BTVT通过肠-脑轴改善孕哺期氧化钕暴露诱导的子代血脑屏障损伤

BTVT ameliorates offspring blood-brain barrier damage induced by prenatal and lactational neodymium oxide exposure via the gut-brain axis

摘要

目的 稀土元素(rare earth elements，REEs)暴露与多种全身性疾病有关，但其通过肠-脑轴对子代血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的影响尚不清楚。本研究通过对亲代暴露于氧化钕(neodymium oxide，Nd₂O₃)的子代大鼠组织进行检测，以探究亲代Nd₂O₃暴露对子代BBB完整性的影响，并探讨双歧杆菌四联活菌片(bifidobacterium tetrad viable tablet，BTVT)对Nd₂O₃所致子代肠道及BBB损伤的改善作用。 方法 选取健康成年SD大鼠，按雌雄1꞉1的比例进行合笼，次日清晨检查是否出现阴栓，发现阴栓的当天标记为妊娠第0天。将60只妊娠大鼠随机分为Control组、50 mg/(kg·d) Nd₂O₃组、100 mg/(kg·d) Nd₂O₃组、200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组及200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组，分别给予10 mL/(kg·d)的0.9% NaCl溶液、50 mg/(kg·d) Nd₂O₃、100 mg/(kg·d) Nd₂O₃、200 mg/(kg·d) Nd₂O₃及200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT灌胃。所有组别均在妊娠期和哺乳期每日灌胃1次。在子代大鼠出生后第21天(断乳期)取其粪便、脑组织和结肠组织进行检测。采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色观察脑组织和肠黏膜结构的改变。采用气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)检测子代大鼠粪便中短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸含量的变化。尾静脉注射伊文思蓝(evans blue，EB)后进行心内灌注，取灌注后的脑组织检测BBB通透性变化。采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测紧密连接相关基因闭锁蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)的表达水平。采用蛋白质印迹法(Western blotting，WB)检测occludin、ZO-1蛋白的表达水平。通过电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)检测子代大鼠脑组织中钕元素含量。 结果 HE染色结果显示：亲代母鼠Nd₂O₃暴露后，子代大鼠结肠黏膜下间隙增大、水肿，并伴有淋巴细胞等炎症细胞浸润，脑组织出现空泡，神经元大量变性；BTVT干预后，子代大鼠肠黏膜结构接近正常，炎症细胞浸润和神经元变性得到改善。GC-MS检测结果显示：亲代母鼠暴露于Nd₂O₃后，子代大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸含量均较Control组显著降低，戊酸和异戊酸含量均显著升高(均P<0.05)；BTVT干预后，粪便中乙酸、丙酸和异丁酸的含量均较200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组显著上升(均 P<0.05)，戊酸含量下降(P<0.05)，均接近Control组含量。EB染色结果显示：亲代母鼠暴露于Nd₂O₃后，子代大鼠脑组织内EB渗透量显著增加(P<0.05)；BTVT干预后的子代大鼠脑组织内EB渗透量较200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组显著减少(P<0.05)。RT-PCR和蛋白质印迹结果均显示：亲代母鼠暴露于Nd₂O₃后，子代大鼠脑组织的occludin和ZO-1基因和蛋白质表达水平均较Control组显著下降(均P<0.05)；BTVT干预后的子代大鼠脑组织内occludin和ZO-1基因和蛋白质表达水平均较200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组显著升高(均P<0.05)。ICP-MS结果显示：与Control组相比，亲代母鼠Nd₂O₃暴露均可显著增加子代大鼠脑组织内钕含量(均P<0.05)；BTVT干预后的子代大鼠脑组织内钕含量显著低于200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组(P<0.05)。 结论 亲代妊娠期及哺乳期暴露于Nd₂O₃改变了子代肠黏膜的健康状态，增加了BBB通透性和脑中钕元素含量，导致神经元大量变性，BTVT共处理能够缓解Nd₂O₃所造成的子代肠道及BBB损伤。

Abstract

Objective Exposure to rare earth elements (REEs) has been linked to various systemic diseases, but their impact on the offspring blood-brain barrier (BBB) via the gut-brain axis remains unclear. This study aims to investigate the effects of maternal exposure to neodymium oxide (Nd₂O₃) on the BBB integrity of offspring rats, and to evaluate the potential protective role of bifidobacterium tetrad viable tablets (BTVT) against Nd₂O₃-induced intestinal and BBB damage. Methods Healthy adult SD rats were mated at a 1:1 male-to-female ratio, with the day of vaginal plug detection marked as gestational day 0. A total of 60 pregnant rats were randomly assigned to the following groups: Control, 50 mg/(kg·d) Nd₂O₃, 100 mg/(kg·d) Nd₂O₃, 200 mg/(kg·d) Nd₂O₃, and 200 mg/(kg·d) Nd₂O₃ + BTVT group. Treatments were administered by daily oral gavage throughout pregnancy and lactation. On postnatal day 21 (weaning), offspring feces, brain, and colon tissues were collected. Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to assess structural changes in brain and intestinal tissues. Short-chain fatty acids (SCFAs) in feces were quantified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Evans Blue (EB) dye extravasation assessed BBB permeability. Gene and protein expression levels of tight junction proteins occludin and zonula occludens-1 (ZO-1) were measured by reverse transcription PCR (RT-PCR) and Western blotting (WB), respectively. Neodymium levels in brain tissue were determined via inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Results HE staining revealed that maternal Nd₂O₃ exposure caused mucosal edema, increased submucosal spacing, and lymphocyte infiltration in offspring colon, as well as neuronal degeneration and vacuolization in brain tissue. BTVT intervention alleviated these changes. GC-MS analysis showed that levels of acetic acid, propionic acid, butyric acid, and isobutyric acid significantly decreased, while valeric acid and isovaleric acid increased in offspring of Nd₂O₃-exposed mothers (P<0.05). BTVT significantly restored levels of acetic, propionic, and isobutyric acids and reduced valeric acid content (P<0.05). EB permeability was significantly elevated in Nd₂O₃-exposed offspring brains (P<0.05), but reduced with BTVT treatment (P<0.05). RT-PCR and WB showed downregulation of occludin and ZO-1 expression following Nd₂O₃ exposure (P<0.05), which was reversed by BTVT (P<0.05). ICP-MS results indicated significantly increased brain neodymium levels in offspring from all Nd₂O₃-exposed groups (P<0.05), while BTVT significantly reduced neodymium accumulation compared to the 200 mg/(kg·d) Nd₂O₃ group (P<0.05). Conclusion Maternal exposure to Nd₂O₃ during pregnancy and lactation disrupts intestinal health and BBB integrity in offspring, elevates brain neodymium accumulation, and induces neuronal degeneration. BTVT effectively mitigates Nd₂O₃-induced intestinal and BBB damage in offspring, potentially through modulation of the gut-brain axis.

Graphical abstract

关键词

稀土元素 / 氧化钕 / 肠道菌群 / 血脑屏障 / 双歧杆菌四联活菌片

Key words

rare earth elements / neodymium oxide / gut microbiota / blood-brain barrier / bifidobacterium tetrad viable tablet

稀土元素(rare earth elements，REEs)在电子、医药、可再生能源、制造业和农业方面发挥重要作用，其开采和利用也大幅增加^[1]。随着REEs进入空气、水和土壤中，其对人类健康造成的负面影响备受关注^[2]。钕(neodymium，Nd)是一种轻REE，广泛应用于农业、畜牧业、激光材料、磁性材料等领域^[3]。人体暴露于氧化钕(neodymium oxide，Nd₂O₃)可以引起炎症反应和细胞凋亡^[4-5]，破坏血睾屏障^[6]，对肝、肺和脑组织均能造成损害^[7-9]。

肠道微生物在维持机体健康中发挥重要作用，双歧杆菌四联活菌片(bifidobacterium tetrad viable tablet，BTVT)中富含双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌等菌群，对于保持肠道菌群平衡至关重要^[10]。肠道微生物群能够通过微生物群-肠道-大脑轴与大脑相互作用，调节神经发育^[11]。血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)结构和功能的完整性对于维持大脑微环境稳态十分重要^[12]。在妊娠期及婴幼儿期，大脑发育尚不完善，因此，暴露于有害物质极有可能影响BBB的发育^[13]。BBB受损会导致具有神经毒性的物质进入大脑，引发炎症和免疫反应，最终导致神经系统病变^[14]。目前已有研究^[15]表明，多种微生物分子能够通过肠-脑轴，影响大脑的认知功能，但亲代Nd暴露是否能够通过肠道对子代BBB完整性造成影响还未可知；通过富含益生菌的BTVT共处理能否通过肠-脑轴改善肠道菌群平衡、减轻Nd₂O₃所致损害也值得深入探究。本研究旨在阐明妊娠期和哺乳期母体Nd₂O₃暴露对子代BBB的跨代毒性作用，以及BTVT的干预效果，以期为REEs Nd的神经毒性作用及肠-脑轴靶向防护策略提供证据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得包头医学院动物实验伦理委员会批准{审批号：包医动伦审[2024]5号}，相关操作均严格遵守实验动物伦理规范要求。

1.2 动物模型与分组

健康成年SD大鼠，雌雄各60只，采购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，在包头医学院实验动物中心适应性喂养1周，保持室温18~25 ℃，相对湿度45%~55%。雌雄大鼠按1꞉1的比例合笼，次日清晨检查是否出现阴栓，出现阴栓当日记为妊娠第0天。依据高磊等^{[9, 16]}的研究，在预实验中，Nd₂O₃暴露剂量为0、50、100、200 mg/(kg·d)。预实验显示：部分结果中50与100 mg/(kg·d) Nd₂O₃剂量组的毒性作用不显著，但200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组均表现出显著的毒性作用。因此选择探究该剂量下BTVT的保护效应，最终共处理组的暴露组剂量为200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+ 150 mg/(kg·d) BTVT。将60只妊娠母鼠随机分为Control组、50 mg/(kg·d) Nd₂O₃组、100 mg/(kg·d) Nd₂O₃组、200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组及200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组，分别给予10 mL/(kg·d)的0.9% NaCl溶液、50 mg/(kg·d) Nd₂O₃、100 mg/(kg·d)Nd₂O₃、 200 mg/(kg·d) Nd₂O₃及200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+ 150 mg/(kg·d)BTVT灌胃。所有组别均在妊娠期和哺乳期每日灌胃1次。在子代大鼠出生后第21天(断乳期)取其粪便、脑组织和结肠组织进行检测。

1.3 主要药品及试剂

Nd₂O₃购自美国Sigma-Aldrich公司；BTVT购自杭州远大生物制药有限公司[活菌量：双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌各0.5×10⁶/菌落形成单位(colony forming unit，CFU)，蜡样芽孢杆菌0.5×10⁵/CFU，剂量150 mg/kg]；伊文思蓝(evans blue，EB)染液购自北京沃凯生物科技有限公司；RNA提取试剂盒购自上海基屹生物科技有限公司；苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色试剂盒、二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)蛋白质定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自武汉塞维尔生物科技有限公司；occludin和闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)抗体均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；山羊抗兔IgG购自美国Signalway Antibody公司。

1.4 ICP-MS

通过电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)检测子代大鼠脑组织中Nd元素含量。称取0.2 g子代大鼠脑组织，用浓HNO₃和H₂O₂消化处理，微波消解后用2% HNO₃定容，上机检测。采用标准曲线法根据样品的峰面积计算脑中Nd的质量分数，以每kg脑组织中Nd元素的质量表示。

1.5 EB染色

给予大鼠尾静脉注射EB，1 h后麻醉大鼠，打开胸腔，剪开右心耳，从左心房缓慢注入0.9% NaCl溶液，直至右心耳流出的液体变澄清。灌注停止后，迅速分离脑组织，匀浆后取上清，在620 nm处测定吸光度值。

1.6 逆转录聚合酶链反应

取子代大鼠脑组织，使用RNA提取试剂盒提取RNA，目的基因的引物序列见表1，以β-actin作为内参基因，采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)法检测组织中occludin、ZO-1的基因表达变化。

1.7 蛋白质印迹法

采用蛋白质印迹法检测occludin、ZO-1的蛋白质表达水平。准确称取子代大鼠脑组织200 mg，加入新鲜配制的全蛋白质提取工作液，加入研磨珠后冰上匀浆，离心后取上清。经BCA蛋白质定量后，于100 ℃下金属浴使蛋白质变性。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，将其转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，用5%脱脂奶粉封闭，加入抗GAPDH、occludin和ZO-1的一抗孵育过夜，次日孵育二抗，用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)检测液将蛋白质条带可视化，采用ImageJ分析蛋白质的相对表达量。

1.8 HE染色

分离子代大鼠结肠段组织和脑组织，用固定液固定24 h后进行乙醇梯度脱水、二甲苯透化、石蜡包埋处理，将组织切成5 µm的切片，脱蜡，再水化后行HE染色。封片后在光学显微镜下观察子代大鼠肠黏膜屏障的改变及皮质神经细胞形态和数量的变化。

1.9 GC-MS

取子代大鼠粪便，用饱和NaCl溶液充分溶解，硫酸进行酸化，乙醚萃取，涡旋离心后取上清液。通过气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)对粪便中的短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸进行定量。

1.10 统计学处理

采用统计学软件SPSS 25.0进行数据处理与分析。计量资料以均数±标准差表示，两样本比较采用独立样本t检验；多样本比较采用单因素方差分析，采用最小显著差异法(least significant difference，LSD)或Dunnett’s t检验进行事后多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 亲代Nd₂O₃暴露可导致子代大鼠肠道损伤

HE染色结果(图1)显示：Control组子代大鼠结肠组织结构基本正常，黏膜层上皮细胞排列整齐，组织内未见明显的炎症细胞浸润；随着亲代母鼠Nd₂O₃暴露剂量的升高，子代大鼠结肠组织开始出现异常改变，表现为黏膜下间隙增大、水肿，并伴有淋巴细胞等炎症细胞浸润；与BTVT共处理后，子代大鼠肠黏膜结构接近正常，炎症细胞浸润的现象得到改善。

GC-MS结果(图2)显示：与Control组相比，亲代母鼠各剂量的Nd₂O₃暴露均可显著降低子代大鼠肠道内乙酸和丁酸的水平(均P<0.05)；100、200 mg/(kg·d)的Nd₂O₃暴露可显著升高戊酸水平，并显著降低异丁酸水平(均P<0.05)；200 mg/(kg·d)的Nd₂O₃暴露可显著降低丙酸水平(P<0.05)；与200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组相比，200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组乙酸、丙酸、异丁酸水平均显著升高(均P<0.05)，戊酸水平显著降低 (P<0.05)，丁酸和异戊酸水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.2 亲代Nd₂O₃暴露可导致子代大鼠BBB通透性改变

EB染色结果(图3A)显示：与Control组相比，亲代母鼠各剂量的Nd₂O₃暴露均可显著增加子代大鼠脑组织内EB渗透量(均P<0.05)，且EB渗透量随Nd₂O₃暴露浓度的增加而增加；与200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组相比，200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组子代大鼠脑组织内EB渗透量显著减少(P<0.05)。

RT-PCR结果(图3B、3C)显示：与Control组相比，100、200 mg/(kg·d)的Nd₂O₃暴露均可显著降低occludin和ZO-1基因表达水平(均P<0.05)，50 mg/(kg·d)的Nd₂O₃暴露仅可显著降低ZO-1基因表达水平(均P<0.05)；与200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组相比，200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组子代大鼠脑组织内occludin和ZO-1的基因表达均显著升高(均P<0.05)。

蛋白质印迹法结果(图3D、3E)显示：与Control组相比，100、200 mg/(kg·d)的Nd₂O₃暴露均可显著降低occludin蛋白的表达水平(均P<0.05)，仅200 mg/(kg·d)的Nd₂O₃暴露可显著降低ZO-1蛋白的表达水平(P<0.05)；与200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组相比，200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组子代大鼠脑组织内occludin和ZO-1蛋白的表达水平均显著升高(均P<0.05)。

2.3 亲代Nd₂O₃暴露可导致子代大鼠脑组织损伤

HE染色结果(图4)显示：Control组子代大鼠大脑皮质内神经细胞基本正常，排列整齐，核形态正常；而暴露于Nd₂O₃后，脑组织出现空泡，神经元大量变性；BTVT共处理后，神经元变性得到缓解。

ICP-MS结果(图5)显示：与Control组相比，亲代母鼠各剂量的Nd₂O₃暴露均可显著增加子代大鼠脑组织内Nd含量(均P<0.05)，且Nd含量随Nd₂O₃暴露浓度的增加而增加；而200 mg/(kg·d) Nd₂O₃+BTVT组Nd含量显著低于200 mg/(kg·d) Nd₂O₃组 (P<0.05)。

3 讨 论

BBB在调控大脑各种物质的流入和流出中发挥重要作用，其结构和功能的完整性对于维持大脑微环境稳态至关重要^[12]。然而，在妊娠期及婴幼儿期，子代的BBB尚未发育完善，此时受到外界有害物质的刺激，极有可能影响神经发育，造成大脑损伤^[17]。本研究中，亲代大鼠暴露于Nd₂O₃后，子代大鼠的肠黏膜屏障受损，粪便中SCFAs含量明显改变。HE染色结果同样表明：亲代大鼠Nd₂O₃暴露可引起子代大鼠神经元损伤，且ICP-MS结果表明子代大鼠脑组织Nd蓄积量与亲代大鼠Nd₂O₃暴露剂量呈正相关；而BTVT联合干预能减轻子代大鼠肠黏膜损伤，并可能借助肠-脑轴改善BBB的完整性，表现为脑组织中的紧密连接蛋白occludin和ZO-1基因和蛋白质表达水平均上升，且神经元损伤减轻及脑中Nd蓄积减少。

肠道菌群可以通过对碳水化合物和膳食纤维的发酵，产生SCFAs。这些代谢产物在维持肠道健康，修复肠细胞上皮屏障，保护其免受病原体侵害中发挥重要作用^[18]。SCFAs还可以募集白细胞到炎症部位，通过调控G蛋白偶联受体促进T细胞向调节性T细胞分化，调节小胶质细胞的成熟^[19]。小胶质细胞会参与中枢神经系统的免疫防御，因此SCFAs对Nd₂O₃所致的神经毒性具有一定的抑制作用。随着亲代大鼠Nd₂O₃的暴露，子代大鼠肠黏膜受损，黏膜下间隙增大，炎症细胞浸润；SCFAs含量改变，其中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸的含量均降低；而BTVT共处理后能够改善肠道中SCFAs含量的变化。这表明加入BTVT能够有效调节子代大鼠的肠道菌群。

肠-脑轴作为肠道与大脑双向交流的通道，对维持机体健康尤为重要。一方面，大脑通过影响消化道的蠕动、分泌和免疫，影响肠道微生物群的组成和功能；另一方面，肠道微生物群对大脑和肠道神经系统的发育和功能也起着至关重要的作用^[20-21]。肠道微生物可以通过神经系统、内分泌系统、免疫系统和代谢通路等途径影响大脑功能^[22-23]。有害物质暴露后，可能造成肠道菌群失衡，肠上皮细胞失去其正常功能、肠黏膜受损，引发炎症状态及异常免疫反应，导致营养吸收障碍和毒素异常吸收，肠内异常信号可以通过多种途径传递至大脑，从而影响中枢神经系统的调控，进一步加剧胃肠功能紊乱^[24]。已有研究^[25-26]结果表明维持肠道微生物的正常功能对大脑健康至关重要。

综上，亲代大鼠Nd₂O₃暴露可导致子代大鼠出现多系统损伤：脑组织Nd蓄积和BBB受损，肠黏膜结构破坏伴肠道菌群失衡，且SCFAs含量改变。这表明肠-脑之间的联系可能会加重Nd₂O₃的毒性作用。值得注意的是，BTVT能够调节肠道菌群，并可能通过肠-脑轴的连接对维持BBB的完整性起积极作用。尽管研究明确了Nd₂O₃经肠道途径影响子代BBB的机制及BTVT的保护效应，但关于Nd₂O₃对子代神经系统的长期毒性作用仍需通过后续研究进一步探索。

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基金资助

国家自然科学基金(82260650)

国家自然科学基金(82160624)

内蒙古自治区自然科学基金(2023MS08025)

内蒙古自治区医疗卫生健康科技计划项目(202201369)

包头医学院“大学生创新创业训练计划项目”(202410130004)

包头医学院“花蕾计划”项目(HLJH202431)

包头医学院“花蕾计划”项目(82160624)

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