-chromatin features in placental syncytiotrophoblasts, villous trophoblasts, and vascular endothelial cells. Conclusion The G allele at rs73604319 in the JAG1 gene may be associated with reduced PE risk. The CTCG and CCCG haplotypes constructed from rs1051412, rs73611723, rs7264849, and rs73604319 loci may be associated with reduced PE risk. A potential multiplicative interaction between rs73604319 and rs73611723 may influence PE risk. Bioinformatics suggests that rs73604319 and rs73611723 reside in open chromatin regions and may be related to promoter functions regulating JAG1 gene expression. Their specific mechanisms in placental trophoblast invasion and angiogenesis remain to be further validated.

Graphical abstract

关键词

子痫前期 / JAG1基因 / 单核苷酸多态性 / Notch信号通路 / 病例对照研究

Key words

preeclampsia / JAG1 gene / single nucleotide polymorphism / Notch signaling pathway / case-control study

子痫前期(preeclampsia，PE)是指孕中期(20周以上)孕妇首次出现以血压升高和蛋白尿为主要特征的一类妊娠期疾病^[1]，全球发病率为3.00%~5.00%^[2]，中国约为4.10%^[3]。PE不仅会增加早产、胎儿生长受限、宫内窘迫、死产等不良妊娠结局的发生风险^{[1, 4]}，还会增加母亲产后发生心血管疾病、代谢综合征等疾病及婴儿未来患高血压、神经发育障碍等疾病的风险^[5-8]，严重影响母婴近期及远期健康。同时，近年来，中国生育政策的开放导致高龄孕妇数量增加^[9]，辅助生殖技术的进步导致双胎及多胎妊娠增加^[10-11]。高龄、多胎均为PE的危险因素，进一步加剧了PE对中国母婴人群健康的威胁。目前研究^[12-13]提示PE是一种多因素疾病，其病因尚未完全阐明，需开展相关病因学研究为其早期预防提供新的靶点。

遗传因素可能在PE的发展中发挥重要作用。Mogren等^[14]的研究发现PE具有家族聚集的现象，Salonen等^[15]的研究表明PE的遗传度高达54%。此外，主流观点认为PE的发病早期上游机制包括滋养细胞浸润不足、胎盘血管生成异常及子宫螺旋动脉重铸障碍等^{[1, 13, 16-18]}。Notch信号通路为滋养细胞浸润的重要路径，在胎盘血管发生中占有重要地位^[19-23]，提示编码Notch信号通路相关配体的基因可能在PE的发生中发挥重要作用。JAG1(jagged canonical Notch ligand 1)基因位于20号染色体p12.2，其编码的Jagged1蛋白是Notch信号通路上不可或缺的配体之一。国内研究^[24]显示：Jagged1蛋白主要存在于血管内皮细胞和绒毛滋养细胞中，其在PE胎盘组织中的表达异常与PE的发生密切相关。这提示JAG1基因可能通过影响Jagged1蛋白的表达，进而影响胎盘的血管形成，参与PE的发生。然而，目前关于Jagged1与PE的研究多局限于动物实验或胎盘组织表达水平，尚未在孕妇外周血中开展JAG1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与PE关联的研究。因此，需开展相关研究探究JAG1基因的SNPs与PE发生的关联。同时，鉴于PE为多因素疾病，分析JAG1基因不同位点间的交互作用，有助于更全面地揭示遗传因素在PE发生中的作用。

本研究采用病例对照研究设计，收集PE患者和对照人群的流行病学问卷信息及血液样本；检测孕妇外周血中JAG1基因12个SNPs基因型频率的分布情况，控制混杂因素后在特定遗传模型下评估JAG1基因12个SNPs与孕妇PE发生的关联，筛选与PE发生相关的SNPs；构建单倍型初步探讨JAG1基因内的单倍型与孕妇PE发生的关联性；并从交互作用的角度出发，探讨各个位点间的交互作用与PE的关联；采用生物信息学分析对JAG1基因及与PE存在关联的SNPs进行功能注释，以期阐明JAG1基因多态性与PE发生风险的关联，为PE高危人群的筛查提供新的线索与靶点。

1 对象与方法

1.1 伦理声明

本研究获得中南大学湘雅公共卫生学院伦理委员会的批准(审批号：XYGW-2021-16)，研究对象均签署知情同意书。

1.2 对象

选取2021年3至12月于湖南省某医院产一科及门诊就诊的117例PE患者为病例组。病例组的纳入标准：1)根据中华妇产科学分会发布的《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》诊断为PE^[25]；2)自然受孕；3)汉族孕妇；4)病例间无亲缘关系；5)问卷及血液样本齐全。排除标准：既往患有高血压、心血管系统疾病或可能存在导致高血压发生的疾病的孕妇。选取同期该医院产一科及门诊就诊的266例年龄相匹配的非PE健康孕妇且无高血压既往史或与高血压相关疾患的自然受孕的汉族孕妇作为对照。

本研究以年龄为匹配因素，按照1꞉2匹配病例-对照研究设计的样本量公式^[26]计算样本量，其中n为所需病例数，α=0.05，β=0.10，Z_1-α/2=1.96，Z_β =1.28。为了更好地估算本次研究所需要的样本量，在正式研究实施前，招募调查员在研究现场开展为期4个月的预实验，收集到14例PE患者和18例对照的血液样本。预实验结果显示JAG1基因位点rs1051412和rs73604319在病例组与对照组之间的分布有差异，根据这2个位点在病例组与对照组间的突变率，计算JAG1基因在对照人群中的预期暴露率(P0)为22.8%，结合样本量公式^[26]，本研究中病例组所需样本量最少为116例，对照组所需样本量最少为232例。为扩大效应量，本研究最终纳入117例PE患者和266例健康对照。

1.3 方法

1.3.1 问卷调查

由接受统一培训的调查员进行调查，问卷包含人口学和社会学特征、产科史、生育史、个人患病史、家族史、孕前和孕期生活方式，如吸烟史、饮酒史、二手烟接触史、饮食习惯和服药史等及孕期前后居住和工作环境等信息。

1.3.2 血液样本的收集与保存

研究对象入组24 h内，由科室护士用乙二胺四乙酸抗凝管采集3~5 mL静脉外周血，于4 ℃冰箱内低温保存，12 h内运至实验室以3 500 r/min离心 15 min后分装编号，放入-80 ℃低温冰箱保存。本研究目标SNPs的检测使用分装后的血细胞样本。

1.3.3 候选位点的筛选

在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的dbSNP数据库和HapMap数据库中查询核实JAG1基因的主要SNPs位点，选取JAG1基因区域内所有最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)≥10%的常见SNPs。在此基础上，以连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)相关系数r²≥0.8为阈值，从所有强连锁的SNP组合中，仅挑选其中一个作为代表位点，从而构建一个无冗余的tag SNP集合。最终，筛选出12个JAG1基因的待测SNPs位点，分别为rs1051412、rs1051421、rs1801140、rs2235811、rs2273061、rs34134142、rs6040061、rs7264849、rs73604319、rs73611723、rs7828和rs8708，此筛选方案旨在高效覆盖JAG1基因区域内的常见遗传变异。

1.3.4 基因多态性检测

通过MassARRAY平台的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对JAG1基因的12个SNPs位点进行基因分型，各位点的引物设计评估通过美国Agena Bioscience公司的AssayDesigner 4.0软件来实现，引物合成则通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的方法进行，JAG1基因SNPs的相关检测工作由博淼生物科技(北京)有限公司完成。

1.4 统计学处理

数据库采用EpiData 3.1软件构建，统计分析使用SPSS 25.0和R 3.6.2软件。计数资料采用频数和百分比描述，二分类资料组间比较采用χ²检验或Fisher 确切概率法，等级资料采用非参数检验中的Mann-Whitney U检验。对照组人群基因型分布频率采用哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验，JAG1基因中符合HWE的SNPs与PE的关联采用Logistic回归分析。为控制多重假设检验中的假阳性率，本研究采用错误发现率(false discovery rate，FDR)对P值进行校正，经FDR校正后的P值(Q_FDR)<0.05时，认定差异具有统计学意义。使用Haploview 4.2软件进行连锁不平衡及单倍型分析，以相关系数r²≥0.8为连锁不平衡程度强，使用四配子检验法构建单倍型，并分析病例组与对照组间单倍型的分布差异。采用广义多因子降维(generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR)软件进行降维筛选最佳的交互作用模型，进一步使用R 3.6.2软件的interactionR包进行相加交互作用分析，分别计算3种交互作用指标：交互作用相对超额危险度(relative excess risk of interaction，RERI)、交互作用归因比(attributable proportions of interaction，API)、交互作用指数(the synergy index，S)。相乘交互作用通过SPSS 25.0软件在Logistic回归模型中引入相乘项实现。使用检索基因/蛋白质相互作用的搜索工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，STRING)数据库(版本12.0；https://string-db.org/)预测与JAG1基因编码蛋白质存在相互作用的其他蛋白质，具体参数设置遵循数据库默认推荐^[27]，以进一步揭示JAG1基因的生物学功能。此外，利用人类非编码区单核苷酸多态性与三维互作基因关联(linking human non-coding SNPs to their three-dimensional interacting genes，3DSNP)数据库(版本2.0；https://omic. tech/3dsnpv2/)对筛选出的SNP位点进行功能注释(包括增强子/启动子评分、转录因子结合等)和染色质可及性分析，其中，染色质开放状态可视化基于该数据库所整合的公共单细胞转座酶可及染色质的高通量测序(single-cell assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，scATAC-seq)数据生成^[28]。

2 结 果

2.1 病例组与对照组基本情况比较

本研究共纳入研究对象383例，其中病例组117例，对照组266例。2组的年龄、家庭总收入、孕次、不良妊娠史、家族3代近亲婚配史、家族成员先天畸形史、早孕反应、孕期发热、吸烟、二手烟暴露、饮酒、饮茶、饮用咖啡、居住地附近的可疑环境污染物、噪声暴露、居住房屋或工作单位装修、使用微波炉、染发或烫发、配偶年龄、饮酒差异均无统计学意义(均P>0.05)。2组受教育程度、孕前体重指数(body mass index，BMI)、剖宫产史、既往子宫疾病史、既往卵巢疾病史、本次妊娠诊断为妊娠糖尿病、血脂异常史，孕期咀嚼槟榔、叶酸补充，配偶受教育程度、吸烟及嚼槟榔差异均有统计学意义(均P<0.05，附表1，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb. 00140)。

2.2 对照组 JAG1 基因HWE检验结果

对照组JAG1基因的12个位点中，rs1051412、rs1051421、rs1801140、rs6040061、rs7264849、rs73604319、rs73611723、rs7828共8个SNPs位点符合HWE检验(P>0.05)。rs34134142位点未检测到多态性，rs2235811、rs2273061和rs8708共3个位点不符合HWE(均P<0.05，附表2，https://doi.org/10. 57760/sciencedb.xbyxb.00140)，因此，这4个位点未纳入后续分析。

2.3 JAG1 基因SNPs的组间分布

在未校正分析中，2组JAG1基因的rs1051412和rs73604319位点的基因型频率分布，以及rs73604319位点的等位基因频率分布存在差异(均P<0.05，表1)。然而，进行了多重校正后，仅rs73604319位点的等位基因频率分布差异具有统计学意义(Q_FDR=0.032)，其余关联均无统计学意义(均Q_FDR>0.05)。对rs73604319位点的分析表明，其C等位基因在病例组中的频率显著高于对照组(84.6% vs 75.4%)，提示C等位基因可能是PE的风险等位基因；相应地，G等位基因在对照组中频率更高(24.6% vs 15.4%)，提示其可能是保护性等位基因。

2.4 JAG1 基因多态性与PE的关联

多因素Logistic回归分析显示：在调整了混杂因素且进行了多重校正后，JAG1基因的各个位点在各种遗传模型下与PE的关系均无统计学意义(均Q_FDR>0.05)。rs73604319等位基因频率分布在未进行多重校正的多因素模型(包括共显性、显性、超显性及加性模型)中，与PE的关联均显著(均P<0.05)，且其调整混杂因素后的OR均小于1，其中，加性模型在进行了多重校正后P值接近显著性水平(Q_FDR=0.072)。此风险降低趋势与2.3节中关于G等位基因可能具有保护作用的方向一致，为rs73604319位点的潜在功能提供了来自多模型分析的支持。此外，rs1051412位点在隐性模型(CC vs AA+AC)下的未校正分析同样提示风险降低趋势(aOR=0.471，95% CI 0.267~0.832， P<0.05)，其FDR校正后P值同样接近显著性水平(Q_FDR=0.070，表2)。

2.5 JAG1 基因多态性连锁不平衡及单倍型分析

JAG1基因8个SNPs位点间连锁不平衡分析表明，仅有rs7828与rs1051421间存在连锁不平衡(r²≥0.8，附表3，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00140)。

单倍型分析显示：JAG1基因8个位点形成了2个单倍型块(图1)。其中，单倍型块1包含rs7828和rs1051421 2个位点，构成3种单倍型：AG、CA和CG。3种单倍型的频率分布在2组间差异均无统计学意义(均P>0.05)；单倍型块2包含4个位点，即rs1051412、rs73611723、rs7264849和rs73604319，构成7种单倍型，即ACCC、CTCG、CCCC、CCTC、CTTC、CCCG和CTCC，其中CTCG(OR=0.653，95% CI 0.429~0.993)和CCCG(OR=0.293，95% CI 0.100~0.860)单倍型的频率分布在2组间差异具有统计学意义(均P<0.05)，且与PE发生风险降低相关(表3)。

2.6 JAG1 基因SNPs位点间的交互作用

采用GMDR分析JAG1基因8个SNPs位点的交互作用与PE发生风险的关联，结果显示由rs73604319和rs73611723组成的2因子1阶交互作用为最佳模型，其内部测试样本的准确度(0.550 4)及交叉验证一致性(8/10)均最高(P=0.000 4，附表4， https://doi.org/10. 57760/sciencedb.xbyxb.00140)，提示此1阶交互作用可能与PE发生风险有关。

进一步调整混杂因素进行相加交互作用分析未观察到rs73604319与rs73611723对PE发生风险有统计学意义的相加交互作用(P>0.05)；相乘交互作用显示rs73604319与rs73611723对PE发生风险的相乘交互作用有统计学意义(aOR=0.571，95% CI 0.332~0.972，P=0.038；表4)。

2.7 基于STRING的蛋白质-蛋白质互作网络

通过STRING数据库构建JAG1基因表达的蛋白质Jagged1与其他蛋白质之间的蛋白质-蛋白质互作网络图(图2)。Jagged1蛋白与预测的蛋白质相互作用的综合得分见表5。其中，Jagged1蛋白与Notch通路家族中的4个I型跨膜受体(Notch1~4)的相互作用的证据最强，综合得分均为0.999。

2.8 JAG1 基因SNP位点的3DSNP数据库功能注释

基于3DSNP在线数据库，对等位基因频率与PE显著相关的rs73604319位点及与其存在相乘交互作用的rs73611723位点进行增强子和启动子状态、转录因子结合位点、Motif改变以及进化保守性方面的功能评估，结果见表6。其中，rs73604319的总评分最高，具有较高的生物学功能，上述2个位点的启动子评分均为最高(100.00)，提示其可能主要通过影响启动子来调控JAG1基因的表达。

进一步结合3DSNP数据库中上述2个位点的scATAC-seq数据发现，2个位点在胎盘合体滋养细胞、绒毛滋养细胞、胎盘血管内皮细胞中呈现高染色质开放状态(图3)。

3 讨 论

国内外研究^{[1, 13, 16-18]}发现，胎盘血管形成、子宫螺旋血管重铸和滋养细胞浸润能力在PE的发生过程中发挥至关重要的作用。Notch信号通路作为调控胚胎着床、胎盘血管发生和滋养细胞侵袭的重要路径，在这一过程中扮演重要角色^[19-23]。JAG1基因主要表达于胎盘中的血管内皮细胞和血管周细胞^{[21, 29]}，其编码的Jagged1蛋白是Notch信号通路的配体之一，蛋白质-蛋白质互作网络分析也显示与Jagged1相互作用评分最高的4个蛋白质为Notch通路家族中Notch1~4，提示JAG1基因在Notch信号通路中发挥重要作用。此外，Benedito等^[30]通过敲除小鼠视网膜细胞中JAG1基因，证实Jagged1的表达与血管发生有关。Hunkapiller等^[31]的研究显示JAG1基因表达产物的缺失与PE有关，提示JAG1基因可能通过影响胎盘血管形成，进而参与PE的发生^[24]，但目前尚未有研究探究JAG1基因多态性与PE的关联。

本研究分析了JAG1基因的12个SNPs位点与PE发病风险的关联，结果显示JAG1基因rs73604319位点的等位基因分布在PE组与对照组间差异显著，尽管基于遗传模型的关联在经过多重校正后未达到显著性水平，但rs73604319位点的G等位基因在多个模型中均显示出保护作用趋势，尤其是加性模型的关联性在多重校正后仍接近显著性水平(Q_FDR=0.072)。这些基于遗传模型的关联结果均需在未来研究中进一步验证。值得注意的是，JAG1基因多态性与PE发病机制存在重叠的血管畸形相关疾病也有显著关联。位点rs3840074和rs8708与圆锥动脉干畸形有关^[32]，位点rs7264849与先天性心脏病有关^[33]，位点rs542746042与法洛四联症存在关联^[34]。基于3DSNP等数据库的生物信息学预测分析显示，位于JAG1基因上游的rs73604319位点具有较高的启动子活性评分。据此推测，该位点可能作为一个转录调控元件，通过影响特定转录因子的结合，进而调控JAG1基因的转录效率。与此同时，其在胎盘合体滋养层、绒毛滋养层及血管内皮细胞的scATAC-seq数据中均呈现高信号峰和染色质开放特征，提示其可能是胎盘发育关键细胞中的调控位点，在维持胎盘血管发生和滋养细胞浸润中发挥一定作用。这些发现进一步支持了rs73604319在PE发病机制中发挥作用的结论。

单倍型是指位于同一条染色体上不同基因座的能够共同遗传的等位基因的组合，由于单倍型是连锁的基因型组合，蕴含了多个SNPs位点的遗传信息，可提高基因型-疾病关联分析的效率，常用于复杂疾病致病基因的探索。本研究采用四配子检验方法在8个位点中确定了2个单倍型块。其中，单倍型块2包含的4个位点构成了7种单倍型，CTCG和CCCG单倍型在病例组与对照组间的频率分布差异具有统计学意义，且可能降低PE的发病风险。这说明参与PE发病的JAG1基因变异可能不仅是单个SNP位点，还可能存在染色体区域突变。现有研究已发现了一些与PE存在关联的易感基因单倍型，如吴爱华等^[35]对80名孕妇的TAP基因构建了单倍体型，其中TAP2B和TAP2F分布频率在2组之间存在差异。张萍等^[36]发现在553例孕妇性激素代谢通路中HSD17B3基因与SULF1基因内存在单倍型并且与PE的发生有关。沈彦婷等^[37]通过荟萃分析分别构建了病例组和对照组的父亲与子代的HLA基因单倍型，并发现2组间存在差异。上述研究结果表明相应的基因可以通过免疫系统、激素内分泌等参与PE发生，进一步佐证了PE发生是由多基因参与的复杂疾病，同时可能有父系、母系遗传影响。

疾病的发生不仅是单一位点的作用，也存在多个位点间的交互作用^[38-39]。既往研究^[40]通过疾病易感基因SNP位点的关联分析发现了许多复杂疾病的病因，其中不乏与PE相关的SNP。本研究采用已经被成功应用于各疾病基因SNP位点间交互作用分析的GMDR软件对符合HWE检验的8个JAG1基因SNPs位点进行交互作用分析，发现位点rs73604319和rs73611723的1阶交互作用为最佳交互作用模型，进一步分析发现相乘交互作用的结果具有统计学意义。Cobellis等^[41]发现Notch1蛋白及mRNA水平在PE的胎盘中降低，认为其可能影响胎盘血管发育与重塑，进而引起PE。位点 rs73604319位于JAG1基因上游可能具有启动子功能的区域，而位点rs73611723虽位于5'非翻译区(5' untranslated region，5'UTR)区域，但3DSNP数据库的功能预测提示其同样具有高启动子活性。两者在胎盘发育的关键细胞中均表现出高度开放的染色质状态，提示它们可能共同位于一个核心的转录调控区间内，通过协同作用影响JAG1基因的转录起始或早期转录过程，进而参与PE的发生，其交互作用的具体生物学机制有待进一步研究。

本研究的局限性主要在以下几个方面：首先，作为基于中国汉族人群的病例对照研究，不同种族和人群的遗传结构可能存在差异，因此本研究结果的外推性可能受限，未来有待在不同人群中进行进一步验证；尽管在研究设计和执行中实施了严格的质量控制，但仍难以完全避免回忆偏倚、选择偏倚等该类研究固有的局限性。其次，本研究仅聚焦于JAG1基因的常见变异(MAF≥10%)，且该基因仅为Notch信号通路中的一个关键成员，未来有必要进一步探索该通路的其他基因以及JAG1基因本身的低频和罕见变异对PE易感性的潜在影响。再次，在统计推断上，经过严格的多重校正后，多种遗传模型与PE的关联均未达到统计学意义，这反映了此类分析对证据强度的更高要求，在未校正分析中部分较强的信号仍需在未来更大样本中进行验证。最后，在机制阐释层面，本研究发现的与PE存在关联的遗传位点缺乏潜在机制相关的生物功能学实验研究，未来有待开展相关实验进行验证。

综上，JAG1基因rs73604319位点的G等位基因可能与降低PE风险相关。JAG1基因rs1051412、rs73611723、rs7264849和rs73604319构成的CTCG和CCCG单倍型与较低的PE风险存在关联，rs73604319位点和rs73611723位点对PE风险可能存在相乘交互作用。生物信息学分析初步提示，rs73604319和rs73611723位点位于胎盘相关细胞的染色质开放区域，其功能可能涉及对JAG1基因表达的调控，这为探讨JAG1在PE发病机制中的作用提供了潜在的线索。本研究结果为进一步探索PE的遗传易感因素提供了初步依据，但上述关联及潜在机制尚需在更大规模的人群及功能实验中予以验证。未来的研究可在此基础上，深入探究JAG1基因多态性影响PE发生的具体生物学机制。

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基金资助

国家自然科学基金(82173608┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ┣82173608)

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